Содержание к диссертации
С.
Список принятых сокращений 5
Введение 7
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
Введение 11
Комплексы рецепторов TCR и BCR 12
Комплексы белков CD4 и CD45 13
Белок LP АР и его комплексы 18
Белок CD10 и его комплексы 23
Комплексы тетраспанинов 24
Липидные микродомены 29
Протеомика белковых комплексов 37
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы 44
Клетки и их источники 44
Антитела 44
Растворы, использованные в работе 45
Прочие реагенты и материалы, используемые в работе 46
2.2. Методы 47
Мечение флуоресцентными красителями 47
Электрофорез 47
Двумерный гельэлектрофорез 48
Цитофлуориметрический тест 48
Проточная цитометрия 48
Хлорофор-этанольная экстракция белков 49
Концентрирование белков на микроконах 49
Приготовление клеточного лизата 49
Иммунопреципитация 50
Иммуноблоттинг 51
Протеолиз белков в геле после электрофореза 51
Масс-спектрометрический анализ белков 52
Идентификация белков по танденмным масс-спектрам 52
Трансфекция 52
Выделение рафтов методом гель фильтрации с предварительным окрашиванием флуоресцентномечеными антителами 53
2.2.16. Обработка результатов экспериментов 54
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 55
Разработка метода, позволяющего совместить флуоресцентную иммунопреципитацию и иммуноблот 55
Использование флуоресцентного мечения белков при иммуноаффинном выделении антигенов 60
Межмолекулярные комплексы белка CD4 на клетках СЕМ 61
Ассоциация белка CD4 с различными изоформами CD45 на клетках СЕМ 62
Ассоциация белка CD4 с различными изоформами CD45 на лимфоцитах периферической крови 67
Межмолекулярные комплексы белка CD4 по данным масс-спектрометрии 70
Участие молекулы CD71 в образовании комплекса молекулы CD4 74
Масс-спектрометрия межмолекулярного комплекса белка CD45 77
Взаимодействие белков CD4 и CD45 при котрансфекции 78
Биохимическая реконструкция комплекса молекулы CD4 82
Межмолекулярные комплексы тетраспанинов 84
3.12. Протеомное изучение липидных рафтов 87
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 98
Флуоресцентная иммунопреципитация — общая платформа для наиболее используемых протеомных методов исследования 98
Комплексы молекулы CD4 100
Масс-спектрометрическая идентификация компонентов комплексов 102
Тетраспаниновые комплексы 103
4.5. Липидные рафты 106
Выводы ПО
Список цитируемой литературы 112
Список принятых сокращений
МкАт - моноклональное антитело ПААГ — полиакриламидный гель
ФИПА - флуоресцентный иммунопреципитационный анализ ДРМ - детергент резистентные мембраны BCR — В-клето'чный рецептор BSA — бычий сывороточный альбумин CD - кластер дифференцировки Co-IP - коиммунопреципитация DMSO - диметилсульфоксид FITC - флуоресцеин-5-изотиоцианат
FRET - метод флуоресцентного резонансного переноса энергии FSC - малое угловое светорассеяние Ig - иммуноглобулин IP - иммунопреципитация
LC-ESI-MS/MS — тандемная масс-спектрометрия с электроспрей ионизацией с предварительным разделением пептидов методом жидкостной хроматографии LP АР - лимфоцитарный-фосфатаза-ассоциированный фосфопротеин МНС — главный комплекс гистосовместимости MS - масс-спектрометрия MS/MS — тандемная масс-спектрометрия PBL — периферические лимфоциты крови PBS — фосфатно-солевой буфер PMSF - фенилметилсульфонилфторид RIPA - радио иммунопреципитационный анализ
slgM - поверхностный иммуноглобулин М
SDS — додецилсульфат натрия
SSC - боковое светорассеяние
TCR/CD3 - Т- клеточный рецептор
ТХ-100 - неионный детергент тритон Х-100
WB — метод вестернблот анализа
СТ - р субъединица холерного токсина
Введение к работе
Актуальность темы диссертации
После завершения проекта по расшифровке генома человека внимание молекулярных биологов стало все более смещаться в сторону изучения функциональных характеристик белков. Для понимания молекулярного механизма функционирования конкретного белка необходимо знать не только его структуру, но и возможные белок-белковые взаимодействия в которые вступает данный протеин. В современных исследованиях при изучении нового белка вслед за первым вопросом о его структуре, как правило, следует второй вопрос о том, с чем данный белок связывается. Белковые комплексы играют важную роль в транскрипции, делении клеток, онкогенной трансформации и многих других жизненно необходимых клеточных процессах.
Важное значение белковые комплексы имеют и для иммунологии. Многие иммунные процессы регулируются или осуществляются с участием белковых комплексов. Большинство мембранных рецепторов по своему строению являются мультипротеиновыми комплексами, состоящими из нескольких белков. Другие иммунологически значимые молекулы, такие как цитоплазматические сигнальные белки, а также ядерные факторы транскрипции при вьшолнении своих функций образуют временные белковые комплексы со своими партнерами.
По различным оценкам от 15 до 20 % генов кодируют белки, локализованные на мембране. Если учесть, что многие мембранные белки являются рецепторами, то изучение комплексов мембранных белков приобретает особую значимость. К настоящему времени накоплен значительный материал по изучению комплексов цитозольных белков, в то же время комплексы мембранных белков исследованы значительно в меньшей степени. Это связано с методическими трудностями в выделении мембранных белков. Работа с
очищенными мембранными белками затрудняется вследствие их высокой гидрофобности, а также необходимости дополнительного связывания с липидами. Для более глубокого изучения мембранных комплексов имеется настоятельная потребность в совершенствовании существующих методов исследования.
В силу сложившихся методических приемов основная часть современных работ, касающихся межмолекулярных комплексов, ограничивается изучением парных ассоциаций между отдельными молекулами, входящими в состав комплекса. Общая картина строения всего комплекса в целом, как правило, строится из разрозненных данных по отдельным парным ассоциациям. В последнее время благодаря развитию протеомного подхода стало возможным изучение не только парных ассоциаций, но и всего комплекса в целом.
Можно надеяться, что идентификация и характеристика мембранных белковых комплексов лимфоцитов человека позволит лучше понять молекулярные основы иммунных процессов, а также даст дополнительную информацию, которая необходима для направленной разработки новых фармакологических препаратов, влияющих на иммунный ответ. Таким образом, поиск и разработка новых подходов для идентификации и характеристики белковых комплексов, а также систематическое изучение межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека является актуальной задачей.
Цель работы
Целью данной работы являлось изучение структуры и состава межмолекулярных комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека на трех уровнях: сравнительно простые комплексы образованные молекулой CD4, более сложно устроенные комплексы тетраспаниновых микродоменов, и, наконец, большие липидно-белковые комплексы, занимающие обширные мембранные области и которые называются липидными рафтами.
Задачи исследования
Развитие методической базы протеомного исследования комплексов мембранных белков. Изучение совместимости флуоресцентного иммунопреципитационного анализа с последующим иммуноблотом.
Определение изоформ белка CD45 образующих межмолекулярный комплекс с молекулой CD4.
Протеомная характеристика белков, ассоциированных с тетраспанинами CD9 и CD81.
Разработать новый метод детекции рафтовых антигенов и изучить с его помощью траслокации в липидные рафты некоторых мембранных белков.
Научная новизна
В настоящей работе впервые продемонстрирована возможность совмещения флуоресцентной иммунопреципитации с последующим иммуноблотом, таким образом результаты иммунопреципитации и иммуноблота считываются с одного и того же геля. Таким образом, разработанная методика позволяет комбинировать между собой качественные данные, полученные с помощью иммуноблота, с количественными данными, получаемыми методом флуоресцентной иммунопреципитации.
Впервые показано, что на периферических лимфоцитах крови человека молекула CD4 образует межмолекулярный белковый комплекс преимущественно с низмолекулярной изоформой белка CD45, а именно с CD45R0.
Впервые в качестве компонента белкового комплекса тетраспанинов CD9 и CD81 идентифицирована металлопротеаза CD 10.
Теоретическая и практическая значимость работы
Настоящая работа выполнена в рамках фундаментальных исследований. Научная
значимость настоящего исследования заключается в расширении представлений о
строении комплексов мембранных рецепторов лимфоцитов человека. Полученные данные позволяют глубже понять механизмы взаимодействия мембранных белков, и могут быть использованы при направленной разработке новых иммунотерапевтических препаратов. Основные положения, выносимые на защиту
Метод флуоресцентной иммунопреципитации совместим с последующим анализом с помощью иммуноблота.
Флуоресцентный иммунопреципитационный анализ позволяет вести пробоподготовку общую для нескольких методов и совместить в одном эксперименте иммунопреципитацию, иммуноаффинное выделение, иммуноблот и масс-спектрометрию.
Молекула CD4 образует межмолекулярный комплекс только с низкомолекулярной изоформой белка CD45, а именно CD45R0.
Белки CD4 и CD45 не могут напрямую взаимодействовать между собой, и для образования между ними белкового комплекса необходимы вспомогательные молекулы.
Цинкзависимая протеаза CD 10 образуют межмолекулярный комплекс с тетраспанинами CD9 и CD81.
Публикации
Результаты исследований были представлены на международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, июнь 2005), на 31-ом конгрессе «FEBS» (Стамбул, Турция, июнь 2006), на VIII конгрессе РААКИ «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, июнь 2007), на III российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, сентябрь 2007). Материалы диссертации изложены в 10 публикациях.
