Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Естественные аутоантитела
1.2. Тиреоглобулин как аутоантиген
1.3. Аутоантитела против тиреоглобулина
1.4. Аутоиммунные заболевания щитовидной железы. Роль аутоАТ против Тг
1.5. Моноклональные антитела против тиреоглобулина
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Животные и методы работы с ними
2.2. Антигены
2.3. Антитела и антисыворотки
2.4. Методы твердофазного иммуноферментного анализа
2.4.1. Изотипирование AT
2.4.2. Исследование взаимодействия AT с Тг
2.4.3. Определение эпитопной специфичности AT
2.4.4. Исследование перекрестной реактивности AT с ТЗ, Т4, тиреоидной пероксидазой, ацетилхолинэстеразой, кардиомиозином и инсулином
2.4.5. Исследование концентрации общего тироксина
2.5. Гистологическое и иммуногистохимическое исследования
2.6. Получение гибридомных клеток-продуцентов МКАТ против Тг мыши
2.7. Прививка гибридомных клеток мышам
2.8. Замораживание и размораживание гибридомных клеток
2.9. Выделение и конъюгация МКАТ
2.10. Определение концентрации МКАТ
2.11. Методы статистического анализа
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Создание панели МКАТ, распознающих Тг мыши, и изучение их свойств
3.1.1. Получение и первичная характеристика МКАТ
3.1.2. Изучение свойств МКАТ, распознающих эпитопы Тг мыши
3.1.2.1. Качественная оценка аффинитета МКАТ
3.1.2.2. Взаимодействие МКАТ с Тг животных других видов
3.1.2.3. Эпитопная специфичность МКАТ
3.2. Сопоставление свойств полученных МКАТ и ЕАА мышей
3.2.1. Изучение эпитопной специфичности аутоАТ против Тг интактных мышей линий SJL/j, СВА и BALB/c
3.2.2. Взаимодействие МКАТ против Тг с другими антигенами
3.3. Изучение влияния введения аутоАТ против Тг на тиреоидный статус мышей
3.3.1. Изучение тиреоидного статуса у интактных мышей линий SJL/j и СВА
3.3.2. Изучение влияния различных схем введения МКАТ, распознающих Тг мыши, на тиреоидный статус мышей
3.3.3. Изучение влияния введения МКАТ, распознающих Тг мыши, на тиреоидный статус мышей линии SJL/j
3.3.4. Изучение влияния введения МКАТ, распознающих Тг мыши, на тиреоидный статус мышей линии СВА
3.4. Изучение влияния введения аутоАТ и Тг на тиреоидный статус мышей
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
Введение к работе
Актуальность проблемы Антитела, которые выявляют во взрослом организме при очевидном отсутствии иммунизирующих стимулов, а также у новорожденных и у стерильных животных, называют естественными [Avrameas, 1991]. Они способны реагировать со многими чужеродными антигенами, что дало повод обозначать их как полиреактивные [Notkins, 2004]. Эти антитела также взаимодействуют с аутоантигснами, поэтому их называют естественными аутоантителами (ЕАА) [Avrameas, Ternynk, 1995]. Репертуар ЕАА формируется на ранних этапах онтогенеза и остается стабильным в течение жизни индивида [Merbl et al., 2007]. Большая часть ЕАА кодируется V генами зародышевой линии, относится преимущественно к IgM и обладает низкой (Kj 104-107 mol/1) аффинностью [Coutinho, Kazatchkine, 1995]. Четко установленным различием между ЕАА и монореактивными антителами, выявляемыми при иммунизации и при патологических состояниях, является их эпитопная специфичность [Stahl et al., 2000; Zhou et al., 2007].
ЕАА распознают главным образом эволюционно консервативные антигенные детерминанты [Bouvet, Dighiero, 1998].
Роль ЕАА в организме остается недостаточно изученной. Показано, что с ними связана бактерицидная активность сыворотки крови, что они участвуют в реакциях нейтрализации, опсонизации и активации системы комплемента [Zhou et al., 2007].
Поэтому предполагают, что ЕАА являются одним из компонентов первой линии защиты от инфекций. Возможно, они принимают участие в поддержании естественной толерантности [Boes et al., 1998; Ehrenstein et al., 2000; Reitan ct al., 2002].
К числу аутоантигенов, с которыми реагируют ЕАА в норме и при патологии, относится тиреоглобулин (Тг). В крови здоровых людей и животных обнаруживают значимые количества ЕАА против Тг. При развитии аутоиммунного тиреоидита их содержание по сравнению с нормой возрастает в десятки раз [Gentile et al., 2004], а репертуар распознаваемых эпитопов сужается [Caturegli et al., 1994]. На молекуле Тг выявлено около 40 антигенных детерминант [Ruf et al., 1987], степень вовлечения которых в продукцию ЕАА и во взаимодействия с ними может быть различной.
Данные о биологической активности антител против Тг ограничены. В большей части исследований были использованы выделенные из сыворотки поликлональные антитела. Введение таких препаратов экспериментальным животным не дало однозначных результатов [Vladutiu, Rose, 1971; Inoue et al., 1993; Tomer et al., 1997]. В работах по получению гибридом из клеток неиммунизированных взрослых или новорожденных мышей [Dighiero et al., 1983; Ternynck, Avrameas, 1986] свойства EAA против Тг не исследованы. Моноклональные антитела (МКАТ) способны распознавать отдельные эпитопы молекул антигенов. Это дает возможность выявить те детерминанты Тг, которые взаимодействуют с ЕАА, а также оценить влияние ЕАА с разной эпитопной специфичностью на функции щитовидной железы.
Цель и задачи исследования Цель исследования состояла в получении моноклональных вариантов ЕАА против Тг, изучении их свойств и возможной роли в развитии нарушений тиреоидного статуса у мышей.
Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:
1. Создать панель МКАТ, распознающих Тг мыши.
2. Исследовать эпитопную специфичность и перекрестную реактивность полученных МКАТ.
3. Сравнить свойства МКАТ и ЕАА, присутствующих в сыворотке интактных мышей.
4. Изучить влияние МКАТ с различной эпитопной специфичностью на тиреоидный статус мышей.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Получена панель МКАТ, распознающих 19 эпитопов на молекуле Тг мыши.
2. На основании данных об эпитопной специфичности и перекрестной реактивности среди полученных МКАТ отобраны реагенты, которые представляют собой моноклональные варианты ЕАА.
3. Введение МКАТ, обладающих свойствами ЕАА, вызывает у мышей изменения структуры и функции щитовидной железы.
4. Иммунизация мышей Тг на фоне введения МКАТ, связывающих некоторые эпитопы Тг, вызывает развитие лимфоцитарной инфильтрации щитовидной железы.
Научная новизна работы
1. Создана наиболее широкая из описанных в литературе панелей МКАТ, распознающих эволюционно консервативные эпитопы Тг мыши.
2. Впервые установлено, что репертуар эпитопов Тг, распознаваемых ЕАА интактных инбредных мышей, варьирует индивидуально и не коррелирует с генетически обусловленной восприимчивостью животных к индукции аутоиммунного тиреоидита.
3. Впервые показано, что введение моноклональных ЕАА, распознающих некоторые эпитопы Тг мыши, вызывает нарушения синтеза тиреоидных гормонов и структуры ткани щитовидной железы.
Теоретическая и практическая значимость работы Работа направлена на решение фундаментальной проблемы иммунологии - расшифровку механизмов, участвующих в нарушении иммунологической толерантности при развитии аутоиммунных заболеваний. В результате исследования созданы МКАТ, представляющие собой моноклональные варианты ЕАА. Полученные реагенты открывают новые возможности для изучения репертуара ЕАА против Тг и антигенной структуры Тг животных различных видов.
Данные о влиянии моноклональных вариантов ЕАА на тиреоидный статус мышей согласуются с гипотезой, что ЕАА могут участвовать в развитии аутоиммунных патологических процессов. Полученные МКАТ могут быть использованы при разработке новых экспериментальных моделей аутоиммунного тиреоидита.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (гранты 99-04-49823, 01-04-49781 и 05-04-48862).
Личный вклад автора в проведение исследований Основные данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором проведены все экспериментальные исследования на животных, изучен их тиреоидный статус и свойства ЕАА. Получение МКАТ и изучение их свойств осуществлялось совместно с группой сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий МЗСР РФ. Автором выполнены все этапы создания гибридом, получения МКАТ, изучения их свойств. Обработка результатов экспериментов и подготовка публикаций сделаны автором диссертации совместно с научным руководителем. При оценке гистологического материала автор пользовался консультативной помощью сотрудников лаборатории иммуногистохимии, группы патоморфологии с прозектурой ФГУ Российского научного центра радиологии и хирургических технологий МЗСР РФ и кафедры цитологии и гистологии Санкт-Петербургского государственного университета.
Апробация работы Результаты работы были представлены на XII Международном Совещании по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2001), Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2002), Всероссийских форумах "Дни иммунологии в СанктПетербурге" (Санкт-Петербург, 1999, 2002, 2003, 2005, 2006), Международной научнопрактической школе-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" (СанктПетербург, 2002), 6-ой и 7-ой Школах Джона Хамфри по иммунологии (Пущино, 2002; Москва, 2005), 5-ом Конгрессе "Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии" (Москва, 2002), научно-практической конференции "Современные технологии в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2003), II и III съездах иммунологов России (Сочи, 1999; Екатеринбург, 2004), научной конференции "От лучей Рентгена - к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института" (Санкт-Петербург, 2008).
Публикации Материалы диссертации отражены в 6 статьях и 21 тезисах.
Объем и структура диссертации Диссертационная работа состоит из введения; обзора литературы; экспериментальной части, включающей методы и результаты исследования; обсуждения; выводов; списка литературы, состоящего из 281 источника; приложения. Работа изложена на 127 страницах и содержит 29 рисунков и 19 таблиц.
