Введение к работе
Актуальность проблемы.
В последние десятилетия в литературе описано достаточно много данных о побочных реакциях, вызванных применением корпускулярной коклюшной вакцины (Ross Е. М., 1988). В связи с этим для снижения её реактогенности был поставлен вопрос о создании бесклеточного препарата, максимально освобожденного от биологически активного материала бактериальной клетки, вызывающего нежелательные проявления.
В последнее время работа по усовершенствованию бесклеточных коклюшных вакцин ведется в русле поиска и получения антигенов, обладающих наибольшей протективной активностью, но лишенных токсических свойств. Мнения о защитных свойствах антигенов В. pertussis различаются, однако, принято считать, что основными протективными антигенами являются коклюшный токсин (Sato Y., 1974), филаментозный гемагглютинин (Kimura А., 1990), агглютиногены 2 и 3 (Robinson А., 1988) и белок 69 кДа (Novotny Р., 1990).
Так, разработанные и прошедшие клинические испытания бесклеточные коклюшные вакцины (например, "Takeda", введенная в Японии с 1981 г., включающая в свой состав ФГА, КТ и Агг 2 в соотношении 90:10:1, вакцина "CAMR" - ФГА:КТ:Агг 2+3 (1:1:1), "Biken", "Merieeux" и "Connaught" - ФГА и КТ (1:1, 1:1 и 1:6) и однокомпонентные, включающие детоксицированный КТ, ("Sekura" и "Biken")), а также лицензированные в 1996 г. КДС-вакцины "Tripedia" (КТ : ФГА -1:1) и "Acel-lmune" (ФГА:КТ:Р69:Агг2 -11:4:2:1) проявили достаточную защитную эффективность и оказались менее реактогенными по сравнению с цельноклеточной вакциной (Robinson А„ 1988).
Для изучения протективных свойств антигенов В. pertussis и их детерминант особо перспективным представляется использование моноклональных антител (МкАт). Так, в программе ВОЗ (Женева, 1983) по разработке новых вакцин один из пунктов включает определение антигенных детерминант, ответственных за формирование реакций иммунитета, а для выявления этих детерминант рекомендуется разрабатывать иммунохимические тесты прежде всего на основе использования МкАт.
В работе по повышению качества коклюшного компонента в АКДС-вакцине целый ряд проблем связан с его стандартизацией. Результаты многолетних исследований, проводимых в нашей стране и за рубежом, свидетельствуют о недостаточной стандартности используемых лабораторных методов оценки качества коклюшного компонента, обусловленной вариабельностью качества животных, взятых в опыт в разное время года, использованием тест-штаммов, питательных сред и другими факторами. Поэтому актуальной на настоящий момент остается проблема разработки и стандартизации методов доклинической оценки качества коклюшной вакцины (остаточной токсичности, антигенной чистоты, сохранности, качественной и количественной оценки протективных эпитопов). Цель исследования.
Изучение иммунохимических свойств и оценка качественных и количественных характеристик антигенных субстанций коклюшного микроба в бесклеточных вакцинных препаратах на основе использования моноклональных антител. Забачи исследования:
-
Отобрать из имеющихся гибридных клонов продуценты антител к основным антигенам В. pertussis.
-
Пополнить коллекцию имеющихся гибридов вновь полученными гибридными клонами, синтезирующими МкАт с требуемой тонкой специфичностью.
-
Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства МкАт.
-
Оценить пригодность полученных МкАт для создания методов качественной и количественной характеристики антигенных структур Bordetella pertussis в бесклеточных вакцинных препаратах.
Научная новизна.
-
Создана панель гибридом, синтезирующих МкАт к основным антигенам В. pertussis (КТ, ФГА, ЛПС и белкам наружной мембраны с молекулярной массой 92 кДа. 69 кДа и 65 кДа).
-
Предполагается участие S1 субъединицы в связывании КТ с рецептором, на что указывает нейтрализация гемагглютинирующего действия коклюшного токсина МкАт 1D5A3 к S1 КТ.
-
Впервые обнаружена нейтрализующая активность МкАт G3G9 к S5 субъединице коклюшного токсина в СНО-тесте.
-
С помощью МкАт B2G7 частично охарактеризован 65-кДа антиген. Выяснено, что данный антиген является поверхностным мономерным белком вирулентных, так и авирулентных бактерий, выявляется в иммуноблоттинге УЗ-дезин-теграта В. pertussis и в среде культивирования бактерий штаммов 305 и 475.
Теоретическая и практическая значииость.
Моноклональные антитела, полученные к 6 различным антигенным структурам Bordetella pertussis и разработанные на их основе системы анализов, позволяющие количественно определять КТ и ЛПС и выявлять ФГА и 92, 69 и 65-кДа ОМР, могут служить инструментом дпя изучения структурно-функциональных характеристик антигенов возбудителя коклюша. В данной работе МкАт использовались для выявления соответствующих антигенов в вакцинных препаратах на разных этапах их приготовления: до детоксикации, после детоксикации, а также в сорбированных на гидроксиде алюминия препаратах на предмет прочности связывания материала с носителем. Кроме того, подобные методы могут найти свое применение для контроля за процессом культивирования микроорганизма, выяснения влияния различных ростовых сред и добавок на накопление антигенных компонентов и их состав, а также для диагностических целей. Основные положения, выносимые на защиту.
-
Создана панель гибридом, синтезирующих МкАт к основным антигенам В. pertussis (КТ, ФГА, ЛПС и белкам наружной мембраны (ОМР) с молекулярной массой 92 кДа, 69 кДа и 65 кДа).
-
Разработаны варианты ИФА, позволяющие в недетоксицированных вакцинных препаратах количественно определять КТ с чувствительностью 0,2 нг/мл, (что превосходит показатели описанных аналогичных систем), ЛПС с чувствительностью 10 нг/мл и выявлять ФГА и 92, 69 и 65-кДа ОМР в иммуноблоттинге. ИФА-вариант, использующий полимиксин, позволяет измерять содержание ЛПС в детоксицированных препаратах.
Апробация работы.
Материалы диссертации были представлены на конференции молодых ученых
НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова (Москва, 1994); на международном
симпозиуме, посвященном 150-летию со дня рождения И. И. Мечникоза (Уфа, 1995) на заседании секции микробиологии и прикладной эпидемиологии Московского отделения Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов им. И. И. Мечникова. (Москва, 1997).
Диссертация апробирована на научной конференции отдела иммунодиагностики НИИ вакцин и сывороток им. И. И. Мечникова РАМН. Структура диссертации.
Диссертация изложена на_)00_страницах машинописного текста и состоит
из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований,
обсуждения, выводов, списка литературы, включающего 8 отечественных и 186
зарубежных источников. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 10 таблицами.
