Содержание к диссертации
стр.
Введение 8
Глава 1. Обзор литературы 17
1. Иммунотропные препараты и их характеристика 17
Иммунотерапия и иммунотропные препараты 20
Определение иммунотерапии 21
1.3. Виды иммунотропных воздействий 22
1.4 Классификация иммунотропных препаратов 24
1.5. Характеристика иммунотропных препаратов группы тимические
факторы 32
Биологические гормоноподобные тимические факторы 33
Синтетические тимомиметики 38
Синтетические гормоноподобные тимические факторы 39
2. Механизм действия "Бестима" в норме и при патологии 43
2.1 .Характеристика препарата 43
Экспериментальное действие "Бестима" на иммунокомпетентные клетки животных 44
Клиническое применение "Бестима" 48
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1 .Иммунологические методы 53
2.1.1. Забор исследуемого материала и выделение клеток из
крови 54
Количественное определение субпопуляций лимфоцитов с помощью моноклональных антител 56
Определение лизосомальной активности нейтрофилов и моноцитов крови 58
Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови с помощью НСТ-теста 59
Метод исследования фагоцитарной активности нейтрофилов
крови 61
2.1.6. Метод количественного определения уровня иммуноглобулинов в
сыворотке крови 62
2.1.7. Оценка концентрации циркулирующих иммунных комплексов
(ЦИК) 62
Определение общей гемолитической активности комплемента (СН 50) и уровня компонентов комплемента: С1, С2, СЗ, С4, С5 63
Индукция цитокинов мононуклеарами периферической крови и постановка реакции бластной трансформации лимфоцитов in vitro 66
2.1.10. Оценка реакции бластной трансформации лимфоцитов
морфологическим методом 68
2.1.12. Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции
цитокина ИНФу в супернатантах методом иммуноферментного
анализа 69
Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокина ИЛ4 в супернатантах методом иммуноферментного анализа 70
Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокина ИЛір в супернатантах методом иммуноферментного анализа 71
Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокина ИЛ8 в супернатантах методом иммуноферментного анализа 72
2.1.15. Определение спонтанной и митоген-индуцированной продукции цитокина ИЛ 10 в супернатантах методом иммуноферментного
анализа 72
2.1.16. Расчетные коэффициенты оценки цитокинов 73
2.1.17. Оценка миграционной активности нейтрофилов на
хемоаттрактанты с учетом активности неспецифических эстераз и
иммуноморфологии нейтрофилов 75
Приготовление агарозного геля для проведения хемотаксиса нейтрофилов 75
Приготовление градиента плотности фиколл-урографина 76
Выделение лейкоцитов крови 77
Оценка локомоторной функции нейтрофилов 78
/
Выявление активности неспецифических эстераз методом одновременного азосочетания по Пирсу (в модификации лаборатории неспецифического иммунитета института Иммунологи МЗ СССР, 1986) 78
Иммуноморфологическое исследование фагоцитов в зоне хемотаксического ответа 80
2.2. Методы изучения активности иммунокомпетентных клеток в
эксперименте у мышей 81
2.2.1. Морфометрические методы 81
Методы оценки фагоцитарной функции клеток перитонеального экссудата мышей в эксперименте 82
Определение лизосомальной активности нейтрофилов
крови 82
Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов перитонеального экссудата мышей с помощью НСТ-теста 83
Метод исследования фагоцитарной активности нейтрофилов
перитонеального экссудата мышей в эксперименте 85
2.1. Статистические методы исследования 86
Глава 3. Выбор оптимальной дозы "Бестима" по результатам
исследования хемотаксической активности фагоцитов in vitro 87
Глава 4. Изучение влияния "Бестима" на активность фагоцитарных клеток интактных животных и при развитии стафилококковой
инфекции in vivo 94
Глава 5. Изучение действия "Бестима" на различные субпопуляции
клеток in vitro 112
Глава 6. Влияние иммуномодулятора "Бестим" на спонтанную и индуцированную продукцию цитокинов ИНФу, ИЛІр, ИЛ4, ИЛ8, ИЛ 10 иммунокомпетентными клетками крови условно-здоровых
лиц 121
Заключение 137
Выводы 153
Практические рекомендации 154
Список литературы 155
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ПРИНЯТЫХ В ДИССЕРТАЦИИ
Ig А, М, G - иммуноглобулины А, М, G ФГА- фитогемагглютинин ЛПС - липополисахарид Е. coli Th - Т-хелперы ИЛ1р - интерлейкин 1 (3 ИЛ4 - интелейкин 4 ИЛ8 - интелейкин 8 ИЛ 10 - интерлейкин 10 ИНФу - интерферрон у
МІЖ - мононуклеары периферической крови Мф - макрофаги НСТ - нитро-синий тетразоль АФН - активность фагоцитоза нейтрофилов ИФН - интенсивность фагоцитоза нейтрофилов ФЧН - фагоцитарное число нейтрофилов
Спон. АНСТН - спонтанная активность нейтрофилов в НСТ-тесте Спон. ИНСТН - спонтанная интенсивность нейтрофилов в НСТ-тесте Инд. АНСТН - индуцированная активность нейтрофилов в НСТ-тесте Инд. ИНСТН - индуцированная интенсивность нетрофилов в НСТ-тесте
ЛАН - лизосомальная активность нейтрофилов АФМ - активность фагоцитоза моноцитов ИФМ - интенсивность фагоцитоза моноцитов ФЧМ - фагоцитарное число моноцитов ЛАМ- лизосомальная активность моноцитов CD - clusters of differentiation
ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы
СН 50 - общая гемолитическая активность комплемента
С1, С2, СЗ, С4, С5 - фрагменты комплемента С1, С2, СЗ, С4, С5
ИС - индекс стимуляции
ИВ - индекс влияния
ИД - индекс девиации
ИП/А - индекс соотношения провосполительных цитокинов к
антивосполительным цитокинам
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Лечение больных с иммунодефицитными состояниями (ИДС) является одной из актуальных проблем современной медицины. Поэтому одной из важных научных задач является поиск новых способов и средств лечения заболеваний, связанных с патологией иммунной системы. В настоящее время значительно расширяется спектр иммунотропных лекарственных препаратов и показаний к их применению. Наиболее активно развиваются в этом направлении препараты тимического происхождения. Особое место среди них занимают синтетические препараты, такие как имунофан, тимоген, тимомодулин, тимостимулин, тимопентин ТР-5 (Карсанова М.И. и соавт., 1998, 2000; Лебедев В. В. и соавт., 1998,1999; Назаровым И. П. и соавт., 1999; Немцова Е. Р. и соавт., 1999; Нестерова И.В. и соавт., 2002; Старченко А.А., 2002). В последние годы спектр этих препаратов пополнился новым синтетическим иммуномодулятором "Бестимом", синтезированным в ГНЦ ГосНИИ ОЧБ г. Санкт-Петербург (Колобов Л. А., Симбирцев А. С, Куликов С. В. и соавт., 1997).
"Бестим" (у-О-глутамил-Ь-триптофан натриевая соль) представляет собой дипептид с выраженными иммуностимулирующими свойствами.
Экспериментальные исследования "Бестима" были начаты в 1999 году. В эксперименте на мышах, было доказано стимулирующее действие "Бестима" на фагоцитарную активность макрофагов. При этом оказалось, что отсутствие выраженного влияния "Бестима" на продукцию свободных радикалов предохраняет ткани от повреждения,
возникающего вследствие стимуляции фагоцитов, что делает применение препарата относительно безопасным.
При изучении действия "Бестима" в культуре лимфоцитов, после
введения лабораторным животным Пигаревой Н.В. и соавт. (2000г.),
было показано, что "Бестим" усиливает дифференцировку Т-
лимфоцитов на разных этапах созревания, а также увеличивает
функциональную активность зрелых лимфоцитов мыши, крысы и че
ловека. Под действием "Бестима" возрастала доля клеток-
предшественников Т-лимфоцитов костного мозга, и увеличивалось
содержание зрелых Т-лимфоцитов среди клеток тимуса, а в зрелых Т-
лимфоцитах крови он активировал синтез ИЛ-2 и экспрессию рецептора
ИЛ-2. Таким образом, действие "Бестима" направлено главным образом
на усиление созревания Т-хелперов, так как данный пептид из
бирательно усиливал экспрессию антигена L3T4 и стимулировал
продукцию Т-лимфоцитами ИЛ-2. Исследования, проведенные
Нестеровой И.В. и соавт. (2002), доказали, что "Бестим" обладает
выраженным иммунотропными эффектами в отношении нейтрофилов,
поврежденных при экспериментальной иммунизации мышей
аллергеном, а также ингибирует продукцию Ig Е. Результаты изучения
биологической активности "Бестима" на модели экспериментального
туберкулеза у мышей показали повышение эффективности
противотуберкулезной терапии за счет активации иммунного ответа (Заболотных Н.В. и соавт., 2003). "Бестим" существенно повышает эффективность этиотропной терапии экспериментального туберкулеза у мышей, восстанавливает пролиферативную активность спленоцитов и продукцию ими ИЛ-2, ингибированных при экспериментальном туберкулезе; повышает индуцированную КонА продукцию ИНФу и снижает индуцированную продукцию ИЛ-4 спленоцитами, препарат так
же влияет на функциональную активность макрофагов (Заболотных Н. В. и соавт., 2001). В современной литературе имеются данные о клиническом применении "Бестима". При использовании "Бестима" в комплексной терапии туберкулеза, повышается угнетенная НСТ-активность макрофагов при остропрогрессирующей инфекции и снижается повышенный уровень продукции супероксида при вялотекущем туберкулезе. Введение препарата приводило к снижению уровня внеклеточной 5-нуклеотидазы при классическом и остропрогрессирующем течении инфекции, стимулировало адгезивную активность перитонеальных Мф при вялотекущем туберкулезе (Заболотных Н.В. и соавт., 2003).
Препарат эффективен для терапии вирусных инфекций и ряда бактериальных (туберкулез, листериоз, лепра и др.). Введение "Бестима" в комплексную терапию больных деструктивными формами туберкулеза легких существенно повышает показатели клеточного иммунитета и как следствие - эффективность лечения. При комплексной терапии инфильтративного туберкулеза легких предпочтительнее применение "Бестима" в суточной дозе 100 мкг (Васильева Г.Ю. и соавт., 2002; Пигарева Н. В. и соавт., 2000). Изучено положительное влияние Бестима при включении его в комплексную терапию язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки (Ткачева А.Г. и соавт., 2003, 2004; Ткачева А.Г., 2004, 2005). Изучена клинико-иммунологическая эффективность бестима в комплексной терапии хронической урогенитальной хламидийной инфекции у мужчин (Зиганшин О.Р. и соавт., 2003; Ковалев Ю.Н. и соавт., 2003; Корнеев А.В. и соавт., 2005).
Высокая эффективность "Бестима" была показана при лечении больных нейроинфекцией хламидийной этиологии (Лобзин Ю.В. и
соавт., 2001, 2004). При сравнительном исследовании влияния иммуномодуляторов "Бестим" и "Беталейкин" (рекомбинантного ИЛ-1Ь) на иммунный статус больных с вторичными иммунодефицитами (ВИД) и хроническим инфекционным синдромом (ХИС) на фоне вакцинации против вирусного гепатита В (ВГВ) через один месяц после введения первой дозы вакцины Энджерикс В, было показано, что "Бестим" увеличивает содержание зрелых Т-лимфоцитов в крови, повышают индекс соотношения CD4/CD8, нивелируют отрицательное влияние вакцины против ВГВ на функциональную активность нейтрофилов. Таким образом, современный иммуномодулятор "Бестим" повышает иммунологическую безопасность вакцины против вирусного гепатита В, увеличивает эффективность вакцинации против вирусного гепатита В у пациентов с ВИД и ХИС (Абрамова Н.Н., Симбирцев А.С., Долгушин И.И., 2004; Абрамова Н.Н., 2005).
Таким образом, полученные экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о иммунокорригирующих эффектах Бестима.
Оценивая в целом изученное влияние препарата in vivo, можно сказать, что основной механизм его действия связан либо с активацией Thl иммунного ответа, либо с изменением функции макрофагов. В то же время, многие аспекты действия "Бестима" остаются неизученными. Во многом остается неясным влияние "Бестима" на различные типы клеток, как человека, так и животных, участвующих в иммунных реакциях (лимфоциты, моноциты, нейтрофилы) и продукцию этими клетками цитокинов. Во многом остаются неизученным действие "Бестима" на других экспериментальных моделях, в том числе при остром гнойном воспалительном процессе. Не исследовалось влияние "Бестима" на характер иммунологических реакций при развитии стафилококковой инфекции. Вместе с тем, стафилококковая инфекция
очень распространена, стафилококк является одним из основных возбудителей раневой и вторичной бактериальной инфекции (Эберт Л.Я. и соавт., 1983; Чукичев А.В., 1996). В тоже время влияние этого препарата на течение гнойно-воспалительного процесса, вызванного стафилококком, остается не исследованным.
Цель исследования:
Изучение влияния иммуномодулятора "Бестим" на активность иммунокомпетентных клеток in vitro и на течение стафилококковой инфекции in vivo в эксперименте на животных.
Для решения поставленной цели исследования были сформированы следующие задачи исследования:
Исследовать влияние различных концентраций "Бестима" на хемотаксическую активность фагоцитов in vitro для определения его оптимальной дозы.
Изучить влияние "Бестима" в оптимальной дозе на функции нейтрофилов, лимфоцитов и моноцитов периферической крови in vitro.
Оценить влияние иммуномодулятора "Бестим" in vitro на продукцию иммунокомпетентными клетками цитокинов в норме.
Исследовать влияние "Бестима" на иммунную реактивность и выживаемость животных со стафилококковой инфекцией.
Научная новизна результатов исследования.
Впервые изучено влияние "Бестима" на лабораторные показатели иммунной системы in vitro, включая число лимфоцитов с различными типами CD-рецепторов, продукцию цитокинов, функции фагоцитарных клеток. Впервые изучено действие "Бестима" на иммунологическую
реактивность и выживаемость животных со стафилококковой инфекцией. Выявлено, что "Бестим" обладает хемоаттрактантными свойствами, что оптимальные концентрации "Бестима", вызывающие хемотаксис in vitro, находятся в диапазоне от 10"5 до 10~4 мг/мл. Одним из механизмов действия "Бестима" в норме, и при развитии гнойной стафилококковой инфекции, является активация фагоцитарных клеток, которая реализуется через хемотаксические рецепторы фагоцитов, в частности через рецептор CDllb (рецептор к комплементу), и увеличение экспрессии интегриновых и лектиновых рецепторов. "Бестим" увеличивает экспрессию рецепторов CD 10, CD 16, CD34, HLA-DR, что свидетельствует о влиянии препарата на клеточное звено иммунной системы. В тоже время "Бестим" не влияет на активность или число FAS + лимфоцитов (CD95) и основных субпопуляций лимфоцитов (CD4, CD8, CD20, CD56).
"Бестим" в смешанной культуре клеток in vitro увеличивает спонтанную выработку ИЛ 10, снижает индуцированную продукцию ИЛ4. "Бестим", с учетом спонтанной продукции ИНФу и ИЛ8, стимулирует ФГА- и ЛПС- индуцированную продукцию ИНФу и снижает ЛПС- индуцированную секрецию ИЛ 8. Выявленное воздействие "Бестима" приводит к снижению активности ТЫ- и к усилению ТЫ- иммунного ответа.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. "Бестим" обладает хемоаттрактантными свойствами для
нейтрофилов, максимально выраженными в концентрации от 10"5 до 10~4
мг/мл.
2. "Бестим" в норме и при развитии гнойной стафилококковой
инфекции вызывает активацию фагоцитарных клеток.
Механизм действия "Бестима" связан с активацией фагоцитарных клеток через рецептор CD1 lb (рецептор к комплементу).
"Бестим" увеличивает экспрессию рецепторов CD 10, CD 16, CD34, HLA-DR, что свидетельствует о влиянии препарата на клеточное звено иммунной системы.
При воздействии in vitro на смешанную культуру клеток "Бестим" увеличивает спонтанную выработку ИЛ 10, снижает индуцированную продукцию ИЛ4, и, с учетом спонтанной продукции цитокинов, стимулирует ФГА- и ЛПС- индуцированную продукцию ИНФу и снижает ЛПС- индуцированную секрецию ИЛ8. Выявленное воздействие "Бестима" приводит к снижению активности Th2- и к усилению Thl- иммунного ответа.
Практическая значимость исследования:
Несмотря на преимущественно фундаментальную направленность работы, проведенное исследование действия иммуномодулятора "Бестим" in vitro на активность иммунокомпетентных клеток позволило разработать подходы к проведению коррекции нарушений функции клеток иммунной системы при развитии острого гнойно-воспалительного процесса, вызванного стафилококком.
Полученные данные о механизме действия "Бестима" на иммунокомпетентные клетки, а именно стимуляция продукции ИЛ 10 и снижение секреции ИЛ4, стимуляция индуцированной продукции ИНФу и снижение ЛПС- индуцированного синтеза ИЛ8, с учетом спонтанной выработки цитокинов, уточняют механизм его действия на иммунокомпетентные клетки, что позволяет использовать полученные данные при назначении данного препарата для целенаправленной
коррекции заболеваний, связанных с нарушением регуляции иммунного ответа.
Апробация работы.
Основные положения работы были доложены на VIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2004), на объединенном иммунологическом форуме: III Съезд иммунологов России, VI Национальный конгресс РААКИ, III Российская конференция: «Цитокины, Воспаление, Иммунитет» (Екатеринбург, 2004), на конференции, посвященной 10-летию НПЦ диагностики, лечения и профилактики дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия МЗ РФ» (Челябинск, 2004). На юбилейной научной конференции КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН "Университетская наука: взгляд в будущее", посвященный 70- летию КГМУ (Курск, 2005г.), на IX Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005г.), на IV конференции иммунологов Урала (Уфа, 2005 г.), на VI Международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2005г.)
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 173 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 162 источника, из них 30 иностранных. Работа иллюстрирована 22 таблицами и 1 рисунком.
![Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов](/i/i/4503/301534.png "Изучение влияния [Г]-D-глутаминил-L-триптофана (Бестима) на дифференцировку и функциональную активность лимфоцитов Петров Александр Владимирович")
![Состояние иммунной системы в различные фазы течения HBV-, HCV- и HDV-инфекций у больных шизофренией [Электронный ресурс]](/i/i/4485/176642.png "Состояние иммунной системы в различные фазы течения HBV-, HCV- и HDV-инфекций у больных шизофренией [Электронный ресурс] Назаров Дмитрий Евгеньевич")
![Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма [Электронный ресурс]](/i/i/4338/184223.png "Оценка влияния гриппозной инфекции и иммунизации живой реассортантной гриппозной вакциной на возникновение и течение IgE-опосредованных аллергических реакций организма [Электронный ресурс] Чиркова Татьяна Викторовна")