Введение к работе
1. Актуальность проблемы. Регуляция размножения и дифференци-ровки кроветворных л лимфоидных клеток связана с функционированием стромального микроокрукения (Wolf U.S., TrentIn 1.1.. 1968-1970; Bernstein S. E.. 1970). Микроокружсиие определяет, какие кроветворные и лимфоидные клетки репопулируют. данный орган, пролиферируют и созревают в определенных его микроструктурах. Выбор пути, по которому дифференцируются стволовые клетки под влиянием микроокружения, может носить как индуктивный характер, так и разрешительный, обеспечивающий реализацию случайно (по* внутреннему программированию) кошиткрованиых предшественников в органах гемопоэза и иммунитета.В обоих случаях в сеть ци-токиновых взаимодействий в качестве продуцентов и мишеней вовлечены клетки самых различных категорий- элементы всех ростков кроветворения и лимфопоэза, а также все типы стромальных элементов.
Главным достижением последнего десятилетия является развитие культуральной техники, позволившей выращивать вне организма отдельные компоненты стромы. изучать их способность к поддержанию гемопоэза и лимфопоэза, а также идентифицировать и клонировать гены стромальных клеток, ответственные за продукцию росторых и дифференцировочных факторов. Однако, роль стромы ке сводится только к поддержанию дифференцировки кроветворных и иммунокоше-тентных клеток. В кроветворной и лимфоидной ткани была открыта новая категория клеток (А. Я. Фриденштейн, Р. К. Чайлахян, 1970). которая ответственна за формирование специфического микроокружения. При трансплантации таких клеток образуются новые кроветворные и лимфоидные органы. Клетки, обеспечивающие перенос микроок-рукения, способны формировать в монослойных культурах строыалъные колонии (Р. К. Чайлахян, 1969). Для исследования механиков, посредством которых клетки этой категории выполняют свою роль в установлении и поддержании микроокружения, необходимо было определить их клеточный тип и. соответственно, их гистогенетические взаимоотношения со стволовыми кроветворными клетками и их потомками в органах гемопоэза и иммунитета. Способность этих клеток формировать в культурах колонии стромальных элементов свидетельствует об их пролиферативном потенциале. Однако, для выявления этих клеток методом колониеобразования. их количественного учета.
- г -
изучения их поведения в организме под влиянием различных факторов, выводящих кроветворную и лимфоидную ткань из состояния равновесия (в том число, при индукции иммунного ответа), необходимо иметь модель, позволяющую дискриминировать реакцию на эти факторы самих колонисобразущих клеток и сопутствующих им элеметсв (кроветворных или лимфоидных). Разработка такой подели, в свою очередь, требовала да::::ых о пролиферативном статусе колониеобразую-щих клеток in situ и в культурах, о влиянии на их пролиферативьис состояниэ клеток, естественно присутствующих в органах гемо- и лимфопоэаа. об адгезивности и других свойствах их мембран. Модель для изучения колониеобразуюірх строгальных клеток, основанная на их способности давать потомство в культурах в виде колоний, в первую очередь должна была располагать доказательствани клональ-
ВДГО ПрОИСХОЖДенИЯ ЭТИХ КОЛОНИЙ. Получение ТаКОЙ МОДеЛИ И OCHOL-
ных характеристик стромальных клеток должно было обеспечить возможность изучения роли этих клеток в процессах формирования и поддержания функционирующего микроокружения.
Цель» настоящего исследования являлись определение клеточного типа и характеристика стромальных колониеобразущих клеток, ответственных за формирование специфического микроокружения б органах гемопоэза и иммуни:ота, что позволило бы разработать модель для изучения стромальных клеток этой категории.
Основное задачи исследования:
і. Определить по специфическим синтезам и клеточным маркерам, к какому клеточному типу принадлежат клетки стромальных колоний, ответственные за создание микроокружения в органах геыо-позза и иммунитета.
-
Используя стабильные маркеры в сингенкых смешанных популяциях клеток, исследовать, имеют ли колонии стромальных клеток клональную природу, что необходимо для определения численности клоногенььгх стромальных клеток - предшественников по числу стромальных КОЛ0НІІЙ.
-
Разработать модель для изучения свойств и количественного учета предшественников стромальных колоний на основании данных о клональиой природе колоний и о различиях.некоторых структур клеточной мембраны колониеобразующих клеток кроветворной и лимфоид-ной ткани.
-
Определить содервание и маркеры колониеобразущих стро-мушшх предшественников, ответственных за создание микроокруае-
ния в первичных и вторичных лиыфоидных органах.
-
Исследовать гомогенность популяции стромальных колониеоб-разующкх клеток по прочности связи с тканевыми структурами, поскольку одной из функций строїш является создание механического каркаса органов гемопоэза и ишуни. зта.
-
Исследовать возможность самосборки кроветворного микроокружения из дезагрегированных стромалькых элементов для проведения анализа структуры популяции колониеобразуюірх стромальшх ыеток рг их способности организовать микроокружение при транаг антации отдельных клеточных популяций.
-
Проанализировать способность колониеобразующих стромаль-ных предшественников к р"популяции, что имеет важнейшее значение для создания и поддержания специфического микроокружения в органах гемопоэза и иммунитета.
-
Для анализа репаративных процессов в никроокрукении и его способности к самообновлению после повреждения определить радиочувствительность и исследовать т ^традиационкко изменения численности колониеобразущих стромальшх предшественников.
Научная новизна исследования.
В работе представлены основные характеристики новой категории клоток - предшественников кроветворной и лимфоидной ткани, образующих в культурах колонии стромальных элементов, которые обладают свойствами стволовых стромальных клеток и при трансплантации организуют специфическое микроокруяение.
Установлен клеточный тип колониеобразующих стромальных элементов в монослойных культурах клеток органов гемопоэза и иммунитета. На основании специфических синтезов, антигенных и цитохимических маркеров, поверхностных рецепторов и физиологических характеристик показано, что колониеобразующие клетки являются фиб-робластами, т. е. относятся к механоцитам» создащим каркас органа, включая его клеточные и межклеточный компоненты.
Впервые показано, что колониеобраэущие строгальные клетки относятся к высокоадгезивным элементам. Это свойство позволило отделить категорию стромальных клеток от большинства других предшественников, присутствующих в кроаетворной и лимфоидной ткани.
Впервые установлено, что предшественниками стромальных колоний являются одиночные фибробласты, содернащиеся во взвесях кроветворных и лимфоидных клеток. В сингенныя системах показано, что стромальше колонии являются клонами, а предшественники колоний -
- і -
клоногеншми клетками.
Впервые установлено, что клоногенные стромальные предшественники в организме находятся вне пролиферативного і,ула.
Разработана «одель, позволяющая дискриминировать факторы, влияющие непосредственно на пролиферацию стромальных предиестаен-ников, и факторы, воздействующие на них через кроветворные и лим-фоидные элементы.
Впервые показано, что стромальные предшественники формируют фибробластные колонии в культурах только при наличии колониести-мулирующей активности, продуцируемой элементами мегакариоцитарно-го ростка, или активности, имеющей аутокринный характер. Впервые установлено, что колониестимулирущая активность, продуцируемая мегакариоцитарныыи элементами и тромбоцитами, не идентична тром-боцитарному фактору роста (PDGF) и выводит стромальные предиест-венники в пролиферацию только при наличии других сывороточных факторов роста.
Предложен метод для определения линейной принадлежности предиественников стромальных колоний в химерных по гаплотипу клеточных популяциях с помощью иммунных цитотоксических лимфоцитов. Установлено» что клоногенные стромальные предшественники во взрослом организме гистогенетически независимы от стволовых кроветворных клеток. Клоногенные стромальные фибробласты относятся к местным элементы и не приживляются в кроветворной ткани при внутривенном введении костного мозга.
Впервые выявлена с помощью энзиматической обработки популяция стромальных предшественников, прочно связаных с тканевыми структурами костного мозга.
Пред-ожен метод, с помощью которого впервые получен перенос кроветворного микроокружения при трансплантации взвеси одиночных клеток костного мозга. Разработанный метод существенно расширил возможности исследования роли отдельных клеточн" с популяций в морфогенезе и функционировании микроокрукения
Исследованы радиочувствительность закономерности пострах.-ационной кинетики клоногенных костномозговых фибробластов. Впер > вые выявлен резкий абортивный подъем численности клоногенных стромальных предшественников через 6 - 8 часов после облучения в сублет?чьных дозах; причиной подъема m может быть только пролиферация перегиваомх клоногенных клеток. Строма," лишенная клоногенных предшественников в результате облучения в дозах более 15
Gy. не способна к обновлению и длительному поддержании гемопиэза.
На основе представленных данных разработаны методы для идентификации, исследования и отделения стромальных к"с,ногенных клеток от других элементов органов гемо- и лимфопоэза.
Научно-практическая ценность ^следования; На основании результатов настоящей работы создано представление о новой "атего-рки предшественников - колониеобразуюцнх стромальных элементах, ответственных за организацию специфического микроокрувения ь оралах гемопоэза и иммунитета. Изученный комплекс характери гик позволил выявить маркеры для идентификации и разработать методы выделения этих клеток, а такзе сделал возможным исследование свойств и потенций индивиду^лных стромальных предшественников. Представленная система доказательств клональной природы стромальных колоний позволила определять содержание клеток - предшественников в исследуемых популяциях по числу вырастающих в культурах колоний фибробластов, а также изучать дифференцировочные потенции предшественников индивидуальных колони*,. Разработанная модель явилась основой для нового направления в исследованиях стромзльного микроокружения - влияния фактороа экзо- и эндогенного происхоздения непосредственно на стромальные клетки-предшественники и опосредованно через кроветворные и лимфоидные элементы и на взашное регулирующее воздействие этих двух комлартментсв в процессах гемопоэза и формирования иммунного ответа. Метод выявления этой категории предшественников нашел применение в клинике при патологиях кроветворной и лиыфоидаой систем, а также костной ткани. В настоящее время невозмо&но выяснение этиологии некоторых патологических состояний, в частности, различных форм ишунодефицитов, аплазий и миелопролифоратипных заболеваний без определния в них роли стромы и л-ег ;ни ее поражения. Поэтому разработанная модель для для изучения клопогонных стромальных предшественников имеет не только теоретическое, но и практическое значение, так как позволяет различать ттогрнныо факторы, влияющие непосредственно на стромальные предшественники, либо через естественно сопутствующие им клетки. На основании полученных -гнных перед клинической иммунологией н гематологией поставлена задача по создании аналогии-' ной модели для исследования клопогонных стромальных лредаествен-ников в органах гемопоэза и иммунитета человека, что необходимо, для изыскания путей направленного воздействия на процессы.протекающие в них. Стромальные предшественники служат источником для са-
мообновления и регенерации ыикроокруяения. поэтому изучение динамики их численности после т іш. воздействий, как радио- и химиотерапия, может служить тестом для оценки возцогності. восстановления гемо- и лимфошэза.
Результаты работы широко используются как в экспериментальных исследованиях, так и в практическом здравоохранении (в Гематологическом научном центре РАМН. Центральном институте травматологии и ортопедии им. Приорова РАМН, Институте медицинской радиологии НЗ РФ, Киевском институте ортопедии МЗ РУ. а также в лабораториях и клиниках ряда зарубежных стран - ША, Великобритании, Нидерландов. Израиля и др.). Материалы диссертации включены в отечественные и зарубежные монографии ("Руководство по гематологии" под ред. А.И. Воробьева, М., 1987 г.; "Гистология" А. Хам. Д.Кормак, U.. "Мир".1983 г.; "Индукция костной ткани и остеоген-ные ктетки - предшественники", Фриденаггейн А. Я., Ладынина К. С.. М.. "Медицина", 1973 г.; "Клеточные основы кроветворения", И. Л. Чертков. А. Я. Фриденштейн. М.. "Медицина", 1977 г.; "Клеточные основы кроветворного микроокруяения", Фриденштейн А.Я,. Лурия Е.А.. М.. "Медицина". 1980 г.). а также в курс лекций по иммуно-морфологии в МГУ им. М. В. "смоносова.
Апробация,іщссертации_.. Диссертация апробирована на конференции отдела иммунологии НИИЭМ им Н.Ф. Гамалеи РАМН 27 мая 1993 г. Основные по эжения диссергационной работы били представлены и обсуздены на международных и всесоюзных съездах, конференциях и симпозиумах, заседаниях научных обществ, перечень которых приводен в конце автореферата.
Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 54 научных ; абатах.
Структура и объем диссертации. Работа написана по традиционному плану и включает следующие разделы: "Введение". "Обзор литературы" (3 главы). "Материалы и метода исследовг ш". "Собственные исследования и их обсуждение" (8 глав). "Заключение"," "Выводы" и "Список литературы" (546 источнк эв). Работа иллюстриров^а рисунками и таблицами. Общий объем диссертации 340 страниц.
