Введение к работе
Актуальность проблемы. Лейкозы - злокачественные заболевания кроветворной ткани. Ежегодно, в России регистрируется 1200 новых случаев лейкозов у детей. Еще несколько десятилетий назад, эта группа онкологических заболеваний считалась однородной, а успехи в лечении были не высокими. Однако, благодаря совершенствованию методов выявления лейкозов, росту возможностей лабораторной диагностики, проведению мультицентровых контролируемых исследований ситуация кардинально изменилась в лучшую сторону (Карачунский А.И., 1999, Самочатова Е.В., 1999). На основании данных морфологии, цитохимии, иммунофенотипирования удалось выявить варианты лейкозов и разделить ранее однородную патологию на конфетные нозологические формы и группы риска, требующие дифференцированной терапии. Это увеличило число пациентов, вышедших в стойкую ремиссию или излечившихся. Основным событием в исследовании лейкемии у человека последнего времени являются открытия конкретных генетических перестроек, либо приводящих непосредственно к появлению опухолевого клона, либо имеющих огромное прогностическое значение.
История прихода генетики в диагностику и лечение лейкозов ведёт начало с описания в 1960 году Nowell и Hungerford укороченной 22-ой хромосомы у больного с хроническим миелолейкозом. Такая картина повторялась от больного к больному, то есть она была «неслучайной» (Nowell, Hungerford, 1960). Эта хромосома была названа Филадельфийской и затем было показано, что она образуется в результате транслокации (de Klein А, 1982). Значение этого эпизода было колоссально, поскольку диагностика лейкозов была выведена на молекулярный уровень. В последние годы этот путь привел к созданию препаратов, которые выборочно блокируют действие онкобелков. Одним из первых был препарат Гливек, который открыл новую страницу в терапии хронического миелолейкоза. С тех пор было идентифицировано множество неслучайных хромосомных поломок напрямую участвующих в формировании онкологического заболевания, либо влияющих на его течение и прогноз, а в части случаев лишь помогающих следить за прогрессией заболевания или за остаточным пулом клеток опухоли (Rowley JD, Aster JC, 1993). Однако, ещё большее число обнаруженных транслокаций до
[
(ОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИ6ЛНОТЕКА I
сих пор носит характер случайных и требует дальнейшего изучения их роли в формировании или развитии опухоли.
Современные молекулярно-биологические методы позволяют разделить всех пациентов с различными формами лейкозов на крупные подгруппы по наличию неслучайных транслокаций, или же их достоверному отсутствию. Для большей части этих аберраций выявлено клиническое значение в определении прогноза заболевания, и они являются важнейшими факторами риска в современных клинических исследованиях.
Стандартным методом диагностики значимых химерных генов, которые образуются при слиянии участков последовательностей протоонкогенов, при транслокации, на сегодня является полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, которая обладает высокой чувствительностью, специфичностью и доступностью для применения в клинических лабораториях (Cross N.C.P., 1994). Цитогенетическое исследование, остававшееся долгое время основным, и позволившее сделать множество открытий в определении генетической природы злокачественных новообразований крови у детей, не отвечает требованиям клиницистов. Обладая низкой чувствительностью, зависимостью возможности получить результат от множества факторов, влияющих на рост культуры клеток, субъективностью - оно уступает место новейшим разработкам в области анализа генома (Ma S.K. 1999, Prema Е. Devaraj, 1995). Необходимо отметить, что рано списывать стандартную цитогенентику из арсенала методов, применяемых в лабораторной и исследовательской практике, так как она даёт возможность представить комплексное изменение кариотипа в властной клетке, однако, расширение возможностей новых методик, приводит всё более ограниченному использованию цитогенетического анализа в рутинной практике.
Сейчас возможно определение большого числа неслучайных хромосомных транслокаций, а точнее ещё более значимых их продуктов -химерных генов. Наиболее интересны с клинической точки зрения гибридные гены BCR/ABL, TEL/AML1, PMLyPARA, AML1/ETO, CBFB/MYH11, MLIVAF4 и Е2А/РВХ. Тем не менее, тенденция к централизации онкогематологической помощи, создание кооперативных групп, ведущих совместные проекты, вводит новые требования к лабораторной службе. Данные о генетической природе властных клеток, должны быть получены оперативно и быть абсолютно достоверными. Интеграция клиник для оптимизации помощи детям, страдающим лейкозами, увеличивает нагрузку на молекулярно-биологические
подразделения лабораторных комплексов. Высокотехнологичные схемы лечения повышают ответственность, ложащуюся на крупные гематологические центры.
Требуется внедрение новых методов молекулярного анализа. Кроме того, они должны расширять данные, получаемые клиническим врачом о пациенте, о природе и свойствах опухолевых клеток, вызвавших онкологическое заболевание. И такие методы молекулярного анализа в последнее десятилетие появились.
Это, использующие нанотехнологии, - биологические микрочипы, которые находят всё более широкое применение в анализе экспрессии генов, определении точечных мутаций, выявлении онкобелков. Однако, в нашей стране, несмотря на международный приоритет отечественной науки в создании таких методов, анализ с их использованием практически не распространён. Возможности проведения молекулярно-генетического исследования всем пациентам детского возраста с острым лейкозом в России ограничены низкой оснащённостью лабораторий, высокой стоимостью расходных материалов. В то же время, тестирование доступных разработанных отечественных и высокоэффективных систем с использованием технологии микрочипов до последнего времени не проводилось.
Цель исследования: улучшить качество диагностики и точность стратификации больных на группы риска при лейкозах у детей, путём определения хромосомных аберраций с использованием метода гибридизации солигонуклеотидными микрочипами.
Задачи исследования
Провести испытания методики, основанной на мультиплексной ПЦР и последующей гибридизации с олигонуклеотидным микрочипом для анализа хромосомных аберраций в властных клетках при лейкозах у детей на клеточных культурах и клинических образцах.
Применить в клинической диагностике указанный метод, определить диагностическую и прогностическую информативность разработанной методики и ее эффективность, сравнить с другими методами: ОТ-ПЦР, секвенированием.
Испытать метод мультиплексной ПЦР с гибридизацией на олигонуклеотидном микрочипе в анализе образцов пациентов с лейкозами для определения минимальной остаточной болезни.
Определить частоту встречаемости наиболее важных хромосомных транслокаций при лейкозах у детей и вариантов мест перестроек методом мультиплексной ПЦР с гибридизацией на микрочипе и их корреляцию с клиническими характеристиками пациентов.
Внедрить в клиническую практику метод мультиплексной ПЦР и гибридизации для анализа наиболее значимых хромосомных транслокаций.
Научная новизна Впервые применен метод мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипом для комплексной диагностики лейкозов у детей. Определена с помощью метода мультиплексной ПЦР и гибридизации с биологическим микрочипом частота наиболее клинически значимых транслокаций: 12% для TEL/AML1, 3,3% - MLIVAF4, 1% - BCR/ABL при ОЛЛ, 18% - PML/RARA, 13,3% -AML1/ETO при ОНЛЛ у группы онкогематологических пациентов в российской детской популяции. Показана возможность определения точки слияния в химерных генах при использовании данного метода. Прослежена связь субвариантовЬ2а2 и Ь3а2 химерного гена BCR/ABL, и bcrl, ЬсгЗ химерного гена PML/RARa с клиническим течением лейкоза у детей. Впервые проведён анализ клинических характеристик для пациентов с различными изоформами химерного гена BCR/ABL - Ь2а2 и Ь3а2, позволивший предположить их неравнозначное влияние на прогноз. Показана возможность отслеживания минимальной остаточной болезни или анализа не первичных образцов в условиях терапии острого и хронического лейкоза с помощью использования технологии микрочипов.
Научно-практическая значимость
Испытан новый метод диагностики основных хромосомных аберраций при лейкозах у детей. Частоты встречаемости хромосомных транслокаций соответствуют таковым для других регионов, что подтверждает целесообразность использования единых протоколов лечения в терапии лейкозов во всём мире.
Разработка и внедрение метода молекулярно-генетического исследования с использованием мультиплексной ПЦР и гибридизации с
олигонуклеотидным микрочипом позволяют точнее верифицировать опухоль, поставить диагноз, осуществлять долгосрочный прогноз, корректировать терапию в соответствии со свойствами опухоли.
В результате выполненной работы реализован ряд эффектов: медицинский - улучшение диагностики и определения прогноза; экономический - уменьшение затрат на диагностику и лечение; научный - появилась возможность скринингового анализа пациентов на наличие основных хромосомных аберраций, открылись возможности для мультицентровых исследований с целью определения значения тех или иных транслокаций и их изоформ; биологический - адаптирована методика применения олигонуклеотидных микрочипов для анализа химерных РНК путём гибридизации.
Внедрение. Результаты диссертационного исследования по использованию метода реализованы при анализе образцов пациентов в кабинете биочип-диагностики (Поликлиника №3 ЦКБ РАН), в лаборатории биологических микрочипов (ИМБ РАН). Планируется внедрение метода в лабораторную практику нескольких зарубежных лабораторий. Благодаря проведению данной работы организована диагностика ряда наиболее значимых хромосомных аберраций методом мультиплексной ПЦР и гибридизации с микрочипами у пациентов с острым и хроническим лейкозом.
Организация исследования. Работа выполнена в ГУ НИИ Детской гематологии МЗ РФ (директор ГУ НИИ ДГ МЗ РФ - член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор А. Г. Румянцев) на базе Института молекулярной биологии им. В.А Энгельгардта, РАН (директор ИМБ РАН -
академик РАН, доктор химических наук, профессор А.Д. Мирзабеков
Исследование проводилось в соответствии с планом НИР №005/019/001 по теме: «Разработка и внедрение в практику молекулярно-генетических методов диагностики и биологически обоснованных методов терапии и профилактики заболеваний крови у детей и подростков»
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции Теномика, протеомика и биоинформатика для медицины" (Москва, 20-21 июня, 2002 г.); на III симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний» (Москва, 6-7 февраля, 2003 г.); на III
съезде онкологов и радиологов СНГ (Республика Беларусь, Минск, 25-28 мая 2004 г)
Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников ГУ НИИ Детской гематологии и Российской Детской Клинической Больницы 23 сентября 2004 года По результатам диссертации опубликовано 14 работ
Структура и объем диссертации.
Похожие диссертации на Молекулярная диагностика хромосомных аберраций при лейкозах у детей методом гибридизации с биологическими олигонуклеотидными микрочипами
