Введение к работе
Актуальность темы диссертации.
Одной из главных задач клинической иммунологии является диагностика нарушенного звена иммунной системы, в том числе и фагоцитарной. Все основные системы иммунитета задействованы в защите организма против инфекционных агентов - Т-лимфоциты и NK-клетки, фагоциты, иммуноглобулины и комплемент. Элиминация возбудителя осуществляется общими «усилиями» и все-таки одно из центральных мест в конечном этапе противоинфекционной защиты - киллинге микробных агентов и их разрушении - занимает фагоцитоз.
Первичная иммунологическая недостаточность нередко
характеризуется яркой клинической картиной, однако только комплексное исследование фагоцитарного звена иммунитета является основополагающим при диагностике таких врожденных иммунодефицитов, как хроническая гранулематозная болезнь, синдром Чедиака-Хигаси, LAD (Leukocyte Adhesion Deficient), дефицит миелопероксидазы (Ю.Е.Вельтищев, 1996, D. Roos, et al., 2000) и др.
Изучение фагоцитарного звена иммунитета при вторичной иммунологической недостаточности, доминирующей формой которой является спонтанная (P.M. Хаитов, Б.В. Пинегин, 1999), необходимо для выяснения степени его нарушения и причинно-следственной роли фагоцитарных факторов иммунной защиты в развитии иммунодефицита. Важно установить причины нарушения фагоцитоза, они могут быть как внутренними, обусловленными дефектом самих фагоцитов, так и внешними. К последним можно отнести факторы, активирующее действие которых является необходимым для полноценного функционирования фагоцитов, например, Т-лимфоциты и продуцируемые ими цитокины.
В клинической практике изучение фагоцитоза чаще всего сводится к анализу поглотительной активности клеток фагоцитов, причем особого внимания выбору мишени фагоцитоза не уделяется. Другими распространенными методами являются исследования кислородного «взрыва» с помощью НСТ-теста и хемилюминесценции. Ключевой функциональный тест фагоцитарных клеток - киллинг захваченных микробов - проводится микробиологическим методом, с подсчетом выживших после фагоцитоза микробов по числу колоний. Метод не имеет широкого распространения, так как является трудоемким и продолжительным по времени выхода результата.
В настоящее время прочные позиции во всех областях науки, где проводятся работы по исследованию структуры и функции клеточных популяций, завоевывает проточная цитофлюорометрия. Использование проточной цитофлтоорометрии в иммунологии дает возможность оценки практически всех параметров иммунного статуса, включая и фагоцитарное звено (S.F. van Eeden, 1999, DA. Bass et al., 1983, M. Saresella et al, 1997).
Применение цитометрических методов исследования к оценке основных этапов фагоцитоза - это получение более объективной информации о состоянии фагоцитарных клеток. Среди неоспоримых преимуществ проточной цитометрии - возможность исследовать метаболизм отдельно взятой клетки, анализ очень большого числа клеток, наконец, высокая скорость, точность, простота постановки реакции и быстрое получение результата. В этом направлении уже сделаны большие успехи по разработке и внедрению методов оценки поглощения стафилококка и бактерицидности - внутриклеточного киллинга стафилококка (Мазуров Д.В., 2000) - пиогенного (внеклеточного) микробного агента.
В связи с этим, целью работы явилась разработка новых цитофлюорометрических методов к оценке фагоцитарного звена иммунитета и изучение фагоцитоза при различных видах иммунологической недостаточности на новом методическом уровне с использованием проточной цитофлюорометрии.
Задачи исследования.
-
Разработать метод оценки уровня активных форм кислорода в фагоцитарных клетках крови человека во время респираторного «взрыва» с использованием проточной цитофлюорометрии.
-
Разработать метод оценки поглощения и киллинга фагоцитами крови человека грибкового микробного возбудителя на примере Candida albicans с использованием проточной цитофлюорометрии.
-
Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с первичными иммунодефицитными состояниями.
-
Исследовать особенности функционирования фагоцитарной системы с помощью существующих и разработанных цитофлюорометрических методов у больных с вторичными иммунодефицитными состояниями.
Научная новизна.
Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов тесты оценки уровня внутриклеточной перекиси, водорода в гранулоцитах и моноцитах периферической крови, отражающие интенсивность кислородного «взрыва» в этих клетках, с применением специальных индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии. Отработаны варианты тестов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии.
Впервые адаптированы и модифицированы в виде микрометодов методики оценки поглощения и киллинга ФИТЦ-меченой C.albicans нейтрофилами и моноцитами крови человека с помощью проточной цитофлюорометрии для цельной крови (киллинг) и для выделенной лейкоцитарной суспензии (поглощение и киллинг).
Впервые проведено комплексное исследование состояния фагоцитарной системы у детей с ХГБ, в том числе с анализом бактерицидной и фунгицидной активности фагоцитов и анализом уровня продукции активных форм кислорода в отдельно взятых фагоцитарных клетках. Показаны возможности цитометрического метода оценки продукции активных форм кислорода для выявления Х-сцепленных вариантов наследования болезни.
При исследовании влияния полиоксидония на бактерицидную функцию фагоцитов in vitro впервые были получены данные о значительном стимулирующем свойстве этого иммуномодулятора - в присутствии полиоксидония внутрифагоцитарный киллинг бактерий возрастает на 50-100%. Эффект полиоксидония, выявленный при исследовании фагоцитарных клеток здоровых людей, в полной мере проявляется и в отношении НАДФН-оксидаза дефектных фагоцитов крови больных ХГБ. При этом показатели бактерицидности у больных ХГБ достигают нормативных значений.
Проведено комплексное изучение фагоцитарного звена иммунитета ребенка с синдромом Чедиака-Хигаси и выявлены значительные дефекты в продукции активных форм кислорода и бактерицидности фагоцитов. Впервые обнаружено, что поглотительная активность фагоцитов крови больного в отношении стафилококка сопровождается апоптозом самих нейтрофилов, а опсонизация бактерий значительно увеличивает процент апоптоза фагоцитов.
Впервые использован цитометрический подход к исследованию основных показателей фагоиигоза у больных с вторичными иммунодефицитами. Выявлено, что для больных хроническим рецидивирующим фурункулезом характерно снижение бактерицидных качеств фагоцитарных клеток крови, а фагоцитарные клетки больных туберкулезом легких отличаются сниженными фунгицидными качествами (способностью убивать грибковые микробные агенты).
Практическая значимость работы.
Метод оценки уровня внутриклеточной перекиси водорода (ДХФ-ДА и ДГР 123 тесты) с помощью проточной цитофлюорометрии разработан в виде микрометодов как для цельной крови, так и для выделенной лейкоцитарной суспензии, и подтвержден хемилюминесцентным анализом. Метод высокочувствительный, позволяег выявлять все клетки с дефектом НАДФН-оксидазы, например, при ХГБ, а также гетерозиготное носительство при X-снепленном варианте наследования этой патологии. Набраны нормативные показатели. Тесты просты в исполнении и могут использоваться для поточных исследований.
Для поточных исследований подготовлены и методы оценки поглощения и киллинга C.albicans с помощью проточной цитофлюорометрии. Набраны нормативные показатели по анализам здоровых людей. Метод оценки поглощения C.albicans пригоден для
постановки как в цельной крови, так и с выделенной лейкоцитарной суспензией.
На примере различных патологий показана возможность исследования фагоцитоза с помощью проточной цитофлюорометрии и диагностики нарушенного звена фагоцитарной системы.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Использование индикаторных красителей ДХФ-ДА и ДГР 123 и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать уровень внутриклеточной перекиси водорода в отдельно взятой фагоцитарной клетке. Метод можно использовать для диагностики ХГБ и выявления гетерозиготного носительства при Х-сцепленном варианте ХГБ.
-
Использование живой и фиксированной ФИТЦ-меченой С.albicans и проточной цитофлюорометрии позволяет оценивать соответственно фунгицидную активность и поглотительную активность нейтрофилов и моноцитов.
-
Применение цитофлюорометрических подходов к оценке функциональной активности фагоцитарных клеток позволяет провести комплексную оценку фагоцитарного звена при различных видах иммунологической недостаточности, в том числе первичных иммунодефицитах - ХГБ и синдроме Чедиака-Хигаси и вторичных иммунодефицитах - хроническом рецидивирующем фурункулезе и туберкулезе легких.
-
Под влиянием иммуномодулятора полиоксидония значительно повышается бактерицидная активность фагоцитарных клеток in vitro
Публикации по теме диссертации.
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ и 1 работа
принята к печати. Результаты доложены на 4-ом конгрессе РААКИ
«Современные проблемы аллергологии, иммунологии и
иммунофармакологии» 29-31 мая 2001г., Москва.
Объем и структура диссертации.
