Введение к работе
Актуальность проблемы. Гуморальная регуляция иммунологических реакция осуществляется множеством растворимых агентов, включая гормоны, интерлейкины, антитела и т.д. В изучении роли этих агентов при туберкулезе чередовались периоды, когда глазное внимание исследователей, занимавшихся проблемами противотуберкулезного иммунитета, было приковано к разным группам таких веществ. Вполне понятно, что в течение первой половины текущего столетия основным предметом изучения среди гуморальных факторов являлись антитела, однако веских доказательств, что они играют какую-либо существенную роль в защите организма от данной инфекции не получено.
После того, как было установлено, что главное звено в защите организма от туберкулеза - взаимодействие Т-лимфоцитов и макрофагов, силы исследователей были сконцентрированы на изучении факторов, способствующих дифференцировке иммунокомпетентных клеток, межклеточном взаимодействии, а впоследствии на интерлеакинах (Авербах М.М.,1978.1880,1985; Mittler R. et.al.,1985; Sharon И.,1986). Значению антител при этих процессах в последнее время уделяется значительно меньшее внимание. Вместе с тем, столь тонкий, инструмент кммунорегуляции как антителообразование, едва ли кокет быть запушен вхолостую. Кроме того, действие антител на обязательно должно быть направлено непосредственно на сами мико-бактерии, существуют более обширные возможности для балансировки противотуберкулезного иммунитета, например путем идиотип-анти-идиотипических взаимодействий. Действительно, наличие этого компонента иммунитета при ?ликобзктериальных инфекциях продемонстрировано (Сайра М. et.al.,1986; Colllzl V. et.al.. 1983), а также получены сами антиидаотипические глтитела (анти-ЭД) против идио-типов противотуберкулезных антител (Praputpittaya К. et.al..
- г -
1987а, 1987b). При этом и непосредственное определение современными методами уровня и спектра противотуберкулезных антител далеко не исчерпало себя в качестве средствэ иммунодиагностики и характеристики особенностей течения туберкулеза, а сами препараты противотуберкулезных антител, в том числе моноклональных, еще в недостаточной степени используются для характеристики микобакте-риальных антигенов, приготовления диагностикунов и других целей.
Изучению ряда аспектов этой проблемы и посвяшзна настоящая работа. При этом, основное внимание было уделено изучению гуморального иммунного ответа, индуцированного микобактериями бычьего вида, исходя из того положения,что данный вид микобактерин является основным возбудителем туберкулеза у крупного рогатого скота (и довольно часто у людей), а также из того, что этот вид мико-бактериз вызывает заболевание у животных (в том числе у линейных мышей) (Grange J.M., Collins С. Н., 1987) в большей степени напоминающее туберкулез у человека, чем при инфицировании другими видами микобактерий, что важно при моделировании туберкулезной инфекции в эксперименте.
. Целью настоящего исследования являлся анализ антителообразо-вания против M.bovls 8 и изучение идиотипических взаимодействия, характеризующих антимикобактериальные моноклональные антитела и их актиидиотипы. В связи с этим были поставлены следующие конкретные задачи:
-
Охарактеризовать структуру комплексных антигенов M.bovls 8, выделенных различными способами - ультразвуковые дезинтеграты (УЗД) и клеточные гтенки (КС).
-
Изучить различия в спектрах специфических антител к фракционированным антигенам M.bovls 8 у больного и здорового крупного рогатого скота.
-
Разработать способ иммунизации мышей антигенами M.bovls 8 для создания оптимального гуморального иммунного ответа. Получить и охарактеризовать моноклональные антитела против M.bovls 8.
-
Разработать метод индукции сингенного антиидиотишческого иммунного ответа против антимикобактериальных моноклональных антител и изучить взаимодействие антиидиотипических антител с противотуберкулезными антителами и сенсибилизированными лимфоцитами мышей, иммунизированных антигенами M.bovls 8 и анти-ИД.
Научная новизна.
Впервые охарактеризованы спектры антимикобактериальных антител сыворотки здорового и больного туберкулезом крупного рогатого скота. Установлено,что для больных животных характерны антитела реагирующие с детерминантами антигенов молекулярной массой 19, 22-24. 25 и 27кДа.
Разработан способ иммунизации мышея линии ВАІВ/с для индукции первичного гуморального иммунного ответа против М. bovls 8, высокого по уровню и широкого по спектру антител, оптимального для получения моноклональных антител (МАТ)(его основным моментом явилась иммунизация в подушки лап). При получении гибридом в случае использования разработанной схемы, частота слияния составила ЗІ.7ІЖ, а эффективность слияния 27,7%.'Получена серия МАТ, реагирующих как с микобактериями М.tuberculosis complex, так и преимущественно с M.bovls, или перекрестно с целым рядом микобактерий. Три МАТ реагировали с рексмбинантным белком 19кДа.
С помощью МАТ в сингенной системе был индуцирован антиидко-типический иммунный ответ. С повышением степени очистки анти-ИД антисыворотки повышалась активность связывания анти-ИД антител с гомологичными МАТ. Очищенные анти-ИД реагировали более активно с сыворотками больного туберкулезом, чем здорового крупного рогато-
го скота. Анти-ИД вызывали дозозависимую стимуляцию пролиферации клеток лимфоузлов мышей, иммунизированных как этим же анти-ИД, так и "исходным" антигеном M.bovls 8. Пролиферацию ингибировал ИД МАТ, использованный для индукции анти-ИД антител. Практическая значимость.
Изучены спектры противотуберкулезных антител у больного туберкулезом и здорового крупного рогатого скота, выявлены иммуно-доминактные антигены, которые наиболее перспективны для иммунодиагностики туберкулеза у крупного рогатого скота.
Разработана оптимальная схема иммунизации мышей микобактери-альными антигенами, позволяющая сократить сроки иммунизации для получения моноклональкых антител еще в процессе первичного ответа.
Получен ряд новых препаратов моноклональных антител и их ан-тиидиотипов, индуцированных в сингенных мышах и имеющих потенциальную диагностическую значимость.
Положения, выносимые на зашиту.
-
Качественная характеристика спектра антимикобактериальных антител сыворотки крупного рогатого скота позволяет выявлять у больных животных антитела, реагирующие с иммунодоминантными антигенами M.bovls 8, иными чем у здоровых особей.
-
Способ однокрзтной иммунизации мышей ЛИНИИ BAIB/C в подушки лап антигоном клеточных стенок M.bovls 8, позволяет получить высокий по урозкю и разнообразный по спектру первичный гуморальный иммунный ответ, оптимальный для получения моноклональных антител к этим антигенам.
3. Индукция анти-ИД антител антимикобактериальными МАТ в
сикгонной системе позволила получить анткидиотипический препарат,
распознаваемый противотуберкулезными антителами и лимфоцитами,
иммунными к антигенам микобактерий.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены: на конференции молодых ученых "Актуальные вопросы фтизиатриии и пульмонологии" (г. Москва, 1988 г.). на XI республиканской конференции по фтизиатрии и пульмонологии (г.Таллин, 1988),на Симпозиуме "Фундаментально-прикладные исследования во фтизиатрии" (г.Москва, 1989 г.), на научно-практической конференции по туберкулезу (г.Самарканд, 1989 г.), на 2-ом Всесоюзном симпозиуме "Реабилитация иммунной системы" (Г.Дагомыс, 1990г.),на отраслевом совещании "Разработка диаг-ностикумов для выявления туберкулеза у людей и крупного рогатого скота" (г.Оболенск. 1989 г.), на съезде фтизиатров Молдовы (г.Кишинев, 1991г.),на заседании отдела иммунологии ЦНИИ туберкулеза РАМН (1992г.), на XI съезде фтизиатров (г.Санкт-Петербург, 1992 г.).
Объем работы.
Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследования, заключения, выводов, приложения к обзору литературы и указателя литературы, включающего 297 работ. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 4 таблицами.
