Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Современное состояние проблемы заготовки и консервирования эритроцитных сред (обзор литературы) 11
1.1. Клиническое значение присутствия примесей аллогенных лейкоцитов, тромбоцитов и белков плазмы в эритроцитных средах 11
1.1. Методы получения эритроцитных сред, обедненных лейкоцитами, тромбоцитами и плазменными белками 25
1.2. Изменения физических и биохимических параметров эритроцитов в процессе консервирования, методы их исследования 34
1.3. Консервирующие растворы и механизм действия их основных компонентов 40
Глава 2. Объекты, материалы и методы исследований 51
2.1. Объекты, материалы и объем исследований 51
2.2. Методы исследований 57
2.2.1. Методы оценки консервирующих свойств эритроконсервантов и эффективности удаления лейкоцитов и плазмы 57
2.2.2. Методы оценки реологических свойств взвесей эритроцитов и консервированной крови 59
2.2.3. Методики, использованные для изучения безвредности эритроконсерванта для отмытых эритроцитов 62
2.3. Статистическая обработка результатов исследований 63
Глава 3. Разработка ресуспендирующего и консервирующего раствора для отмытых эритроцитов 64
3.1. Изучение возможности использования препарата Мо деже ль для хранения отмытых эритроцитов при 4С 64
3.2. Исследование возможности хранения отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-АФ при 4С 68
3.3. Выбор рецептуры консерванта для отмытых эритроцитов Стр.
Глава 4. Изучение свойств препарата Модежель-глюфосфат как средства для консервирования отмытых эритроцитов 75
4.1. Исследование морфофункциональных и физико-химических особенностей взвеси отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат 75
4.2. Изучение сохранности морфофункциональных свойств взвеси отмытых эритроцитов в растворе Модежель-глюфосфат в процессе хранения при4С 81
4.3. Изучение реологических свойств взвеси отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат 88
Глава 5. Доклиническое изучение препарата Модежель-глюфосфат 95
5Л. Общетоксическое действие эритроконсерванта Модежель-глюфосфат 95
5.1.1. Острая токсично сть 95
5.1.2. Хроническая токсичность 96
5.1.3. Местнораздражающее действие 109
5.2. Изучение специфической активности препарата Модежель-глюфосфат
5.2.1. Аллергизирующее действие 109
5.2.2. Тератогенность и канцерогенность эритроконсерванта Модежель-глюфосфат ПО
Глава 6. Разработка метода заготовки и изучение морфофункциональных свойств взвеси профильтрованных и отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат в процессе хранения при 4С 112
Заключение 123
Выводы 139
Практические рекомендации 140
Список литературы
- Изменения физических и биохимических параметров эритроцитов в процессе консервирования, методы их исследования
- Методы оценки консервирующих свойств эритроконсервантов и эффективности удаления лейкоцитов и плазмы
- Исследование возможности хранения отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-АФ при 4С
- Изучение сохранности морфофункциональных свойств взвеси отмытых эритроцитов в растворе Модежель-глюфосфат в процессе хранения при4С
Введение к работе
Актуальность проблемы
Совершенствование гемокомпонентной терапии требует разработки новых методов заготовки и консервирования компонентов крови, в частности, отмытых эритроцитов, переливание которых стало неотъемлемой частью трансфузионного пособия. Метод отмывания эритроцитов является одним из самых доступных и эффективных способов обеднения эритроцитных сред плазмой, тромбоцитами и в значительной мере лейкоцитами.
Целью трансфузий эритрокомпонентов является коррекция анемического синдрома, поэтому плазменные белки и клетки - носители высо-коиммуногенных антигенов расцениваются как балласт и могут служить причиной возникновения общеизвестных иммунологических, аллергических и других посттрансфузионных осложнений (Н.В. Минеева, 2001; И.К. Никитин, ПИ. Козинец, 2002; А.Е. Biedler et al, 2002; Hong Chang et al, 2000; J.D. Smith, S.F. Leitman, 2000; C.B. Toth et al, 1998; E.M. Wood et al, 2000).
Лейкоциты, кроме того, могут стать непосредственным источником клеточно-ассоциированных вирусных и бактериальных инфекций (В.Н. Мельникова и соавт., 2002; К.Ю. Литманович и соавт., 2004; J.D. Roback, CD. Hiller, 1999). Снижение в эритроцитных средах примеси лейкоцитов существенно улучшает условия хранения красных клеток крови, замедляет формирование микросгустков (J.R. Hess etal., 2000; Ю.Л. Шевченко, В.Н. Шабалин, 2003).
Применение отмытых эритроцитов, представляющих собой среду со сниженной реактогенностью, является предпочтительным в детской и акушерской практике, у трансфузионнозависимых пациентов (гематологических, онкологических больных), при неблагоприятном трансфузио-логическом и аллергологическом анамнезе (К.М. Абдулкадыров, СИ. Моисеев, 2001).
Для снижения уровня белых клеток в дозе отмытых эритроцитов ниже иммуногенного представляется необходимой их предварительная фильтрация с использованием специальных лейкофильтров. Полученную среду можно применять не только у пациентов, которым противопоказано введение плазменных белков, но и у больных с наличием анти-HLA, а также специфичных антигранулоцитарных и антитромбоцитарных антител; ее переливание предупреждает развитие аллоиммунизации и перенос цито-мегаловирусной и других вирусных инфекции (СР. Engelfriet, 2001).
Потребности в этих трансфузионных средах значительно выше реально используемых в настоящее время объемов. Одна из важных причин подобного положения связана с невозможностью хранения отмытых эритроцитов, что не позволяет проводить их предварительную заготовку.
Основным препятствием этому не является опасность бактериальной контаминации отмытых эритроцитов при их заготовке, как считалось ранее. Этот рубеж сейчас можно считать преодоленным благодаря применению закрытой системы для отмывания красных клеток.
Главной проблемой хранения является быстро наступающий гемолиз и потеря функциональной полноценности эритроцитов при 4С в изотоническом растворе натрия хлорида, который повсеместно используется в качестве отмывающего и ресуспендирующего раствора. Срок хранения отмытых эритроцитов в физиологическом растворе, согласно действующей инструкции, ограничен 24 часами.
Отсутствие эффективного консервирующего раствора, позволяющего длительно хранить отмытые, а тем более профильтрованные и отмытые клетки без потери их жизнеспособности, препятствует широкому использованию этих сред. За рубежом предлагались отдельные экспериментальные консерванты на глюкозосолевой основе, содержащие аденин, однако они не получили применения в практике. По результатам наших многолетних предшествующих исследований, основой такого препарата может стать раствор модифицированного деионизированного желатина.
Согласно вышеизложенному, создание специального консерванта для продленного хранения отмытых нативных эритроцитов при 4С является важной научной проблемой, разрешение которой будет способствовать повышению эффективности, а также иммунологической и инфекционной безопасности гемотрансфузионной терапии многих патологических состояний.
Цель исследования: разработка ресуспендирующего и консервирующего раствора на основе модифицированного деионизированного желатина (Модежеля) для получения и пролонгированного хранения при 4С взвеси отмытых эритроцитов, в том числе подвергнутых лейко-фильтрации.
Задачи исследования:
1. Разработать рецептуру консерванта на основе препарата Модежель.
2. Изучить физико-химические свойства взвеси отмытых эритроцитов в
предложенном консерванте Модежель-глюфосфат.
Исследовать морфофункциональные свойства отмытых эритроцитов, взвешенных в новом консерванте, в процессе их хранения при 4С.
Изучить реологические свойства взвеси отмытых эритроцитов в препарате Модежель-глюфосфат in vitro в процессе хранения.
Провести экспериментальное изучение безвредности нового консерванта на животных.
Разработать метод получения эритроцитной среды, максимально обедненной примесями лейкоцитов (путем лейкофилырации) и плазмы. Определить возможность и допустимые сроки ее хранения в консерванте Модежель-глюфосфат.
Научная новизна работы. Впервые разработан консервант для отмытых эритроцитов на коллоидной основе, обеспечивающий сохранность морфофункциональных свойств красных клеток в течение трех недель их хранения при 4С.
Доказано, что взвесь отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-глюфосфат по реологическим свойствам существенно не отличается от консервированной на «Глюгицире» донорской крови первых суток хранения, и динамика этих свойств в процессе хранения незначительна.
Новый консервант на основе Модежеля, обладающего гемодинамиче-ским, реологическим и детоксическим действием, позволяет использовать взвесь лишенных плазмы эритроцитов в течение 21-х суток хранения (вместо 24 часов по действующей инструкции).
В экспериментах на животных доказана безвредность нового консерванта (отсутствие острой и хронической токсичности препарата, аллерги-зирующего, анафилактогенного и местнораздражающего действия).
Разработан новый метод получения эритроцитной среды, максимально лишенной примеси как лейкоцитов (путем лейкофилырации), так и плазмы (последующим отмыванием).
Получены новые данные о влиянии лейкофилырации и отмывания на сохранность при 4С морфофункциональных свойств эритроцитов при консервировании их в растворе Модежель-глюфосфат. Доказана возможность хранения при 4С в предложенном консерванте отмытых после предварительной лейкофилырации эритроцитов в течение трех недель.
Практическая значимость работы и ее реализация
Разработанный эритроконсервант Модежель-глюфосфат обеспечит возможность хранения отмытых, а также профильтрованных и отмытых эритроцитов в течение 3-х недель (вместо 24-х часов) при 4С и создания
их запасов для проведения не только плановых, но и экстренных транс-фузий.
Пролонгированное хранение этих сред расширит возможности их реализации, снизит потери ценной фракции крови и позволит удовлетворить клинические потребности в обедненных лейкоцитами и плазмой эритро-компонентах.
Проведение предварительной лейкофильтрации при заготовке отмытых эритроцитов предотвратит накопление продуктов распада лейкоцитов и провоспалительных цитокинов в процессе хранения, позволит значительно повысить иммунологическую и инфекционную безопасность трансфузий этой эритроцитной среды, а также эффективность гемоком-понентной терапии анемий и кровопотери, особенно у аллосенсибилизи-рованных и трансфузионнозависимых больных.
Предложенный эритроконсервант Модежель-глюфосфат производится из доступного, недефицитного и недорогого сырья; технически возможно его получение в едином технологическом цикле с препаратом «Моде-жель», производство которого осуществлялось с 1994 г.
После разрешения ФК МЗ РФ на медицинское применение и промышленный выпуск и утверждения 08.11.2001 г. специализированной комиссией по инструкциям и номенклатуре изменения названия консерванта (Пр. № 40) разработана «Инструкция по медицинскому применению препарата Модежель-глюфосфат», представленная в ФК.
Препарат запатентован (патент на изобретение №2225692), зарегистрирован в Государственном реестре изобретений РФ 20.03.2004 г.
Разработана «Временная инструкция по методу заготовки эритроцитной массы, максимально лишенной примесей лейкоцитов (путем фильтрования) и плазмы (путем отмывания)», одобренная решением Ученого совета и утвержденная директором РосНИИГТ 20.11.2001г.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Раствор модифицированного деионизированного желатина является оптимальной основой консервирующих растворов для нативных, отмытых и профильтрованных эритроцитов. Введение в состав консерванта для нативных эритроцитов Модежель глюкозы (7 г/л) и натрия фосфата двузамещенного (4 г/л) повышает его консервирующие свойства в отношении отмытых эритроцитов и обеспечивает сохранность их морфофункциональных и реологических свойств в течение 21-х суток при 4С.
Разработанный эритроконсервант Модежель-глюфосфат обусловливает гемодинамическое, реологическое и детоксическое действие взвеси отмытых эритроцитов.
Новый препарат обеспечивает возможность хранения при 4С не только отмытых нативных эритроцитов, но и наименее иммуногенной и реактогенной эритроцитной среды - профильтрованных и отмытых эритроцитов - в течение 3-х недель. Взвесь профильтрованных отмытых эритроцитов в Модежель-глюфосфате после 21 суток хранения практически не содержит микросгустков и продуктов деградации лейкоцитов (миелопероксидазы и лактоферрина).
Морфофункциональная полноценность предлагаемых эритроцитных сред и безвредность нового консерванта обусловливают их пригодность для переливания больным. Эффективная лейкоредукция взвеси отмытых эритроцитов, подвергнутых предварительной фильтрации через отечественные лейкофильтры, обеспечивает ее максимальную иммунологическую и инфекционную безопасность.
Апробация и публикация материалов исследования. Основные положения диссертации обсуждены на научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 6-8 июня 2000 г.), на Российской научно-практической конференции, посвященной 70-летию РосНИИГТ (Санкт-Петербург, 18-20 июня 2002 г.), 12-ой международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 24-28 мая 2004 г.) и на Российской научно-практической конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 8-Ю июня 2004 г.).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Личное участие автора в получении результатов. Автор непосредственно участвовала в заготовке взвесей отмытых, а также профильтрованных и отмытых эритроцитов; в изучении их основных морфофунк-циональных и реологических свойств в процессе хранения; в организации доклинического исследования консерванта; в анализе и статистической обработке полученных данных.
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 168 страницах
машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Работа иллюстрирована 34 таблицами и 2 рисунками.
Библиографический указатель содержит 103 отечественных и 196 иностранных источников литературы.
Изменения физических и биохимических параметров эритроцитов в процессе консервирования, методы их исследования
Согласно современным представлениям, несовместимость тканей донора и реципиента вызывает развитие сенсибилизации к различным антигенам, представленным на клетках крови. Центральную роль в аллоиммунизации играют антигенггоезентирующие (дендритные, мононуклеарные) клетки донора, дающие начало Т-зависимому иммунному ответу (130, 155). Взаимодействие между HLA-антигенами II класса и Т-клетками вызьгеает продукцию как антиген-презентирующилга клетками, так и Т-лимфоцитами цитокинов (г. о. ИЛ-2 и ИЛ-4), инициирующих выработку и дифференцировку аллоантиген-специфичных Т-лимфоцитов, которые, в свою очередь, вызывают продукцию антител В-лимфоцитами и их пролиферацию. Аллоиммунизация обычно ассоциируется с длительными курсами гемотрансфузии (81). По-видимому, каждая трансфузия индуцирует в некоторой степени клоиальную экспансию (расширение клонов Т- и В-лимфоцитов, специфичных к аллоантигенам), но она недостаточна для синтеза персистирующих антител; последующие гемотрансфузии расширяют число клеток иммунной памяти и, наконец, их количество достигает критического уровня, поддерживающего присутствие высокореактивных антител даже при отсутствии аллоиммунизирующих воздействий (257, 258).
Посттрансфузионная первичная аллоиммунизация наблюдается у 2,2-3,6% реципиентов, а в случае предшествующих трансфузий - у 3,6-17,4% (99). Минимальная доза, способная вызвать аллоиммунизацию составляет 1 миллион лейкоцитов (155).
Роль лейкоцитов в возникновении посттрансфузонных реакций у пациентов с лейкоцитарными антителами была показана еще Brittingham, Chaplin (1957). К ним относятся в первую очередь фебрильные негемолитические реакции, которые характеризуются повышением температуры на 1 и более, связанным с переливанием гемокомпонентов. Степень температурной реакции зависит от числа перелитых несовместимых лейкоцитов (238). Минимальное количество лейкоцитов, достаточное для развития подобного осложнения у аллоиммунизированных пациентов продолжает обсуждаться в литературе, но в большинстве случаев считается, что присутствие в клеточных компонентах крови лейкоцитов ниже уровня 0,5х109 предотвращает возникновение реакций (13, 136, 292).
Частота встречаемости лихорадочных реакций при переливании эритроцитсодержащих сред составляет, по данным различных авторов, 0,2-6,8% (13, 173, 206, 224, 285). У детей негемолитические температурные реакции наблюдаются в 12% случаев уже после первой трансфузии (83). Наиболее часто фебрильные реакции встречаются у пациентов, аллоиммунизированных в результате предшествующих гемотрансфузий, беременностей и пересадки органов.
В последние годы установлено, что наряду с хорошо известными антигенами системы HLA, аллоиммунизацию могут вызьшать специфичные антигены гранулоцитов (HNA-la, HNA-lb, HNA-lc и другие), моноцитов и тромбоцитов (20, 217). Неизвестно, какие из антител играют более важную роль в развитии фебрильных реакций. По данным одних исследований - гранулоцитспецифичные антитела, вызывающие наиболее тяжелые реакции (155), другие сообщения указывают на преобладающую роль HLA - антител, особенно I класса (145, 246).
Существует предположение, что лихорадочные реакции, обусловленные наличием лейкоцитарньгх антител у реципиента, возникают в связи с выделением интерлейкина 1 (ИЛ-1) из лейкоцитов донора, который непосредственно стимулирует синтез простогландинов (PGE2) в гипоталамусе, что сопровождается повышением температуры (224). Однако появилась и противоположная гипотеза, согласно которой макрофаги реципиента активизируются комплексами антиген -антитело - комплемент и выделяют цитокины с пирогенными свойствами (151).
В настоящее время значительная роль в развитии посттрансфузионных фебрильных реакций при отсутствии аллоантител отводится цитокинам, накапливающимся в гемотрансфузионной среде при хранении (114, 174).
Увеличение концентрации цитокинов может быть обусловлено как их усиленньш синтезом активированным лейкоцитами, так и пассивным выходом из поврежденных клеток (298). Полагают, что ИЛ-1, ИЛ-6 и ФНО являются основными причинами посттрансфузионных фебрильных реакций (225, 269).
Накопление пирогенных цитокинов в клеточных гемокомпонентах по мере увеличения сроков их хранения отмечено многими исследователями (113, 138, 174, 222). Показано, что их концентрация зависит от содержания лейкоцитов, срока и температуры хранения гемокомпонентов. В механизме накопления цитокинов определенную роль играет апоптоз и/или активация моноцитов во время производства гемокомпонентов (174).
Однако следует отметить, что, по данным значительного числа исследований, концентрации провоспалительных цитокинов в большинстве эритроцитсодержащих сред при хранении остаются сравнительно низкими (157, 174). В эритроконцентрате определяются лишь незначительно увеличенные уровни ИЛ-8 и ИЛ-1 после 42 дней хранения при 4С (266). Показано, что аккумуляция ИЛ-8 не может быть полностью предотвращена лейкофильтрацией, так как, возможно, сами эритроциты являются источником этого цитокина. Известно, что эритроцитарные антигены Fy а и Fy являются рецепторами для ИЛ-8, и существует гипотеза, что предварительно связанный с ними ИЛ-8 освобождается в процессе хранения гемокомпонента, однако концентрация его невысока (290). Хранение при 4С снижает клеточный метаболизм свыше, чем на 90%, что может объяснить ограниченное увеличение уровней цитокинов. Наиболее вероятно, что это увеличение не имеет особого клинического значения, за исключением случаев тяжелых ожогов и инфекций у критически больных, особенно после массивных трансфузий (224).
Удаление 75-90% лейкоцитов из эритроконцентрата связано со значительным снижением случаев фебрильных реакций у большинства пациентов (158, 206, 292).
Трансфузии тромбоцитов пациентам, иммунизированным к HLA-антигенам (в 90% случаев) или специфичным антигенам тромбоцитов, могут сопровождаться не только развитием посттрансфузионных негемолитических фебрильных реакций, но и приводить к отсутствию прироста или даже снижению числа тромбоцитов после переливания. Это связано с тем, что антигены донора образуют иммунные комплексы с антитромбоцитарными антителами реципиента на поверхности аутологичных тромбоцитов, разрушая их по типу цитотоксической иммунной реакции (83). Таким образом, трансфузии тромбоцитов аллоиммунизированным пациентам обречены на неудачу и не способны предотвратить или прекратить тромбоцитопенические кровотечения. Около 50% пациентов, подвергавшихся многократным трансфузиям, становятся рефрактерными к тромбоцитам, что ограничивает клиническую эффективность такой терапии (172, 210, 228, 256). Точный механизм аллоиммунизации к тромбоцитам неизвестен, но, поскольку тромбоциты экспрессируют антигены HLA только I класса, существует мнение, что требуются антигенпрезентирующие клетки, несущие HLA антигены как I, так и II класса (присутствующие в донорских компонентах крови), чтобы инициировать иммунную реакцию у реципиента (через CD4 - продукцию цитокинов -стимуляцию В-лимфоцитов - продукцию аллоантител) (130).
Методы оценки консервирующих свойств эритроконсервантов и эффективности удаления лейкоцитов и плазмы
Эритроциты, взвешенные в растворе декальцинированного желатиноля, на 20-е сутки хранения имели 24-часовую приживаемость более 70%. Однако этот препарат имел ряд технологических и других недостатков (нестабильность молекулярной массы и ионного состава). Дальнейшие разработки привели к созданию эритроконсерванта на основе раствора модифицированного деионизированного желатина (Модежеля). Модежель успешно использовался в качестве кровезаменителя гемодинамического действия, для заполнения аппаратов искусственного кровообращения (75, 77). Препарат технологичен в производстве; при хранении в нем эритроцитов обеспечивает сохранение более 76% АТФ от исходного уровня и 79%-ую суточную приживаемость к 21 суткам. По экспериментальным данным, взвесь эритроцитов в МДЖ (в соотношении 1:1) при лечении массивной кровопотери обеспечивает выраженный гемодинамический эффект, снижает вязкость крови, особенно при малых скоростях сдвига, за счет специфического дезагрегирующего действия и реологической активности раствора желатина, что способствует улучшению микроциркуляции (74, 76, 78, 94, 103). Существует предположение, что молекулы Модежеля (средняя ММ составляет 13000-20000) образуют вокруг эритроцитов адсорбированные слои, достаточно прочно связанные с клеточной поверхностью. Так как конформация молекул Модежеля соответствует конформации статистического клубка, подобная защитная «пленка» равномерно распределена вокруг эритроцитов и может усиливать отрицательный поверхностный заряд взвешенных в растворе клеток, а также предупреждать непосредственное воздействие на мембрану различных биологически активных веществ, образующихся в процессе хранения.
Доказано, что Модежель в значительной степени замедляет процесс везикуляции ресуспендированных в нем клеток и обеспечивает большую устойчивость клеточной мембраны. Кроме того, он обладает детоксикационным действием (снижает показатели перекисного окисления липидов и содержание молекул средней массы) и корригирует кислотно-основное состояние крови реципиента. Созданный на его основе консервант Модежель-АФ (с добавками аденина и фосфата) обеспечивает пролонгированное хранение нативных эритроцитов (до 42 суток) (46, 75, 79).
За рубежом выпускается ряд кровезаменителей на основе желатина с более высокой молекулярной массой (34000-40000) и стабильным молекулярно-массовым распределением коллоида, такие как геможель (Германия), плазможель (Франция), желофузин (Швейцария), гелофузин (Германия) (30, 101). Однако эти препараты не используются в качестве основы эритроконсерванта, в отличие от Модежеля.
О целесообразности создания специального ресуспендирующего и консервирующего раствора для отмытых эритроцитов упоминалось еще в работе В.Н. Мельниковой 1961г. (40). В отличие от эритроцитных сред на основе нативных клеток, взвеси отмытых эритроцитов практически полностью лишены плазмы и компонентов гемоконсерванта, что необходимо учитывать при разработке такого раствора. Изучая этот вопрос, Meryman показал, что наличие или отсутствие альбумина в ресуспендирующем растворе не влияет на параметры in vitro во время хранения, а отмывание красных клеток большими объемами фосфатного раствора оказывает благотворное воздействие на их жизнеспособность при последующем хранении в этой среде (ARC-8, содержащей цитрат, фосфат, глюкозу и аденин). Удаление хлора из ресуспендирующей среды, по его мнению, коррелирует с повышением уровня 2,3-ДФГ во время хранения за счет увеличения внутриклеточного рН, обеспечивает концентрацию этого соединения выше исходных цифр и сохранность АТФ в течение 6 недель (211).
D.Strauss с соавт. (272) рекомендовали в качестве консерванта для отмытых эритроцитов предложенный ими для хранения нативных клеток раствор с аденином и гуанозином - ACD-Ag. Не имея фактического материала, они полагали, что в этом растворе отмытые красные клетки могли бы сохраняться некоторое время.
J.A..Silbert (262) на основании экспериментальных данных предложил отмьшающий и консервирующий солевой раствор, содержащий аденин, натрия гидрофосфат и глюкозу (с осмолярностью 340 мОсм/л). Отмывание производилось 4-х кратно. Содержание остаточных лейкоцитов в отмытых эритроцитах оказалось равным 17%, белка - 0,0024% от исходного уровня. 24-часовая приживаемость отмытых эритроцитов на 21 сутки хранения при 4С была такой же, как и при хранении в плазме (78%). Не было существенных различий и в содержании АТФ. Однако процент гемолиза в опыте равнялся 1,8, что выше допустимого уровня (0,8).
D. Mazor в 1990 г. применил для хранения отмытых эритроцитов раствор Meryman №6, а также его модификации (без аммония хлорида и с заменой его хлоридом рубидия). Все эти растворы позволили поддерживать приемлемый уровень АТФ в течение 8 недель, однако приживаемость эритроцитов в этих исследованиях не изучалась (205).
G.L. Moore с сотрудниками сравнили действие лицензированного раствора AS-3 и экспериментального AS-17 при хранении в них размороженных и отмытых эритроцитов при 4С. AS-17 состоял из двух частей: двузамещенного фосфата натрия и цитрата натрия в 10 мл воды и аденина, глюкозы и лимонной кислоты в 50 мл дистиллированной воды. РН объединенного раствора составил 8,3; рН взвеси в нем эритроцитов - 6,95. Этот раствор обеспечил лучшую жизнеспособность эритроцитов на 21 сутки хранения in vitro, по сравнению с AS-3 (более высокие уровни 2,3-ДФГ, АТФ, р50, рН), однако 24-часовая приживаемость эритроцитов была одинаково высокой (более 77%) в обоих растворах, и оба они были рекомендованы для использования в качестве консервантов для 3-х недельного хранения (220).
Предложенный ранее В.А. Myhre и C.S. Marcus для оттаянных и отмытых эритроцитов раствор CPDA-1 обеспечивал их сохранность в течение 2-х недель (227). Такой же срок хранения при 4С допускал и отечественный консервант ЦОЛИПК 86, примененный для взвешивания отмытых после осаждения в градиенте плотности желатина обедненных лейкоцитами эритроцитов (42).
В. Zavizion et al. в эксперименте хранили в AS-1 и AS-3 обработанные инактином красные клетки крови после автоматического отмывания (299).
В сообщении G. Matthes с сотрудниками (204) указывалось возможность омоложения хранившегося с SAGM эритроконцентрата путем отмывания его безхлоридным глюкозо-аденин-фосфат-цитратньгм консервантом с последующим дополнительным хранением в этом растворе в течение 21 суток.
Следует отметить, что описанные выше экспериментальные растворы на глюкозосолевой основе для хранения отмытых эритроцитов не лицензированы и не нашли применения в практической трансфузиологии. Сведения об использовании в данном качестве коллоидных растворов в изученной нами литературе отсутствуют.
Поэтому разработка доступного, дешевого и эффективного консерванта, предназначенного специально для эритроцитов, максимально лишенных примесей плазмы, лейкоцитов и тромбоцитов, остается весьма актуальной задачей трансфузиологии.
Исследование возможности хранения отмытых эритроцитов в консерванте Модежель-АФ при 4С
Введя в формулу известные значения, получили некоторую постоянную для каждого капилляра величину (в нашем случае она равнялась 763), разделив которую на время перемещения мениска жидкости на участке L, моншо вычислить величину у. Зная скорость сдвига (у) и вязкость (ц) известной жидкости (сахарозы), можно рассчитать значения напряжения сдвига (т) из формулы: TJ т/у. Для каждого из выбранных углов наклона капилляра напряжение сдвига является постоянной величиной, что моншо использовать при исследовании вязкости крови и взвесей эритропитов.
По формуле Кессона : т1/2 = то1/2 + К у1/2 (1), где т - напряжение сдвига, Па; то - минимальное напряжение сдвига, Па; у - скорость сдвига, с" ; К - коэффициент вязкости, определяя скорости смещения мениска крови (взвеси) в капилляре при углах его наклона к горизонту 90, 25, 15, 10 и 5, строится график зависимости скорости сдвига исследуемой среды от напряжения сдвига.
Далее, по графику или математически, решая уравнение Кессона попарно для последовательно взятых показателей зависимости т = f (у ) при разных углах наклона, как уравнение с двумя неизвестными, можно определить значения показателей То и К. Затем, используя формулу Кессона, можно рассчитать величину вязкости (п) для фиксированных скоростей сдвига. Таким образом нами определялась вязкость крови и взвесей эритроцитов при скоростях сдвига 1с", 9с"1, 25с"1, 100 с"1 и 180 с"1. Показатель агрегации эритроцитов (А) рассчитывался по формуле (4, 71): A = x0/(Ht-5)3, Па, где: то - минимальное напряжение сдвргга, мПа; Ht - гематокрит в процентах. Односекундная структурная вязкость среды ((X) определялась по формуле (71): а =_шгц/1,3 /Ht, мПа-с, где: rji - вязкость крови при скорости сдвига 1с"1; Ht - гематокрит в JDrrpax на литр. Кессоновская вязкость (К2) представляет собой квадрат коэффициента вязкости из формулы Кессона (1). Индекс деформируемости эритроцитов в потоке плазмы (ТУ) определяли по формуле: TK=t]r 4-l/Tir0-4xHt, где: пг - относительная вязкость при высоких скоростях сдвига, Ht - гематокрит в литрах на литр (S.Chien, L. Dintenfass). Индекс деформируемости эритроцитов при фильтрации, приведенный к нулевому значению ШДЭр) определялся при помощи оригинального прибора (Попов В.И., Тулупов А.Н., Лыткин М.И. Авторское свидетельство на изобретение № 1462201), позволяющего измерять время фильтрования небольших объемов взвеси эритроцитов (0,02 мл эритроцитов в 10 мл Модежеля) под давлением 19,9-22,8 мм рт. ст. через целлюлезо-ацетатный фильтр (Sartorius AG, Germany) с диаметром пор 5 цт, близким к диаметру капилляров микроциркуляции (64). Вычисляя последовательно разницу во времени протекания через фильтр каждого из 4-х миллилитров ресуспендирующей среды (Модежеля) и исследуемой взвеси, логарифмируя данные и решая уравнение регрессии (W=ABX, после логарифмирования приведенное к форме уравнения прямой: log W = log А + log ВхХ) при помощи программного обеспечения (Scientific Programmable Calculator, CITIZEN, SRP-175), мы определяли значение индекса деформируемости эритроцитов, приведенное к 0 (при постоянном давлении). 2.2.4. Методики, использованные для изучения безвредности эритроконсерванта Морфологический состав крови животных. Определение количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов проводилось обычным пробирочным и меланжерным способами с помощью камеры Горяева. Содержание гемоглобина определяли спектрофотометрически. Лейкоцитарная формула подсчитывалась в мазках, окрашенных краской Лейтямана; мазок просматривался под иммерсией. Регистрировали также цветной показатель, гематокрит, СОЭ, процент ОНЭ.
Биохимический состав крови животных. Часть исследований производили на аппарате ФП-901М. Определяли: концентрацию белка сыворотки, белковые фракции, билирубин, мочевину, креатинин, сахар, АлАТ, АсАТ. В некоторых сериях опытов эти же показатели изучали с использованием следующих методик: - содержание общего белка в сыворотке крови по методу Лоури; - содержание и соотношение альбумина и глобулина в сыворотке крови методом высаливания; - активность аминотрансфераз (АЛТ и ACT) по методу Рейтмана и Френкеля; - содержание в крови креатинина кинетическим методом без протеинизации; - содержание в сыворотке крови мочевины диацетилмонооксимньш методом с помощью набора тестов фирмы «Лахема»; - содержание в крови холестерина энзиматическим колориметрическим методом; - концентрация в крови глюкозы энзиматическим глюкозооксидантным методом. При исследовании свертывающей системы крови животных определяли: время свертывания крови, индекс АПТВ (активированное парциальное тромбопластиновое время), время рекальцификации плазмы, концентрацию фибриногена в плазме, протромбиновый индекс, тромбиновое время.
Исследование мочи животных, включало определение суточного количества, удельной плотности, кислотности, содержания белка методом Робертса-Столышкова, сахара (качественной пробой - глюкотестом), желчных пигментов (по методу Розина), уробилина (методом Богомолова); производили микроскопию мочевого осадка. Изучение сердечно-сосудистой системы. Анализировали ЭКГ, записанную во II отведении со скоростью 25 мм/с на кардиографе ЭК П 04. ЭКГ регистрировали до введения препарата и на следующий день после полного курса инфузий.
Гистологическое исследование органов и тканей животных. Для гистологического исследования при вскрытии брали кусочки сердца, легкого, печени, почек и селезенки; взятый материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина; готовили замороженные и парафиновые срезы, которые окрашивали гематоксилин-эозином.
Для определения местного действия препарата Модежель-глюфосфат производили гистологическое исследование кусочка уха кролика с краевой веной, в которую вводили препарат.
Результаты исследований были обработаны математико-статистическими методами, подробно изложенными в соответствующей литературе (П.В. Рокицкий. Основы вариационной статистики для биологов. - Минск, 1961), поэтому кратко приводим основные приемы статистической обработки. Анализ полученных данных начинался с определения средней арифметической (X) по формуле: X = V / п, где: п - число наблюдений; V -значение варианты; знак суммирования. Для вычисления средней ошибки средней арифметической (S) применяли формулу: S = а / Vn, где: п - число наблюдений; о - среднее квадратическое отклонение, определяемое с помощью программного обеспечения (Scientific Programmable Calculator, CITIZEN, SRP-175) или по формуле: с = V (V - X)2 / п, где: (V - X) - отклонение отдельных вариант от средней арифметической, п - число наблюдений. Для сравнения средних значений двух совокупностей применяли критерий Стьюдента, вычисляемый по формуле: t = X1-X2/VSx12 + Sx22 По таблице определяли вероятность различий (р). О статистической достоверности различий свидетельствовал показатель р 0,05 и р 0,01.
Изучение сохранности морфофункциональных свойств взвеси отмытых эритроцитов в растворе Модежель-глюфосфат в процессе хранения при4С
Следует отметить, что реологические свойства отмытых эритроцитов, хранившихся в Модежеле и Модежель-глюфосфате, изменялись в значительно меньшей степени и эти изменения не были статистически достоверными. Особенно это касалось взвеси красных клеток в предложенном консерванте. Через три недели
хранения рассчитанная с учетом гематокрита односекундная вязкость (а) взвеси в Модежель-глюфосфате не превысила соответствующий показатель консервированной крови первых суток хранения (в опытном растворе в 1-е сутки она равнялась 7,45; на 21-е сутки - 7,91; в контроле - 8,21 мПа с), динамическая вязкость при средних и высоких скоростях сдвига была недостоверно выше вязкости свежезаготовленной крови, но ниже соответствующих показателей взвеси в Модежеле. Минимальное напряжение сдвига (характеризующее порог дезагрегации эритроцитов) при хранении отмытых красных клеток в растворах на основе Модежеля увеличилось недостоверно и осталось ниже, чем в консервированной крови 1-х суток хранения.
Показатель агрегации эритроцитов (А) также по мере хранения в растворе Модежель-глюфосфат существенно не изменился (0,346x10 Па через 21 сутки против 0,227x10"6 Па в 1-й день) и остался недостоверно ниже, чем в свежей крови (0,488±0,176х10"6 Па).
Индекс деформируемости эритроцитов в потоке плазмы (Тк) - показатель, хараістеризующий ригидность красных кровяных клеток в потоке (на его величину оказывает влияние вязкость самой среды), - в результате отмывания и консервирования увеличился незначительно, статистически недостоверно.
Деформируемость эритроцитов, хранившихся в растворах Модежель и Модежель-глюфосфат в течение трех недель (в отличие от взвеси в физиологическом растворе) практически не изменилась в отрицательную сторону, что проявилось даже некоторым снижением средних значений ИДЭо. Полученные данные свидетельствуют о благоприятном действии разработанного консерванта для отмытых эритроцитов Модежель-глюфосфата на реологические свойства взвеси. Так, агрегация эритроцитов на 21-е сутки хранения при 4С была близкой к норме (А = 0,346 ± 0,189хЮ"6 Да), структурная односекундная вязкость соответствовала нормальным показателям (ГХ = 7,91 ± 0,854 мПа с), кессоновская вязкость равнялась 4,77±0,251 мПас, индекс деформируемости эритроцитов не увеличился.
Таким образом, взвеси отмытых эритроцитов в коллоидных препаратах -Модежеле, а особенно в Модежель-глюфосфате даже после хранения по реологическим свойствам практически не отличалась от взвеси эритроцитов в аутоплазме, приближаясь к свойствам нативных клеток.
Из вышеизложенного следует, что использование предложенного консерванта, обладающего за счет высоких коллоидно-осмотических свойств гемодинамическим, а также реологическим и детоксическим действием, позволит применять взвешенные в нем отмытые эритроциты по показаниям не только при лечении анемий, но и для восполнении кровопотери. В последнем случае представляется важным и низкое содержание в эритроцитной среде микросгустков.
В перспективе применение нового консерванта для отмытых эритроцитов будет способствовать обеспечению клинических потребностей в этой эритроцитной среде, расширит возможности ее применения, снизит частоту постгрансфузионных реакций и осложнений.
Для решения вопроса о возможности клинического применения разработанного эритроконсерванта следовало провести его доклиническое исследование
В экспериментах были использованы стандартные опытно-производственные серии Модежель-глюфосфата, полученные по разработанной технологии, обеспечивающей стерильность и апирогенность раствора. Состав и физико-химические свойства препарата соответствовали требованиям проекта ВФС, разработанным в процессе создания технологии получения Модежель-глюфосфат. Исследования проводили в опытах на мышах, беспородных белых крысах, кроликах породы Шиншилла, морских свинках, беспородных собаках в соответствии с «Методическими рекомендациями по экспериментальному изучению противошоковых заменителей направленного и полифункционального действия» (М, 1984) и «Требованиями к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ» (М., 1984). Были учтены также «Правила доклинической оценки безопасности фармакологических средств» (М., 1992). Исследования проводились с участием лабораторий экспериментальной патологии (ст. н. сотр. К.А. Гербут), свертывания крови (гл. н. сотр., проф. Л.П. Папаян), клинической (зав. лаб. В.В. Куралева) и патологоанатомической (рук. лаб. В.И. Ругаль).
