Введение к работе
Актуальность работы.
Клиническая трансплантология является сегодня одной из быстро развивающихся высокотехнологичных и многопрофильных областей современной медицины. Успешность операций проводимых клиническими трансплантологами зависят во многом от эффективности внедрения совремешшх иммуно- и молекулярно-гснетических методов. Таковыми на данный момент являются иммуногенетическое тестирование при подборе совместимых пар донор-реципиент и мониторинг вирусных инфекций в условиях посттрансплантационной иммуносупрессии.
К сожалению, на сегодняшний день количество операций по трансплантации органов в России крайне мало: за 2008 год - 29 трансплантаций сердца, 73 трансплантации печени, не более 800 трансплантаций почек, причём 4/5 общего числа операций выполняется в Москве. Потребность в подобных операциях в сотни раз выше.
Развитие клинической трансплантологии в России напрямую зависит не только от эффективной работы лечебных центров, создания единого организационного механизма обеспечения донорскими органами, от совершенствования законодательной базы, включающей организационно-правовые и этические аспекты донорства, но и от координации усилий ученых и врачей в создании отечественных реагентов, необходимых для развития данной области медицины.
Разработанный в ходе данной работы метод типирования локуса HLA-DRB1 на основе метода ПЦР в реальном времени позволяет существенно сократить время анализа, снизить трудоёмкость и минимизировать риск контаминации лаборатории продуктами ПЦР. Кроме того, в отличие от существующих сегодня отечественных реагентов и большей части импортных аналогов, разработанный метод может быть полностью автоматизирован, что имеет принципиальное значение как с точки зрения снижения влияния человеческого фактора, так и при организации лабораторий ориентированных на проведение больших объемов исследований. Из этого следует, что данный метод может эффективно использоваться как в случае типирования посмертных доноров при органной трансплантации, когда требуется быстрое
получение результата, так и в случае создания регистров доноров костного мозга, когда требуются масштабные скрининговые исследования.
Проведенное генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожидания пересадки Московского координационного центра оргаїшого донорства, показало, что результаты типирования могут нести не только практическое значение, но и являться базисом для теоретических выводов. На основании полученных результатов установлено достоверное превышение процента HLA-DRB1 гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотами гомозигот в популяции. В ходе данной работы обоснована целесообразность использования метода селективного подбора HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.
Кроме того, на единой технологической основе разработаны реагенты, позволяющие проводить мониторинг наличия и количества возбудителей латентных инфекций, что является необходимым требованием в условиях посттрансплантационной иммуносупрессии.
В последнее время в научной литературе появляется всё больше публикаций подтверждающих, что в случае подбора пары донор-реципиент при пересадке кроветворных стволовых клеток требуется учитывать совпадение донора и реципиента по гену MIC-A, так как отсутствие такового приводит к реакции отторжения «трансплантат против хозяина». В ходе данной работы был разработан и апробирован на популяционной выборке метод типирования гена MIC-A, который в перспективе может быть внедрен в рутинную практику клинической трансплантологии.
Цель исследования.
Разработать комплекс ключевых иммуно- и молекулярно-генетических методов, необходимых для лабораторного обеспечения клинической трансплантологии.
Задачи исследования.
1. Разработать и апробировать метод типирования локуса HLA-DRB1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.
2. Провести анализ эффективности подбора доноров почки для гомозиготных по HLA-
DRB1 реципиентов.
Разработать и апробировать метод количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК.
Разработать и апробировать метод типирования гена MIC-A на уровне групп аллелей.
Научная новизна работы.
Впервые в отечественной практике разработана методика типирования локуса DRB1 на уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени.
Проведено генотипирование образцов ДНК, выделенных из клеток крови реципиентов листа ожидания пересадки Московского координационного центра органного донорства. Впервые установлено достоверное превышение процента HLA-DRB1 гомозигот среди реципиентов клиники трансплантации почки по сравнению с частотой гомозигот в популяции. Обоснована целесообразность использования метода селективного подбора HLA-DRB1 гомозиготных доноров для HLA-DRB1 гомозиготных реципиентов.
Впервые в отечественной практике разработана методика комплексного количественного определения латентных инфекций HSV 1 и 2, CMV, EBV, ВК на основе метода ПЦР в реальном времени.
Впервые получены данные о частоте встречаемости аллелей генов HLA MIC-A в русской популяции среди здоровых индивидуумов. Созданные молекулярно-генетические реагенты доступны для широкого применения в клинической трансплантологии, а также позволяют проводить исследования роли HLA-полиморфизма в таких прикладных разделах иммуногенетики как: HLA и аутоиммунные заболевания, HLA и инфекционные заболевания, HLA и репродукция. Также данные реагенты могут использоваться в популяционно-генетических исследованиях.
Практическая значимость работы.
Молекулярно-генетические компоненты для типирования локуса DRB1 на
уровне групп аллелей на основе метода ПЦР в реальном времени, как и возможность быстрого и точного определения вирусной нагрузки в образцах, взятых у пациентов трансплантологических отделений открывают принципиально новые возможности в области прикладной клинической трансплантологии. Низкая трудоёмкость и быстрота получения результатов делают первый из приведённых методов, незаменимым для быстрого подбора пар «донор-реципиент» при органной трансплантации. Возможность автоматизировать работу лаборатории для массового генотипирования послужит предпосылкой для создания крупных регистров доноров, необходимых для проведения пересадок кроветворных стволовых клеток. Именно последний вид трансплантации на сегодняшний день является не только методом радикального лечения целого ряда онкогематологических заболеваний среди взрослого и детского населения, но и методом лечения последствий радиационного и химического поражения кроветворной и иммунной систем человека.
В мире в настоящее время трансплантации кроветворных стволовых клеток проводятся при полной HLA совместимости между донором и реципиентом. Под полной HLA совместимостью понимается совместимость по генам HLA класса I (А, В, С локусы); HLA класса И генов DRB1, DQB1. Желательна совместимость по генам HLA DPB1 (класс II) и М1С-А(класс I). Анализ последних литературных данных позволяет предположить, что совместимость по гену MIC-A в ближайшее время будет также признана необходимой. В этом случае разработанный метод типирования аллелей гена MIC-A будет востребован не только иммуногенетиками и популяционными генетиками, но и клиническими трансплантологами.
Работа выполнялась в рамках заданий ФМБА по темам: «Разработка оригинальных тест-систем на основе молекулярно-генетических методов в интересах ФМБА России для обеспечения биобезопасности населения^ в условиях возможного радиационного и/или химического поражения: скринингового HLA-генотипирования потенциальных доноров кроветворных стволовых клеток» (2006-2008гп), «Разработка биомедицинской технологии HLA- типирования, отвечающей международным стандартам, для использования в системе ФМБА России при лечении профессиональных заболеваний» (2007-2009гг.), а также международного проекта «Разработка иммунотерапевтических стратегий для лечения гематологических и
неопластических заболеваний на основе оптимизированных аллогенных пересадок стволовых клеток», участником которого является ГНЦ «Институт иммунологии ФМБА России». Работа финансово поддерживалась грантами Федеральной целевой научно-технической программы ((Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы (проекты ЖС-КП.5/002 и 2006-РИ-34.0/002/081) и «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (проекты 2007-2-2.2-04-04 и 2007-2-1.2-04-02-116).
Публикации.
Материалы диссертации изложены в 13 публикациях, в том числе 1 публикация в научном издании, рекомендованным ВАК для опубликования научных результатов диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук, 5 статьях в научной печати, 7 публикациях в материалах отечественных и зарубежных конференций и конгрессов.
Структура и объем работы.
