Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 5
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 30
Глава 3. ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ СЫРЬЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ТРОМБОПЛАСТИНА РАСТВОРИМОГО 38
3.1. Получение высокоактивного сырья 38
3.1.1. Определение условий взятия, отмывки и хранения сырья 38
3.1.2. Отработка режимов получения и хранения гомогенатов 42
3.1.3. Выбор режимов экстракции тромбопластически активных веществ 43
3.2. Условия сохранения активности сырья до и во время сублимационной сушки 49
3.2.1. Исследование свойств реагента, приготовленного без использования ограждающих веществ 49
3.2.2. Изменение активности и рН в зависимости от использованных ограждающих веществ 52
3.2.3. Выбор объема продукта во флаконе 62
Глава 4. ПОЛУЧЕНИЕ ТРОМБОПЛАСТИНА РАСТВОРИМОГО И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО КАЧЕСТВА В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ 63
4.1. Отработка режимов замораживания и сублимационного высушивания 63
4.2. Технология получения реагента тромбопластина растворимого...66
4.3. Изучение качества реагента 72
4.3.1. Оценка активности, рН и остаточной влажности 72
4.3.2. Исследование чувствительности к дефициту факторов VII и X 75
4.3.3. Определение Международного индекса чувствительности тромбопластнна растворимого 77
4.3.4. Оценка сопоставимости результатов исследований при применении различных тромбопластинов 81
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 84
ВЫВОДЫ 95
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 97
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 98
Введение к работе
Актуальность
Нарушения системы гемостаза сопутствуют многим заболеваниям и патологическим состояниям. Для их диагностики и коррекции необходимы информативные и стандартизованные методы исследований, основанные на применении качественных диагностических реагентов. Одним из наиболее широко распространенных тестов, обязательных для выполнения в клинико-диагностических лабораториях, является определение протромбииового времени (принцип Квика). Метод широко используется для скринингового исследования свертывающей системы крови, контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия (АНД) и диагностики заболеваний печени.
Для его воспроизведения применяется целый спектр тромбопластиновых реагентов, выпускаемых в основном многочисленными зарубежными фирмами. Результаты исследований, полученные при их применении, бывают трудно сравнимы из-за различий в активности и чувствительности реагентов, особенно к низкому уровню факторов свертывания, в том числе тех, которые снижаются под воздействием антикоагулянтов - антагонистов витамина К.
Для обеспечения объективности результатов исследований протромбииового времени и современных способов его выражения необходимо применение тромбопластинов, которые стандартизованы согласно требованиям Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ). Они должны обладать чувствительностью к дефициту фактора VII, белкам PIVKA, не содержать гемоглобин и инфекционные агенты, быть стабильными и откалиброванными по Международному референтному тромбопластину с определением Международного индекса чувствительности (МИЧ).
На качество исследований протромбинового времени влияет также то, что во многих лабораториях определение проводится пробирочными способами и аппаратными, с использованием полуавтоматических и автоматических коагулометров. Воспроизведение метода с помощью приборов облегчает проведение исследований и снижает вариацию результатов; однако, их применение предусматривает использование в тест-системах коммерческих реагентов особо высокого качества, имеющих длительный срок годности (140, 141, 152, 153).
Наиболее широко используются реагенты тромбопластина, приготовленные из тканей организма млекопитающих; в последние годы применяются также рекомбинантные тромбопластины. В настоящее время один из существующих Международных референтных тромбопластинов (rTF/95) также является человеческим рекомбинантным; он рекомендован экспертами ВОЗ в качестве референта производителям тромбопластинов.
При определении протромбинового времени многие отечественные КДЛ используют нерастворимые тромбопластины, которые нестандартны, так как для приготовления рабочего раствора они требуют проведения дополнительных манипуляций, снижающих качество конечных результатов. Растворимые формы реагентов сокращают время проведения исследований и повышают их точность, а также обеспечивают возможность калибровки и выражения результатов не только в %ПИ, но и в единицах Международного нормализованного отношения (MHO), величину которого необходимо определять при контроле терапии АНД.
Поскольку технология приготовления растворимой формы тромбопластинового реагента имеет определенные сложности, до настоящего времени предложены и используются всего два отечественных растворимых реагента: Ренампластин фирмы «Ренам» (Москва) и Техпластин фирмы «Технология-Стандарт» (Барнаул).
Приготовление растворимой формы реагента предусматривает очистку от биологического балласта, проведение которой может привести к снижению активности и чувствительности сырья. В связи с этим важное значение приобретает оптимизация условий выделения из него тромбопластинового экстракта и дальнейшее его хранение до сублимационной сушки и при проведении ее. Основными причинами снижения активности и чувствительности реагента может быть развитие процессов перекисного окисления липидов и активации фосфолипаз, разрушающих фосфолипидную часть тромбопластина. Предотвратить их возможно путем применения ограждающих веществ. При их оптимальном качественном и количественном составе денатурация и окислительная модификация тканевого фактора и его липидной части могут быть значительно уменьшены.
Использование качественного растворимого тромбопластина, МИЧ которого определен и находится в пределах требований ВОЗ, позволит выражать результаты теста Квика в виде MHO. Это особенно важно для обеспечения контроля терапии антикоагулянтами непрямого действия. Создание такого отечественного реагента, сопоставимого по качеству с зарубежными аналогами, пригодного для пробирочного и аппаратного выполнения метода определения протромбинового времени будет во многом способствовать решению проблемы его стандартизации, в том числе выражения результатов.
Цель исследования
Разработать технологию получения реагента тромбопластина растворимого, близкого по активности, чувствительности и стабильности к лучшим зарубежным аналогам, который можно рекомендовать для использования в клинико-диагностических лабораториях страны при определении протромбинового времени.
Задачи исследования:
1. Изучить тромбопластическую активность гомогенатов, выделенных из кадаверного мозга и его серого вещества, в зависимости от режимов гомогенизации, сроков, условий хранения и количества используемых единиц (мозг одного кадавера или объединённый пул).
2. Оптимизировать процесс выделения из гомогенатов экстрактов, обладающих высокой тромбопластической активностью.
3. Определить взаимосвязь между количественным составом фосфолипидов в супернатантах и их тромбопластической активностью; установить минимальное количество гемоглобина в сырье и супернатантах, не влияющее на активность и последующую стабильность реагента.
4. Выбрать и оценить эффективность ограждающих веществ и их концентраций для обеспечения стабильности реагента при длительном хранении.
5. Отработать оптимальный для сохранения тромбопластической активности продукта режим сублимационной сушки.
6. Исследовать чувствительность реагента тромбопластина растворимого к дефициту факторов VII и X; установить МИЧ на основании калибровки относительно зарубежных референтов.
7. Исследовать стабильность активности и чувствительности реагента при длительном хранении; оценить его пригодность для контроля терапии анти коагулянтам и непрямого действия.
Научная новизна
Впервые разработана и запатентована технология производства отечественного реагента тромбопластина растворимого, сырьем для которого является серое вещество кадаверного мозга. Оценена тромбопластическая активность гомогенатов мозга, приготовленных из различных участков его, в зависимости от сроков и режимов хранения, количества единиц при изготовлении пула, режимов гомогенизации и центрифугирования. Выявлена прямая зависимость проявления тромбопластической активности реагента от количественного состава трех фосфолипидов в нем (фосфатидилхолина, фосфатидилэтаноламина, фосфатидилсерина). Впервые предложены ограждающие вещества и их концентрации, сохраняющие активность реагента до и во время проведения сублимационной сушки и при хранении в течение 1 года.
Практическое значение
Создана технология производства тромбопластинового реагента в растворимой форме, проведена его калибровка и определен Международный индекс чувствительности, близкий к единице в течение всего срока хранения. Утверждена Фармакопейная статья предприятия: ФСП № 42-0335-5799-04 от 29 сентября 2004 года на «Тромбопластин рстворимый, лиофилизат для диагностических целей»; налажено его мелкосерийное производство. Это позволило рекомендовать отечественный реагент для использования в клинико-диагностических лабораториях страны для исследования протромбинового времени и выражения его результатов в виде Международного нормализованного отношения (MHO), что важно при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Обоснование зависимости получения активного и чувствительного реагента тромбопластина от условий хранения, гомогенизации, центрифугирования, экстракции сырья, выбора ограждающих веществ и последующей сублимационной сушки.
2. Технология получения лиофилизированной формы растворимого тромбопластинового реагента со сроком годности не менее 1 года для исследования протромбинового времени и определение его Международного индекса чувствительности (МИЧ). 3. Возможность применения реагента при контроле терапии антикоагулянтами непрямого действия.
Апробация работы
Материалы работы были доложены на научно-практических конференциях «Актуальные проблемы трансфузионной медицины» (Киров,2000), «Современные проблемы гематологии и трансфузиологии» (Киров, 2002), а также на итоговых научных конференциях Кировского НИИ гематологии и переливания крови и Кировской Медицинской академии (1999-2000 гг.). По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 3 патента и 3 - в центральной печати.
Объем и структура диссертации
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, двух глав с изложением результатов собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 155 источников. Диссертация изложена на 115 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 2 рисунками и 16 таблицами.
Работа выполнена в лаборатории биохимии крови (руководитель -доктор биол. наук, профессор Тарасова Л.Н.), станции переливания крови (главный врач Куноф В.К.) и научно-производственном отделе ФГУ «Кировский НИИ гематологии и переливания крови Росздрава» (директор - доктор мед. наук, профессор Шарыгин С.Л.)
Выражаю благодарность дирекции института и ученой части за предоставленную возможность выполнения данной работы.
Выражаю большую благодарность руководителю Людмиле Николаевне Тарасовой за предложенную тему, постоянную помощь, ценные советы и замечания.
Выражаю также благодарность сотрудникам лаборатории биохимии крови: Софье Геннадьевне Владимировой, Наталье Николаевне Переваловой, Галине Карповне Платоновой, Ирине Николаевне Зимиревой, Ольге Викторовне Веселковой, Елене Андреевне Быковой за совместное творческое участие при выполнении работы. Благодарю Екатерину Юрьевну Савиных и сотрудников научно-производственного отдела: Решетникову Надежду Рудольфовну, Блинову Лидию Александровну, Воронову Любовь Николаевну за помощь в проведении исследований, также сотрудников клинической лаборатории и отдела контроля качества.
