Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Глава 1. Технологические особенности получения иммуноглобулинов
для внутривенного введения и их характеристики 13
-
Методы получения внутривенных иммуноглобулинов 13
-
Состав и параметры лекарственных форм иммуноглобулинов для
внутривенного введения 16
-
Методы определения содержания мальтозы 23
-
Качественные характеристики препаратов иммуноглобулина для внутривенного введения 28
-
Методы удаления пирогенов и инактивации вирусов, содержащихся в препаратах внутривенных иммуноглобулинов 36
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. Материалы и методы исследований 42
Глава 3. Разработка технологии получения стабильной жидкой
формы мономерного внутривенного иммуноглобулина 48
-
Выбор оптимального значения рН 48
-
Определение концентрации натрия хлорида 53
-
Оценка влияния различных стабилизаторов на качество
готового препарата 61
3.4. Определение условий обработки препарата мальтозой 67
-
Разработка технологической схемы получения жидкой стабильной формы иммуноглобулина для внутривенного введения 70
-
Разработка качественной и количественной реакций для определения содержания мальтозы в препарате 74
Глава 4. Изучение качественных показателей и стабильности
внутривенных иммуноглобулинов различного производства...81
4.1. Исследование молекулярных параметров и антикомплементарной
активности 81
-
Содержание анти-А, анти-В гемагглютининов, IgA, IgE и распределение субклассов IgG 88
-
Титры специфических и аутоантител 92
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 102
ВЫВОДЫ ". 116
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 118
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ— антиген
АКА - антикомплементарная активность
AT - антитело
ВВИТ - внутривенный иммуноглобулин
ВИЧ - вирус иммунодефицита человека
ВОЗ — Всемирная организация здравоохранения
ВПГ — вирус простого герпеса
ВФС - временная фармакопейная статья
ГИСК - Государственный научно-исследовательский институт
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов
ЗАО - закрытое акционерное общество
ИГ (Ig) - иммуноглобулин
МУК - методические указания
НПО - научно-производственное объединение
НИИЭМ - научно-исследовательский институт эпидемиологии и
микробиологии
ОСО - отраслевой стандартный образец
ОСПК - областная станция переливания крови
ПЭГ — полиэтиленгликоль
ФГУП - Федеральное государственное унитарное предприятие
ЦМВ - цитомегаловирус
СН50 - гемолитическая единица комплемента
HBsAg - антиген вируса гепатита В
HHV8 - вирус герпеса 8-го типа
Введение к работе
Актуальность проблемы исследования. Среди широкого спектра иммунобиологических препаратов внутривенные иммуноглобулины занимают одно из ведущих мест. Препараты иммуноглобулинов являются высокоэффективным, безопасным и широко используемым средством лечения и профилактики многих инфекционных заболеваний [1].
Рынок препаратов нормальных и специфических ВВИТ постоянно расширяется. В России зарегистрирован ряд отечественных и зарубежных препаратов, большинство из которых получено ферментативной или химической модификацией - иммуноглобулин для внутривенного введения (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород), иммунове нин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат», Уфа), сандоглобулин (Novartis, Швейцария), интраглобин (Biotest, ФРГ) и др. К числу нативных ВВИГ, зарегистрированных в России, относятся октагам (Octapharma AG, Австрия), Ig Vena N I.V. (Farma-Biagini, Италия), Gamimune N (США), габриглобин (ОСПК, Иваново), имбиоглобулин (филиал ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «ИмБио», Нижний Новгород).
Согласно рекомендациям ВОЗ, препараты ВВИГ должны максимально сохранять интактную структуру молекулы, иметь длительный полупериод полувыведения и близкое к естественному распределение субклассов IgG [117]. Нативные ВВИГ наиболее полно удовлетворяют данным требованиям, поскольку, в отличие от модифицированных, обладают более высокой биологической и функциональной активностью как Fc-, так и Fab-фрагментов молекул и более продолжительным периодом полувыведения из организма.
Препараты иммуноглобулина для внутривенного введения различаются величиной рН, составом стабилизаторов, ионной силой, стабильностью при хранении, уровнем антител разной специфичности.
К основным показателям качества ВВИТ относится не только эффективность их применения, но и безопасность, обусловленная низкой АКА, отсутствием или минимальным содержанием агрегатов, димеров и фрагментов, а также нежелательных примесей, таких как IgA, изогемагглютиникы. Обсуждается вопрос о безопасности применения препаратов ВВИТ с повышенным содержанием IgE [141].
Технология получения иммуноглобулина для внутривенного введения должна обеспечивать не только соответствие препарата вышеуказанным требованиям, но и стабильность данных показателей при хранении и транспортировке. Лиофилизация позволяет продлить срок годности препарата и обеспечивает большую стабильность. Однако время приготовления раствора ВВИТ из лиофилизированной формы может быть достаточно продолжительным [47J. Кроме того, антикомплементарная активность препаратов может резко повышаться после сублимационного высушивания [6]. Жидкая форма является более экономичной, удобной для потребителя, однако она требует особого контроля стабильности препарата во время хранения и транспортировки.
Поскольку оценить стабильность качественных характеристик ВВИГ можно только в процессе хранения его в течение установленного срока годности, актуальным является использование при разработке препарата специальных ускоренных тестов, имитирующих условия хранения и транспортировки. В литературе описаны методы, воспроизводящие хранение препарата в течение двух лет [9] и условия транспортирования [94]. Их использование позволяет изучить влияние каждого параметра технологического процесса на стабильность лекарственной формы.
Сохранение параметров иммуноглобулина обеспечивается внесением в препарат определенных стабилизирующих агентов, которые требуют обязательного контроля за их содержанием в готовой лекарственной форме. Однако, контроль отдельных стабилизирующих веществ затруднителен в связи с отсутствием доступных специфических методов их определения.
Процесс изготовления ВВИГ нередко сопровождается потерей или снижением содержания отдельных подклассов IgG [48]. Технологический процесс получения препарата должен обеспечивать максимальную сохранность всех субклассов IgG, поскольку антитела к различным видам возбудителей относятся к определенным субклассам IgG, что является особенно важным при производстве специфических иммуноглобулинов, например, против цитомегаловируса [73].
Для оценки сохранности антител в процессе производства ВВИГ P. Matejtschuk et al. (2002) рекомендуют определять титр антител к возбудителям наиболее распространенных среди населения инфекций, таких как цитомегаловирус, вирус герпеса или гриппа [115].
Кроме того, рекомендуется оценивать уровень антител к HBsAg, что позволяет обеспечивать определенную вирусологическую безопасность ВВИГ. Экспертами ВОЗ рекомендовано ограничить нижний предел содержания антител к HBsAg величиной 0,1 МЕ/мл, с целью инактивации возможно присутствующих вирусных частиц гепатита В [15]. Определение титра антител к HBsAg до настоящего времени не внесено в отечественную ФС на иммуноглобулин для внутривенного введения.
Согласно требованиям Европейской Фармакопеи, технология получения ВВИГ должна содержать одну или несколько специальных стадий вирусной инактивации. Другой проблемой, существующей при производстве иммуноглобулина для внутривенного введения, является пирогенность отдельных серий препарата. Поэтому перед разработчиками возникает задача выбора способов инактивации вирусов и устранения присутствующего в препарате пирогена, не оказывающих негативного влияния на качественные характеристики готового препарата.
Таким образом, разработка технологии получения стабильной жидкой формы отечественного нативного препарата ВВИГ, максимально удовлетворяющего требованиям Европейской Фармакопеи, остается актуальной. Использование тестов на ускоренное старение и перемешивание позволяет проанализировать влияние каждого параметра производства препарата на его стабильность. На основании вышеизложенного была сформулирована цель и определены задачи настоящего исследования.
Цель исследования. Оптимизировать технологический процесс производства иммуноглобулина для внутривенного введения для получения жидкой формы нативного препарата и провести его сравнительный анализ с отечественными и зарубежными образцами.
Задачи исследования:
Оптимизировать технологическую схему производства внутривенного иммуноглобулина для получения стабильной жидкой лекарственной формы, приготовить экспериментально-производственные серии препарата и представить необходимую нормативно-техническую документацию в Департамент здравоохранения МЗ РФ.
Определить оптимальную величину рН и содержание хлорида натрия раствора иммуноглобулина, обеспечивающие стабильность показателя антикомплементарной активности, молекулярных параметров и титров антител препарата во время хранения.
Подобрать стабилизатор физико-химических параметров иммуноглобулина и разработать метод качественного и количественного контроля содержания выбранного стабилизатора в готовой лекарственной форме.
Провести сравнительный анализ полученного внутривенного иммуноглобулина и ряда отечественных и зарубежных препаратов по основным качественным показателям: антикомплементарной активности и молекулярным параметрам.
Оценить содержание нежелательных примесей - IgA, IgE и гемагглютининов в препаратах внутривенных иммуноглобулинов.
Изучить распределение субклассов IgG и уровень антител к возбудителям бактериальных и вирусных инфекций в различных препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения.
Научная новизна. Разработана технологическая схема производства стабильной жидкой формы препарата нативного иммуноглобулина для внутривенного введения иммуновенин-М.
Предложен оригинальный метод определения мальтозы в препаратах внутривенного иммуноглобулина, сочетающий неспецифическую количественную реакцию на редуцирующие вещества с хроматографическим разделением Сахаров.
Установлено, что падение титра антител к цитомегаловирусу после ускоренного старения корреляционно связано с возрастанием агрегации в препарате.
Выявлена корреляционная связь между уровнем титров антицитомегаловирусных антител и содержанием димеров в препаратах внутривенного иммуноглобулина.
Найдена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и Chlamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.
Показана зависимость между величиной титра антител к тиреоглобулину и уровнем антител к цитомегаловирусу и вирусу герпеса 8-го типа.
Практическая значимость работы. Адаптированные методы определения изогемагглютининов, антител к HBs-антигену и оригинальный способ качественной идентификации и количественного определения мальтозы используются с Ы0.02 г. в цехе препаратов крови и ОБТК Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» для стандартизации иммуноглобулина и внесены в нормативно-техническую документацию на препарат иммуновенин-М.
Проведен комплексный сравнительный анализ ряда отечественных и зарубежных препаратов внутривенных иммуноглобулинов, зарегистрированных в России, показавший преимущества того или иного препарата по содержанию IgA, IgE, гемагглютининов, содержанию антител к различным возбудителям и распределению субклассов IgG. Показано, что препарат иммуновенин-М соответствует требованиям Европейской Фармакопеи.
Внедрение результатов исследования в практику. Стабильная жидкая форма препарата иммуноглобулина для внутривенного введения, получившего название «Иммуновенин-М», прошла контроль отдела биологического и технологического контроля, его экспериментально-производственный выпуск с 09.2002 г. начат цехом препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе.
Нормативно-техническая документация на препарат иммуновенин-М направлена для утверждения в Департамент здравоохранения РФ.
Модифицированный метод определения изогемагглютининов и адаптированный способ анализа анти-HBs антител для препаратов внутривенных иммуноглобулинов внесены в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М.
Предложенный оригинальный метод определения содержания мальтозы включен в проект фармакопейной статьи предприятия на препарат иммуновенин-М, а также в фармакопейные статьи предприятия на препарат габриглобин-IgG производства ЗАО «Иммуно-Гем», Челябинской областной станции переливания крови и Свердловской областной станции переливания крови.
Предложен метод расчета результатов реакции связывания комплемента при определении антикомплементарной активности иммуноглобулинов с использованием стандартных компьютерных программ Excel и Statist!ka (StatSoft Inc., USA), который используется в цехе препаратов крови филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе и в лаборатории иммуноглобулинов ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
11 Основные положения, выносимые на защиту:
1. Оптимизирована технологическая схема производства иммуноглобулина для внутривенного введения, позволяющая получать стабильную жидкую форму нативного препарата, который характеризуется: величиной рН 5,5; содержанием натрия хлорида менее 0,2 %; стабилизатором - мальтозой в концентрации 10 %. Технологическая схема производства включает: инкубацию полуфабриката иммуноглобулина с мальтозой при 30 С (для получения нормального внутривенного иммуноглобулина) или при 37 С (для производства специфического антицитомегаловирусного иммуноглобулина для внутривенного введения); стадии инактивации вирусов и депирогенизации, не ухудшающие свойства препарата.
Сравнительный анализ отечественных и зарубежных препаратов продемонстрировал соответствие разработанного иммуноглобулина требованиям Европейской Фармакопеи. Иммуновенин-М отличается высоким содержанием мономерного иммуноглобулина G, низким уровнем IgA и гемагглютининов.
Обнаружена корреляция между содержанием антител к вирусам краснухи, Эпштейна-Барр, HBs-антигену, возбудителям Chlamydia trachomatis и СЫamydophila pneumoniae в исследованных препаратах внутривенного иммуноглобулина.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научно-практической конференции «Иммуноглобулиновые препараты энтерального и внутривенного применения» (Москва, 2003) и научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).
Апробация проведена на заседании Ученого совета Уфимского НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (научного отдела) филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» в г. Уфе 10.12.2003 г. (протокол № 11) и на заседании секции Ученого совета «Медицинская биотехнология» ГУ «МНИИЭМ им. Т.Н. Габричевского МЗ РФ» 16.03.2004 г. (протокол № 2).
