Содержание к диссертации
Список сокращений 4
Введение 6
Обзор литературы 12
Глава 1. Экспериментально-клиническое обоснование применения
препаратов иммуноглобулина в аллергологической практике 12
Глава 2. Технологические аспекты получения препаратов
иммуноглобулина для внутривенного введения 28
Собственные исследования 44
Глава 3. Материалы и методы исследования 44
Материалы исследования 44
Методы исследования 46
Глава 4. Модификация метода ультрафильтрации для получения
препарата противоаллергического иммуноглобулина для
внутривенного введения 49
Изучение влияния рН при ультрафильтрации на качественные характеристики и противоаллергическую активность иммуноглобулина 49
Изучение влияния ионной силы при ультрафильтрации на
качественные характеристики и противоаллергическую
активность иммуноглобулина 55
4.3. Изучение влияния материала мембран при ультрафильтрации
на качественные характеристики и противоаллергическую
активность иммуноглобулина 59
Глава 5. Оптимизация и применение методов дополнительной очистки в
технологии получения иммуноглобулина 65
5.1. Фракционирование полуфабриката иммуноглобулина и
плазмы разных групп крови доноров на DEAE-Tyopearl 65
5.2. Фракционирование полуфабриката иммуноглобулина
полиэтиленгликолем 72
Глава 6. Определение готовой формы препарата противоаллергического
иммуноглобулина для внутривенного введения 79
6.1. Изучение влияния рН и концентрации хлорида натрия на
стабильность противоаллергической активности и
качественных характеристик готового препарата 80
6.2. Изучение влияния вида и концентрации стабилизаторов на
стабильность противоаллергической активности и
качественных характеристик готового препарата 83
6.3. Изучение влияния процесса хранения и транспортировки
на стабильность противоаллергической активности и
качественных характеристик готового препарата 87
Заключение 90
Выводы 102
Список литературы 103
Список сокращений
А - агрегаты
АБ - ацетатный буфер
АД - атопический дерматит
A3 - аллергические заболевания
АКА - антикомплементарная активность
БА - бронхиальная астма
БАа - бронхиальная астма атопическая
БАиа - бронхиальная астма инфекционно-аллергическая
БАВ - биологически активные вещества
ВВИТ - внутривенный иммуноглобулин
ВМИГ - внутримышечный иммуноглобулин
ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения
ГВК - групповые вещества крови
ГЛПС - геморрагическая лихорадка с почечным синдромом
ГОСТ - государственный стандарт
ГУП - государственное унитарное предприятие
Д - димеры
ИГ (Ig) - иммуноглобулин
ИГЧН - иммуноглобулин человека нормальный
ИФА - иммуноферментный анализ
ЛП - липопротеины
М - мономеры
МП - молекулярные параметры
ПАА - противоаллергическая активность
ПАВВИГ - противоаллергический внутривенный иммуноглобулин
ПАИГ - противоаллергический иммуноглобулин
ПСА - пассивная системная анафилаксия
ПЭГ6000 - полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000 Да
*
РИД - радиальная иммунодиффузия
PC - риносинусит
РСВДП - рецидивирующие стенозы верхних дыхательных путей
СИТ - специфическая иммунотерапия
СТ - стабилизатор
УФ - ультрафильтрация
Ф - фрагменты
ФБ - фосфатный буфер
ФС - фармакопейная статья
ФСП - фармакопейная статья предприятия
ХГ - хорионический гонадотропин
ХП - хроматографический пик
Введение к работе
Актуальность проблемы. Во всех странах мира отмечается четко выраженная тенденция к стабильному увеличению числа A3, что требует совершенствования существующих и разработки новых препаратов для лечения этой патологии. В связи со значительными трудностями в осуществлении СИТ, в аллергологии все чаще применяются противоаллергические иммуноглобулиновые препараты, которые отличаются гомологичностью, безопасностью, широтой спектра действия независимо от типа аллергена и высокой эффективностью [Величковский Б.Т.,1991; Пыцкий В.И., 1997; Wakim М. et al., 1999].
На протяжении нескольких десятилетий для лечения A3 в России и за рубежом широко применяются комбинированные противоаллергические иммуноглобулиновые препараты, представляющие собой сочетание иммуноглобулина человека с различными биологически активными веществами. Фирма «Biobasal AG» (Швейцария) производит препараты «Histaglobin» и «Histaglobin Triplex», которые выпускаются в сухом виде и представляют собой комбинацию иммуноглобулина человека и гистамина. В России разработаны аналоги данных препаратов, соответственно «Гистаглобулин» и «Тригистаглобулин». Однако клиническая эффективность комбинированных противоаллергических препаратов ИГ часто ниже желаемой, что неоднократно отмечалось в отечественной и зарубежной литературе [Стригин В А. и др., 1997; Rabinovitch N. et al., 1999].
Наиболее известными в мире являются зарубежные внутримышечные препараты противоаллергического иммуноглобулина - «Allerglobulin» фирмы «Merieux MSD» и «Allergam» фирмы «Ass. Nat. Pour la Distrib. des Fractions Plasmatiques HU», которые выпускаются во Франции. Препарат «Allerglobulin» изготовляется из плацентарного сырья, которое значительно уступает по качеству и безопасности донорскому и часто является причиной нежелательных реакций на введение ИГ, поскольку содержит фето-
плацентарные антигены, гормоны и токсичный консервант мертиолят. Препарат «Allergam» производится из донорской плазмы, но в технологии его получения используется каприловая кислота, которая обладает токсичными свойствами. Кроме того, вышеуказанные препараты в нашей стране являются малодоступными и дорогостоящими.
В настоящее время при терапии некоторых A3 используют препараты нормального ИГ для внутривенного введения, полученные по различным технологиям, такие как «Gammonativ» (фирма «Kabi», Швеция), «Sandoglobulin» (фирма «Sandoz», Швейцария) и «Intraglobin F» (фирма «Biotest Pharma GmbH», Германия). Однако данные препараты по своему назначению не являются специальными противоаллергическими лечебными средствами и характеризуются невысокой противоаллергической активностью [Анастасиев В.В., 1997; Храмов В.В. и др., 1998].
В Уфимском филиале ФГУП «НПО «Микроген» «Иммунопрепарат» разработан и выпускается препарат «Иммуноглобулин человека противоаллергический», характеризующийся высокой противоаллергической активностью, отсутствием токсичного консерванта мертиолята, извлечением из более качественного донорского сырья и меньшей стоимостью, но данный препарат предназначен только для внутримышечного введения.
В этом плане актуальным является создание высокоэффективного препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения, который соответствует всем требованиям, предъявляемым к препаратам иммуноглобулина для внутривенного введения.
Цель исследования. Разработка технологического процесса получения препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения.
Задачи исследования: 1, Определить оптимальный режим ультрафильтрации в технологическом процессе получения мономерного препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения.
Изучить противоаллергическую активность и физико-химические свойства разрабатываемого препарата и определить его оптимальную форму при различных значениях рН, ионной силы и стабилизаторах.
Изучить влияние условий хранения и транспортировки на стабильность противоаллергической активности и физико-химических свойств разрабатываемого препарата.
Оценить в эксперименте на животных противоаллергическую активность разрабатываемого препарата в тесте пассивной системной анафилаксии.
Изучить возможность применения методов дополнительной очистки при получении иммуноглобулина для повышения противоаллергической активности и снижения содержания иммуноглобулинов А, М и Е при сохранении мономерной структуры молекулы иммуноглобулина G.
Научная новизна. Модифицирована технология получения иммуноглобулина с использованием метода ультрафильтрации, что позволяет получить препарат мономерного противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения и стабилизировать его в течение всего срока хранения (один год).
Определены оптимальные условия ультрафильтрации центрифугата Б, полученного фракционированием по методу Кона 6, для приготовления препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения - величина рН (5,5±0,2), ионная сила (0,010+0,005) М, введение стабилизатора полиэтиленгликоля в концентрации (0,15+0,05) %.
Определена оптимальная жидкая форма препарата
противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения, обеспечивающая его стабильность во время хранения (в течение одного года) и при транспортировке, которая имеет параметры: величина рН (6,5+0,5), содержание натрия хлорида 0,9 %, стабилизаторы - глюкоза в концентрации 5% или мальтоза в концентрации 10 %.
Изучение разрабатываемого препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения в эксперименте на животных
в тесте пассивной системной анафилаксии выявило его высокую противоаллергическую активность.
На основании полученных результатов исследований выявлено, что уменьшение содержания иммуноглобулина Е в разрабатываемом препарате способствует увеличению его противоаллергической активности.
Определены оптимальные условия фракционирования полуфабриката иммуноглобулина на DEAE-Toypearl или полиэтиленгликолем, показана возможность использования данных дополнительных методов очистки для повышения противоаллергической активности и снижения содержания иммуноглобулинов А, М и Е при сохранении мономерной структуры молекулы иммуноглобулина G.
Научно-практическая значимость работы. В соответствии с разработанной технологией получены экспериментальные серии препарата мономерного противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения, которые по физико-химическим и иммунобиологическим свойствам соответствуют современным требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.
Модифицированная технология получения препарата
противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения с использованием метода ультрафильтрации может быть воспроизведена и масштабирована в производственных условиях.
Применение оптимизированных дополнительных методов очистки иммуноглобулина с использованием DEAE-Toypearl или полиэтиленгликоля позволяет приготовить препарат стабильного противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения с мономерной структурой молекулы, выраженной противоаллергической активностью и низким содержанием иммуноглобулинов А, М и Е.
По материалам исследований в Федеральный Институт
Промышленной Собственности отправлена заявка № 2002120642 на патент «Препарат внутривенного противоаллергического иммуноглобулина и
способ его получения» и получено уведомление о положительном решении на получение патента от 29 июля 2002 года.
Основные положения, выносимые на защиту:
Модифицированная технология производства с использованием метода ультрафильтрации позволяет получить препарат мономерного противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения, который соответствует требованиям, предъявляемым к иммуноглобулинам для внутривенного введения.
Обоснованы оптимальные параметры и форма препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения, обеспечивающие стабильность качественных характеристик препарата во время хранения и при транспортировке.
Полученные экспериментальные серии препарата противоаллергического иммуноглобулина для внутривенного введения в эксперименте на животных в тесте пассивной системной анафилаксии проявляют высокую противоаллергическую активность.
Применение при получении иммуноглобулина оптимизированных методов дополнительной очистки полуфабриката иммуноглобулина с использованием DEAE-Toypearl или полиэтиленгликоля позволяет повысить противоаллергическую активность, снизить содержание иммуноглобулинов А, М и Е при сохранении мономерной структуры молекулы иммуноглобулина G.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены и обсуждены на научных конгрессах и конференциях: VI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 1999); Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы разработки, производства и применения иммунобиологических и фармацевтических препаратов» (Уфа, 2000); VIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2001); VIII международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация» (Канны, 2002); V Российском конгрессе
«Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и
иммунофармакологии» (Москва, 2002), I Всероссийской научной
конференции молодых ученых «Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клинической и прикладной иммунологии» (Уфа, 2004).
Апробация диссертации проведена на заседании Ученого совета Уфимского филиала ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ «Иммунопрепарат» (протокол № 6 от 29 октября 2003 г.) и на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.124.01 при Президиуме Академии Наук Республики Башкортостан (протокол № 4 от 11 марта 2004 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, из них две работы в центральной печати.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 135 страницах, содержит 17 таблиц и 5 рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы (две главы), собственных исследований (четыре главы), заключения и выводов. Библиографический список включает 277 источников (190 отечественных и 87 зарубежных).
