Введение к работе
;з;^- і
"Г--" ^Актуальность проблемы. Наиболее важными областях-:! применения иммунологического анализа являются диагностика инфекционных заболеваний, обнаружение возбудителей в объектах внешней среды, контроль донорской крови и препаратов, получаемых ИЗ нее ( А.М.Егоров, 1988).
Социально-экономическая значимость инфекционных болезней сегодня все еще велика. До настоящего времени в числе заболеваний, наносящих значительный ущерб экономике я здоровью населения, остается особо опасная инфекция бруцеллез (Е.А.Губн-на и соавт., 1969). По сравнению о 1983 годом заболеваемость лодк-й бруцеллезом в СССР возросла на 20 % (D.M.Федоров и соавї., 1969). Из-за преобладания первично-хронических, латентных и стертых форм заболевания особую необходимость для диагностики бруцеллеза приобретает использование высокочувствительных и специфичных лабораторных методов и, прежде всего, методов иымуноанализа (М.М.Желудков и соавт., 1986).
Одной из важнейших проблем, стоящих перед медицинской вирусологией во многих странах мира, является гепатит В. В СССР более 100000 человек ежегодно переносят острый гепатит В, насчитывается около 15 млн. так называемых бессимптомных носителей поверхностного антигена вируса гепатита В (HBg Ag), . которые составляют основной резервуар инфекции. Конструирование высокочувствительных иммунодиагносгикумов для выявления маркеров гепатита В и внедрение их в медицинскую практику и, в первую очередь, в службу крови, сможет обеспечить снижение частоты поеттрансфуэионного гепатита В и привести к улучшению уровня специфической лабораторной диагностики (В.М.Жданов и соавт., 1966; Д.КДьвов и соавт., 1969).
В конце 1970-х годов Е. Soini, I. Hemmila et al. разработали новый метод иымуноанализа, флуоресцентный иммуно-анализ с временным разрешением (ФИАВР), в котором для проявления реакции антиген-антитело наиболее часто используется лантанидная метка, европчй (su). Регистрация долгоживущей флуоресценции метки с временным разрешением позволяет устранить влияние фонового свечения, которое значительно снижает чувствительность традиционных методов флуоресцентного иммуноанали-г, за (ФИА).
К основным преимуществам метода ФИАВР относят высокую чувствительность и специфичность, широкий линейный рабочий диапазон, .акспрессность, пригодность для проведения кассовых исследования, стабильность и безвредность метки С E.Soini, S.Lovgren, 19?8j I.Henaila, 19S8). По чувствительности ШАЕР не уступает или дам превосходит иіліунофсрментньїй (ИЗД) в ра~ диокымуислогический (РИА) анализы (H.Alfthaa,1986).
iiv.pvu. LKIMfallae (іинляндня) с І9с34 года производит
флуорометра с врек^нн^к разрешением типа и Arcue" и диагнос
тические насору для диссоциснно-усиченного л&итанидного-флуо-
рзсцгктного имму^оаншшза которые С уСПвХОМ ис-
пользуются длп определения гормонов, лекарств, опухолевых маркеров, вирусных антигенов. Тестт-скстемы ІІ1АВР для диагностики б&ктериштьиых инфекций не разработаны.
Рабос-а выполнялись в соответстьии с об-цесоюаной научно-технической программой 0,74.05 "іизико-химическая биология" заданиям 22.ill "Разработать иммунное окспрсес-метсды анализа (ишунсфернентного, имиунохкыичесгого, ию'уно^пуоресц^нтного и других)".
Цель исследования: разработать с использованием отечест-ьеннмс реагентов варианты флуоресцентного иукуновналкэа с вр«-мгникм разрешением для определения бруцеллезных анхиг«нов и антител,к ним, а также HBsAg в клиническом материале.
Оснсрнке задачи исслсдоуяння;
-
Срарнить рвение производные полиамннололгкарбоновьпе кислот по эффективности при получении меченных Su антител,
-
Определить специфические условия проведения гадлуноана-лиза при использовании ланганидной ^егки,
-
Разработать вариант ttlABP для определения бруцеллезных: антигенов, апробировать его на клиническом материале.
-
Разработать вариант іИАЕР для определения аитител к бруцеллезным «нтигенам в сыворотке кроги человека.
-
Разработать варианты ФИАВР ддя обнаружения HBsAg с использсв&ниеі/. препаратов меченных Ей антител и стрептавиди-на.
Є. Оценить пригодность данных вариантов ФИАВР для диагностики вирусного гепатита В и исследования донорской кропи и препаратов»получаемых из нее.
?. Провести сравнительное изучение вариантов іИАВР и И1А по эффективности определения HBtAg , бруцеллезных антигенов и антител к ним в сыворотке крови лодей.
Научная новизна исследования. Впервые разработана тест-система диссоционно-усиленного лантанидного флуоресцентного иымуноанализа для определения бруцеллезного антигена.
Для синтеза кснъвгатов антител с Ей предложено использовать диангидрид диэтилентриамин- г^Н'.Н' ,И" ,К'« - пентаук-сусной кислоты. Определены условия получения конъюгатов с высокий удельным содержанием метки. Теоретически и экспериментально обоснованы общие принципы оптимизации ФИАВР при использовании меченных лантанидаыи реагентов. С целью повышения чувствительности разработаны новые способы проведения ФИАВР. . (авторские свидетельства №№ I6I738I, 1642400).
Показано, что ФІІАВР при определении HBaAg , бруцеллезных антигенов и антител к ним имеет высокую чувствительность, специфичность, точность и воспроизводимость результатов, широкий линейный рабочий диапазон. Установлено,что ФИАВР значительно превосходит ИФ>А по чувствительности ( в 5-Ю раз ) и ширине рабочего диапазона ( на I - 2 порядка ),
Показана высокая эффективность использования в ФИАВР меченного Ец стрептавидина в качестве универсального индикаторного реагента.
Практическая значимость работы. С использованием отечественных реагентов разработаны варианты ФИАВР для диагностики бруцеллеза и гепатита В. Разработанные методы получения конъюгатов с Ви и общие принципы проведения анализа могут применяться при создании различных диагностических тест-систем ФИАВР.
На модели бруцеллеза показана принципиальная возможность использования ФИАВР для диагностики бактериальных инфекций.
Установлено, что при определении бактериальных и вирусных антигенов, а также специфических антител ФИАВР по эффективности значительно превосходит распространенный в клинической практике ИФА. ФИАВР пригоден для определения как растворимых, так и корпускулярных бактериальных антигенов. С помощью ФИАВР бактериальные антигены могут быть обнаружены в клиническом материале, а также в пробах, содержащих гетерологичные микроорганизмы.
Iioni-аы;;; ііі-г.т.іюктигмость исгісльзоіания ФЯАВР, осооени. оіу.осга'лиуиісго зг-хіфьсс-г.}!глнв«, для о6нг.руксн:-:а 1% пг. сг.рянннге донорской крсвіі н грешфатои, получаьыыл «о ни,-л Оформлена норуйтивно-тсхнологіїчбскап документации ь . їссї-систсму диссоционно-ускленного лантанидного флуоресш.?'"-' ного і'.»уноаиализа для опргделеикя бруцеллезного антиген.'.,. которая уіЕсржпенп Ученым Советом ШШЗІІ ин, Ц.Ф.Гсиалеи АУ:\! СССР (протокол %~ 3 от 14 декабря 1990 годе),.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы були доложены на рассиренной научной конференции отдела бактериальных инфекций 1йЫЭМ ии.Н.4.Гомялеи АМН СССР 13 июля 198Э г„ Материалы диссертации обсуждались на:
I, Всесоюзном симпозиуме "Вакцины, диагностические ередеї-ва и новая биотехнология", г.ііущкно, 1988 г.
. 2, Всесоюзном семинаре "Икмунофлуоресцентный микроанализ для медицины", г.Минск, 1983 г.
-
Всесоюзной конференций "Современные направления создания медицинских дкагностикумев", г.Москіа, 1988 г.
-
Конкурсе молодых ученых НИ11ЭМ им.Н.Ф.Гамалеи АМН СССР, 1989 г.
Публикации. По материален диссертации опубликовано 7 работ.
Структура к объем диссертации. Диссертация изложена на 152 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Материалы иллюстрированы 9 таблицами, 22 рисунками. Библиографический указатель диссертации содержит 207 источников литературы (70 отечественных и 137 иностранных).
