Введение к работе
Актуальность проблемы
Псориаз - хронический дерматоз мультифакториальной природы с доминирующим значением в развитии генетических факторов, характеризующийся гиперпролиферацией эпидермальных клеток, нарушением кератинизации, воспалением в дерме (Соколовский Е.В. и соавт., 1999). Эпидемиологические исследования последних лет показали, что псориаз встречается практически во всех климатогеографических зонах земного шара, однако отмечаются расовые отличия в частоте заболевания. Распространенность псориаза варьирует в разных странах, и, по данным различных авторов, составляет от 0,1% до 2% (Lomholt G., 1963; BrandrapF., Green А., 1981; Christophers Е., 2001). В Европейских странах псориаз поражает 1,5-2% популяции, в Канаде заболевание встречается с частотой до 4,7%, в Азиатских странах встречается реже (0,4% в Китае). У 14-47% больных псориазом наблюдается артрит и/или спондилит (Gladman D.D., 1998). В настоящее время число больных псориазом в России составляет приблизительно 3 млн. человек; отмечается тенденция к росту заболеваемости среди лиц трудоспособного возраста, увеличению числа тяжелых, непрерывно рецидивирующих форм заболевания (Беляев Г.М. и соавт., 2005). К настоящему времени доля больных псориазом среди всех больных дерматозами составляет 12-15% (Соколовский Е.В. исоавт., 1999). Установлено, что у60-70% больных псориаз предшествует артриту, у 10-20% - псориаз развивается одновременно с артритом и примерно у 20% кожные проявления псориаза могут развиться после возникновения поражения суставов (Логинова Е.Ю. и соавт., 2008). Артрит предшествует развитию псориаза чаще у детей, имеющих отягощенный семейный анамнез по псориазу (Насонов Е.Л., 2008). В формировании и реализации клинических проявлений псориаза участвуют многочисленные факторы. Многие зарубежные и отечественные исследователи отмечают ведущую роль иммунных механизмов в патогенезе псориаза (ШегайММ., и соавт., 1998; Gottlieb А.В., 2003; Pietrzak А.Т., 2008). В связи с распространенностью данного заболевания и не выясненным первичным патогенетическим механизмом, представляется актуальным исследование хемокинов, хемокиновых рецепторов, основных цитокинов, участвующих в патогенезе псориаза, и транскрипционного маркера Т-регуляторных клеток - FOXP3. Данное исследование позволит уточнить патогенез заболевания, охарактеризовать длительность и течение хронического повреждения в коже.
Цель работы. Оценить закономерности системной продукции и местного синтеза цитокинов при псориазе с целью изучения иммунопа-тогенеза и поиска новых биомаркеров заболевания.
Задачи работы
Определить нормальные значения уровня цитокинов в сыворотке крови и в моче, а также экспрессию мРНК СС- и СХС-хемокинов в биоптатах кожи практически здоровых лиц.
Определить в сыворотке крови больных псориазом содержание следующих цитокинов:
провоспалительных цитокинов (IL-la, IL-ip, IL-9, IL-12 (p40), IL-12(p70), IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, TNF-a, TRAIL, MIF, LIF; IL-2Ra, IFN-a2);
противовоспалительных цитокинов (IL-10, IL-1RA);
ТЫ-цитокинов (IFN-y, TNF-P, IL-2,);
Тп2-цитокинов (IL-4, IL-5, IL-6);
факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул (FGFbasic, SCF, SCGF, PDGF-BB, P-NGF, VEGF, HGF, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, IL-7, ICAM-1, VCAM-1);
-хемокинов (CCL27/CTACK, CXCLl/GROa, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la, CCL5/RANTES, СХСЬ8ЛЬ-8, CCLll/eotaxin, СХСЫ0ЯР-10, CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-la и CCL4/MIP-lp).
Оценить содержание цитокинов (IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IFN-y, GM-CSF, TNF-a) в сыворотке крови и моче у больных псориазом и у больных атопическим дерматитом и склеродермией, и в зависимости от клинической активности процесса.
Исследовать экспрессию мРНК FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже при псориазе.
Определить экспрессию мРНК некоторых СС- и СХС-хемокинов и их рецепторов в визуально здоровой и в пораженной коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией.
Научная новизна
Впервые определена экспрессия хемокинов и хемокиновых рецепторов в коже практически здоровых лиц. Выявлено, что в коже практически здоровых лиц экспрессируются гены хемокинов (CCL4/MIP-1P, CCL5/RANTES, CXCL8/IL-8) и гены рецепторов для СС-хемокинов (CCR1, CCR3 и CCR5), однако отсутствует экспрессия СС-хемокинов (CCL3/MIP-la, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов для семейства СХС-хемокинов. Показано, что у больных псориазом с индексом PASI менее 10 и с индексом PASI более 20 значительно повышено содержание в сыворотке крови: CCL4/MIP-lp, CCL7/MCP-3, CCLll/eotaxin, CCL27/CTACK, CXCLl/GROa, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la по сравнению с практически здоровыми лицами, а также повышено содержание CXCL10/IP-10 в сыворотке крови у пациентов с индексом PASI < 10. Установлены особенности экспрес-
сии генов хемокинов и их рецепторов в коже больных псориазом по сравнению с атопическим дерматитом и склеродермией. Установлена зависимость экспрессии генов хемокинов и их рецепторов в коже от распространенности и тяжести течения псориаза и псориатического артрита, а также определена их корреляция с индексами прогрессии данной патологии, индексами VAS и PASI.
Впервые определены лабораторные маркеры активности псориаза в моче: выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом PASI и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче при псориазе и взаимосвязь между уровнем IL-6 и содержанием белка в моче, что может указывать на диагностическую значимость этого цитокина как маркера «активности поражения почек» при псориазе. Установлена повышенная экспрессия гена FOXP3 в коже больных псориазом по сравнению с практически здоровыми лицами. Изучен уровень экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже у больных псориазом, также установлены закономерности экспрессии этого гена по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между уровнем экспрессии гена FOXP3 в визуально здоровой коже больных псориазом и индексом тяжести и распространенности заболевания (PASI).
Теоретическая значимость работы
В данной работе освещены три аспекта иммунопатогенеза псориаза: участие цитокинов, Т-регуляторных клеток, а также хемокинов и их рецепторов в формировании и поддержании псориатического воспаления. С помощью мультиплексного анализа цитокинов показано вовлечение в патогенез псориаза «цитокинового каскада», включающего активацию провоспалительных и противовоспалительных цитокинов, ТЫ- и Th2-цитокинов, хемокинов, а также факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул. На уровне регуляторных Т-клеток было выявлено нарастающее повышение экспрессии гена FOXP3 по мере прогрессирования заболевания. Выявлена прямая корреляционная зависимость между индексом тяжести и распространенности псориаза и концентрациями IL-6 и IL-8 в моче.
Третий аспект относится к определению закономерностей повышенного местного синтеза СС- и СХС-хемокинов ихемокиновых рецепторов в кожных биоптатах больных псориазом, участвующих в формировании и поддержании воспаления в коже. Высказана гипотеза о наличии в визуально непораженной коже больных псориазом повышенного содержания мРНК хемокинов (ССЬЗ/МІР-Іа, CCL4/MIP-ip, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и двух рецепторов для СХСЬ8ЯЬ-8 (CXCR1 и CXCR2) как потенциальных биомаркеров заболевания, что наиболее значимо в дебюте псориаза, особенно при суставных его проявлениях.
Практическая значимость работы
Определение показателей повышенной экспрессии мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1P, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2) и рецепторов (CXCR1 и CXCR2) в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3 в коже предполагается рекомендовать к использованию в клинической практике для дифференциальной диагностики псориаза, что наиболее значимо в дебюте заболевания, особенно при суставных его проявлениях. Для определения активности заболевания рекомендуется определять IL-6 и IL-8 в моче, предлагаемые «маркеры» активности псориаза, которые определяются с помощью неинвазивных методов и доступны для клинического применения. Для уточнения поражения почек при псориазе возможно определение IL-6, который коррелирует с содержанием белка в моче.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту
1. В сыворотке крови больных псориазом значительно увеличено
по сравнению с практически здоровыми лицами содержание провоспали-
тельных цитокинов (IL-ip, IL-6, IL-9, IL-12 (p40), IL-13, IL-16, IL-18,
TNF-a, IL-2Ra, IFN-a2 и LIF), Thl-цитокинов (IFN-y); ТЬ2-цитокинов (IL-
5), хемокинов (CCLll/eotaxin, CCL4/MIP-lp, CCL7/MCP-3,
CCL27/CTACK, CXCLl/GRO-a, CXCL9/MIG, CXCL12/SDF-la), а также
факторов иммуногемопоэза, ростовых факторов и адгезионных молекул
(GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL-3, SCGF, p-NGF, HGF и ICAM-1).
У пациентов с псориазом по сравнению с больными атопическим дерматитом и склеродермией повышенная экспрессия мРНК хемокинов (CCL3/MIP-la, CCL4/MIP-1P, CCLll/eotaxin, CCL24/eotaxin-2), хемокино-вых рецепторов (CXCR1 и CXCR2) и FOXP3 в визуально здоровой и пораженной коже сочетается с повышенным содержанием IL-6, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в сыворотке крови и повышенным содержанием IL-4, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в моче.
Рост клинической активности псориаза сопровождается повышенным содержанием IL-2, IL-6, IL-10, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в периферической крови и повышенным содержанием IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y в моче в сочетании с повышенной экспрессией мРНК FOXP3, хемокинов (CCL11/ eotaxin, CCL24/eotaxin-2, CCL3/MIP-la и CCL4/MIP-1P) и рецепторов для CXCL8/IL-8 (CXCR1, CXCR2) вбиоптатах визуально здоровой и пораженной кожи.
Личный вклад автора
Автором лично выполнено проведение punch-биопсий у больных псориазом, групп сравнения и практически здоровых лиц. Автором проводилась оценка тяжести заболевания, подсчет интегральных индексов -PASI и VAS, проведение ПЦР диагностики (выделение мРНК из биопта-
тов кожи, проведение обратной транскрипции, амплификация, проведение электрофореза и детекция продуктов амплификации). Вклад соавторов состоял в помощи при отборе, клиническом обследовании больных псориазом и псориатическим артритом и групп сравнения (Ильина Т.Н., Ше-меровская Т.Г., Хобейш М.М.), а также в освоении и постановке новых методов исследования (Сысоев К.А.). Доля участия автора в накоплении, обобщении, анализе материала составляет 100%.
Апробация работы
Основные положения диссертационного исследования были доложены на конференциях: Общества Молодых Ученых СПбГМУ имени акад. И.П. Павлова «Санкт-Петербургские научные чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007), II Международный молодежный медицинский конгресс (Санкт-Петербург, 2007), на конференции 8-th JOHN HUMPHREY (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Высокотехнологичные методы диагностики и лечения заболеваний сердца, крови и эндокринных органов» (Санкт-Петербург, 2008), Объединенный иммунологический форум - 2008 (Санкт-Петербург, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени акад. В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009). Работа поддержана грантами Правительства Санкт-Петербурга № 4/04-05/19 в 2008 и№ 4/30.04/021 в 2009 году.
Объем и структура диссертации
