Укорочение длины теломерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояниях [Электронный ресурс] Борисов Вячеслав Игоревич

Содержание к диссертации

ВВЕДЕНИЕ 6

1.1 Актуальность 6

1.2 Цель исследования 8

1.3 Задачи исследования 9

1.4 Положения, выносимые на защиту 9

1.5 Научная новизна результатов работы 10

1.6 Практическая и теоретическая значимость работы 10

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

2.1 Теломерная теория старения 12

2.1.1 Лимит Хейфлика и «проблема» концевой недорепликации ДНК. 12

2.1.2 Строение теломер 15

2.1.3 Динамика длины теломер в норме

2.2 Теломераза 24

2.3 Патологические состояния, ассоциированные или вызванные укорочением теломерный районов ДНК 2.3.1 Длина теломер при онкологических заболеваниях 28

2.3.2 Лимфопролиферативные заболевания 29

2.3.3 Трансплантация костного мозга

2.4 Иммуностарение 31

2.5 Патогенез заболеваний, связанных с патологией иммунной системы и динамика длины теломер в лейкоцитах при этих заболеваниях 38

2.5.1 Аутоиммунные заболевания (Ревматоидный артрит) 39

2.5.1.1 Динамика длины теломер в лейкоцитах при ревматоидном артрите

2.5.2 Атопия 43

2.5.2.1 Бронхиальная астма (БА) 44

2.5.2.2 Атопический дерматит 45

2.5.3 Иммунодефицит (ВИЧ инфекция) 48

2.5.3.1 Динамика длины теломер в лимфоцитах при ВИЧ инфекции.50

2.6 Методы измерения длины теломер 51

2.6.1 Southern Blotting 51

2.6.2 FISH метод (fluorescence in situ hybridization) 52

2.6.3 Flow-FISH (flow cytometry and fluorescence in situ hybridization) .52

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: 54

3.1 Характеристика обследованных больных 54

3.1.1 Ревматоидный артрит 55

3.1.2 Атопический дерматит 55

3.1.3 Бронхиальная астма 55

3.1.4 ВИЧ 56

3.2 Flow-FISH 56

3.2.1 Метод получения лейкоцитов периферической крови 56

3.2.2 Получение мышиных спленоцитов 56

3.2.3 Получение мышиных тимоцитов 57

3.2.4 Оценка относительной длины теломер (ОДТ) 57

3.2.5 Оценка абсолютной длины теломер в субпопуляции лимфоцитов58

3.2.6 Измерение длины теломер в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов 58

3.2 Southern Blotting 59

3.2.1 Заливка клеток в блочки и их обработка 59

3.2.2 Гидролиз ДНК в блочках и пульс-форез 59

3.2.3 Саузерн-блот гибридизация 60

3.3 Статистическая обработка данных 61

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 61

4.1 Метод Flow-FISH для измерения относительной длины теломер... 61

4.2 Модифицирование метода для измерения длины теломер в парах нуклеотидов (п.н.) 69 4.3 Длина теломер в субпопуляциях CD4+ и CD8+ лимфоцитов 79

4.3.1 Ревматоидный артрит 81

4.3.2 ВИЧ инфекция 82

4.3.3 Атопический дерматит 85

4.3.4 Бронхиальная астма 86

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ89

5.1 Метод-Flow-FISH 89

5.2 Результаты по длине теломер в группе доноров 89

5.3 Ревматоидный артрит 92

5.4 Атопический дерматит 97

5.5 Бронхиальная астма 98

5.6 ВИЧ инфекция 1 6.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ 103

7. ВЫВОДЫ 105

Список литературы 107  

Введение к работе

После установления связи ограниченного количества делений клеток в культуре, так называемого предела Хейфлика, из-за критического сокращения теломерных районов ДНК (теломер) в результате проблемы концевой недорепликации ДНК, теломеры стали рассматриваться как "митотические часы" клетки и это привело к взрывообразному изучению данного феномена. Была установлена прямая зависимость между длиной теломерных районов ДНК и максимальным количеством делений клетки. Было показано, что при длине теломер, менее чем 2 тысячи пар нуклеотидов (тыс.п.н.) клетка выходит из клеточного цикла и больше уже не способна делиться, с последующей, как правило, скорой гибелью в результате апоптоза (Allsop R.C., 1992). Во множестве работ была показана обратная связь между длиной теломер и возрастом (Harley С, 1990, Frenck R.W., 1998, Rufer N., 1999). Укорочение теломер происходит во всех соматических клетках организма (Cherif Н., 2003), включая и лейкоциты крови, в то время как в стволовых клетках, а также в клетках некоторых опухолевых линий, длина теломер не изменяется, что происходит за счет активности в недавнем времени открытого фермента теломеразы (Blackburn Е.Н., 1992, Counter СМ., 1992). В настоящий момент длина теломерных районов ДНК в соматических клетках рассматривается как показатель их пролиферативного потенциала или как показатель "состаренности" клетки (Allsopp R.C., 1992, Weng N.-P., 1995, Effros R.B., 1996). Соответственно, при исследовании любых процессов, связанных с клеточной активностью, пролиферацией и апоптозом, длина теломер становится одним из важных функциональных показателей. Для такой системы как иммунная характерна высокая пролиферативная активность, как за счет постоянного клеточного обновления, так и за счет массивной пролиферации в ответ на различные антигены. Соответственно, сокращенная длина теломер может стать ограничением к адекватному уровню пролиферации в ответ на антиген или для нормального клеточного обновления.

Согласно сказанному выше представляется актуальным измерение такого показателя, как длина теломер при исследовании иммунной системы, как в норме, что позволит узнать качественные изменения в системе с возрастом, так и при патологии, что даст понимание патогенеза заболевания, направление его развития, а также изменений, происходящих с самой иммунной системой. Следует заметить, что из-за разнородности по качественному и функциональному составу, измерение теломер необходимо проводить как на популяционном, так и на субпопуляционном уровне.

Получено огромное количество информации по динамике длины теломер в лейкоцитах крови, как в норме, так и при различных заболеваниях инфекционной и онкологической природы (Counter СМ., 1995, Effros R.B., 1996, Maruyama Y., 1997, Palmer L.D., 1997), но существует мало данных при заболеваниях, связанных с патологией самой иммунной системы. Из-за высокой частоты встречаемости заболеваний атопического и аутоиммунного генеза, а также синдрома приобретенного иммунодефицита представляется актуальным и несущим большой научный интерес получение новых и полноценных данных по динамике длины теломер в лейкоцитах периферической крови при данных заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы.

Существует несколько методов измерения длины теломер, но все они достаточно длительны и громоздки, имеют свои преимущества и недостатки, разделить которые можно на две основные категории: либо необходимо разрушение клеток для выделения ДНК, либо метод не позволяет оценивать большую выборку одной популяции клеток. При исследовании иммунной системы необходим принципиально новый метод, который бы обладал следующими особенностями: во-первых, не было необходимости разрушения клеток для выделения ДНК, так как необходимо измерение длины теломер in situ, во-вторых, дифференцировка по поверхностным антигенам, и в-третьих, большое количество исследуемых клеток за минимальное время. Таким условиям удовлетворяет метод Flow-FISH - гибридизация in situ в клетках с последующим анализом на проточном цитофлуориметре. При исследовании клеток периферической крови с помощью проточной цитометрии, по двух параметрам: размеру клетки и ее плотности, можно разделить все ядерные клетки на три популяции: лимфоциты, моноциты и гранулоциты без использования флуоресцентных меток. В настоящий момент при использовании метода Flow-FISH такое разделение популяций было невозможным, получали только популяцию лимфоцитов и популяцию моноцитов и гранулоцитов совместно. Возможно, благодаря этому недостатку flow-FISH, а также невозможности оценки большого количества клеток с помощью других методов, исследование длины теломер в моноцитах не было проведено ни в группе здоровых доноров, ни при какой либо патологии. Исходя из этого, представляется актуальным модернизация метода для получения возможности исследования длины теломер в моноцитах.

Таким образом, исследование динамики длины теломер лейкоцитов периферической крови, как в норме, так и при заболеваниях, связанных с патологией иммунной системы с помощью модернизированного метода Flow-FISH может помочь более полно понять процессы, происходящие в самой иммунной системе, и объяснить некоторые звенья патогенеза заболеваний.

1.2 Цель исследования - исследовать взаимосвязь изменения длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с этиологией и патогенезом заболеваний, связанных с аутоиммунными, аллергическими и иммунодефицитными состояниями.

1.3 Задачи исследования:

1. Модернизировать и стандартизовать метод Flow-FISH для измерения длины теломерных районов ДНК в лейкоцитах периферической крови человека, включая моноциты и субпопуляции лимфоцитов.

2. Изучить изменения длины теломерных районов ДНК в CD4+ и С08+-лимфоцитах, моноцитах и гранулоцитах здоровых людей в зависимости от возраста.

3. Исследовать длины теломерных районов ДНК в лейкоцитах периферической крови при ревматоидном артрите, бронхиальной астме, атопическом дерматите и ВИЧ инфекции.

4. Оценить связь изменений длины теломерных районов ДНК в иммунокомпетентных клетках с патогенезом заболеваний на примерах больных ревматоидным артритом (с анемией и без анемии) и бронхиальной астмой (атопической, инфекционно-зависимой и смешанной формой).

1.4 Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная модификация метода Flow-FISH с использованием контрольных клеток и известной длиной теломер позволяет в отличие от существующих вариантов метода измерять количество теломерных повторов ДНК одновременно в лимфоцитах, моноцитах, гранулоцитах и популяциях клеток, дифференцированных по определенному маркёру.

2. Ревматоидный артрит характеризуется ранним сокращением теломерных районов ДНК в гранулоцитах, моноцитах и лимфоцитах, в том числе в субпопуляциях CD4+ и CD8+ клеток.

3. Разные формы бронхиальной астмы в зависимости от генеза характеризуется разными изменениями теломерных районов ДНК в лимфоцитах периферической крови: при атопической форме обнаруживается сокращение теломерных повторов в CD4+-ioieTKax, при инфекционно-зависимой - в CD4 - и СВ8+-клетках, при смешанной форме длина теломер в этих клетках остается в пределах возрастной нормы.

1.5 Научная новизна результатов работы

Разработана модификация метода Flow-Fish, которая позволила определить количество теломерных повторов ДНК во всех популяциях лейкоцитов периферической крови, включая моноциты. Впервые показано укорочение длины теломер в моноцитах у здоровых доноров и выявлена средняя скорость сокращения с возрастом. Впервые выявлено ускоренное укорочение теломер в моноцитах периферической крови при ревматоидном артрите. Показано также, что при ревматоидном артрите у больных с анемией хронических заболеваний в лимфоцитах происходит более значительное сокращение теломер, чем у больных без анемии. При ВИЧ-инфекции впервые выявлено ускоренное укорочение теломер в моноцитах, а также показана корреляция длины теломер в CD4+ лимфоцитах с показателем ИРИ. При бронхиальной астме впервые показано укорочение теломер в CD4+ и CD8+ лимфоцитах в зависимости от генеза астмы. При атопической астме происходит укорочение в CD4+ лимфоцитах, тогда как при инфекционно-зависимой астме - в CD4+ и в CD8+ лимфоцитах.

1.6 Практическая и теоретическая значимость работы

Полученные данные об укорочении теломер в моноцитах при ревматоидном артрите можно рассматривать как подтверждение теории раннего старения иммунной системы при ревматоидном артрите.

Получены данные о взаимосвязи длины теломер и клеточного цикла, которые позволили по-новому объяснить процессы, происходящие в иммунной системе при различных ее патологиях: в патогенезе разных форм бронхиальной астмы участвуют разные популяции клеток, и так называемая смешанная форма астмы не является одновременно состоянием атопической и инфекционной астмы; при ВИЧ инфекции происходит укорочение теломер в популяциях лимфоцитов и моноцитов за счет повышенной пролиферации для самовосстановления популяции. Для субпопуляции CD8+ лимфоцитов укорочение происходит дополнительно за счет усиления пролиферации для компенсаторного поддержания общего количества лимфоцитов в результате истощения CD4+ субпопуляции лимфоцитов.

Модифицирован метод Flow-FISH для одновременного измерения длины теломерных районов ДНК как в популяции лимфоцитов, моноцитов и гранулоцитов, так и в субпопуляциях лимфоцитов, дифференцированных по поверхностным антигенам. В общем плане, данный метод позволяет определять длину теломер в суспензии любых клеток, а также в субпопуляциях клеток, дифференцированных по поверхностным маркёрам. Длина теломер может быть дополнительным показателем тяжести заболевания при ревматоидном артрите и ВИЧ инфекции.

Данная работа была выполнена в лаборатории клинической иммунопатологии ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН. Заведующий лабораторией - д.м.н., Кожевников Владимир Сергеевич.

Работа по стандартизации метода выполнялась совместно с лабораторией молекулярной цитогенетики, ИЦиГ СО РАН.

Автор выражает глубокую благодарность заведующему лабораторией клинической иммунопатологии, д.м.н. Кожевникову Владимиру Сергеевичу, всем сотрудникам лаборатории, а также к.б.н. Демакову Сергею Анатольевичу за помощь и поддержку, оказанную в выполнении работы. 

Похожие диссертации на Укорочение длины теломерных районов ДНК при иммунодефицитных, аллергических и аутоиммунных состояниях [Электронный ресурс]

Факторы риска, функциональное состояние эндотелия и полиморфизм ДНК у женщин с ИБС без ангиографических признаков стеноза коронарных артерийКурникова, Елена Анатольевна

Влияние природы противоионов на состояние ДНК в концентрированных бессолевых системах Королев Николай Иванович

Топологическое состояние ДНК в интерфазных ядрах и метафазных хромосомахКузин Федор Эдмундович

Влияние андрогенного и анаболического стероидных гормонов на метилирование ДНК и состояние ядер клетокКляшева Наталья Викторовна

Кинетика и механизмы дезактивации возбужденных электронных состояний порфиринов, встроенных в ДНКГалиевский, Виктор Антонович

Исследование возбужденных электронных состояний в полинуклеотидах и комплексах ДНК с красителямиКононов Алексей Игоревич

Специфичность метилирования ДНК растений при различных физиологических состоянияхДьяченко Ольга Владимировна

Молекулярно-цитогенетический анализ ДНК района прикрепления хромосомы 2L к ядерной оболочке трофоцитов яичников малярийного комара Anopheles beklemishevi (Diptera, Culicidae)Пищелко Анна Олеговна

Картирование границ фрагментов ДНК в районе хромосомы 17q12-q21 в клетках опухолей рака молочной железы человека с увеличенной дозой гена HER2/neuМаценко Наталья Юрьевна

Характеристика ДНК и белкового состава междисковых районов хромосом Drosophila melanogasterЗыкова, Татьяна Юрьевна