Введение к работе
Актуальность темы.
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место среди онкологических заболеваний женской репродуктивной системы. По данным ВОЗ, в мире ежегодно выявляется около 1 млн. новых случаев РМЖ. По данным РОНЦ, ежегодно в России около 50 тыс. женщин ставится диагноз РМЖ, смертность составляет около 24 тыс. женщин. По данным ежегодной отчетной конференции онкологов в 2006 году в г. Новосибирске частота встречаемости РМЖ составила 81.6 случаев на 100 тысяч женского населения.
Значительным прогрессом в диагностике и лечении РМЖ стало открытие молекулярных маркеров, которые имеют прогностическое и предсказательное значение при определении их статуса у пациенток с РМЖ. В настоящее время одним из наиболее изученных молекулярных маркеров является рецептор эпидермального фактора роста человека второго типа, HER2 (Yang-Feng Т. et al, 1985; Di FioreP. etal, 1987).
Увеличенное количество рецептора HER2 на поверхности опухолевых клеток встречается в 20-30% случаев РМЖ (Slamon D. et al, 1989; Meric F. et al., 2002). Избыточное наличие HER2 рецептора свидетельствует о наиболее агрессивной форме РМЖ, которая характеризуется быстрым ростом опухоли, высокой вероятностью метастазирования, снижением эффективности химио-, гормональной и лучевой терапии (Имянитов Е.Н. с соавт., 1992; Masood S. et al., 2002). Только с помощью своевременной диагностики НЕК2-статуса опухоли можно назначить адекватное и эффективное лечение РМЖ всех стадий.
В подавляющем большинстве случаев в основе увеличенной экспрессии лежит увеличение дозы гена HER2/neu (Couturier J. et al., 1999; Jacobs T. et al., 1999). Амплификация - один из механизмов активации онкогенов в процессе развития опухоли. В ряде случаев амплификация затрагивает целые фрагменты хромосом (Hyman Е. et al, 2002). В литературе описано несколько механизмов амплификации, предложенных для объяснения активации онкогенов в клеточных линиях опухолей разного типа, в том числе и для РМЖ (Savelyeva L. и Schwab М., 2001; Albertson D., 2006). Однако предложенные модели амплификации не дают ответа на вопрос о причинах возникновения амплификации. Если существуют закономерности и общие механизмы возникновения увеличения дозы онкогенов, то их открытие может послужить основой для разработки новых целевых препаратов для анти-раковой терапии, которые позволят контролировать и даже предотвращать развитие раковых опухолей у человека. В свете постоянного увеличения заболеваемости злокачественными новообразованиями актуальность данной темы не вызывает сомнений.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящей работы является картирование границ фрагмента ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21 в клетках опухолей РМЖ человека с увеличенной дозой гена HER2/neu и выявление структурных особенностей ДНК на данных границах.
Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:
-
Провести сравнительный анализ чувствительности, воспроизводимости и диапазона измерений двух протоколов ПЦР-РВ (SYBR Green и TaqMari) для определения дозы гена HER2/neu в клетках опухолей РМЖ.
-
Провести сравнительный анализ результатов определения дозы гена HER2/neu методом ПЦР-РВ с результатами методов ИГХ и FISH определения НЕЯ2-статуса опухолей РМЖ.
-
Определить дозу гена HER2/neu в панели образцов опухолей РМЖ человека методом ПЦР-РВ.
-
Провести определение дозы ряда соседних с HER2/neu генов.
-
Установить длину и границы амплифицированных районов ДНК, содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21.
-
Выявить возможные структурные особенности нуклеотидной последовательности ДНК в районе хромосомы 17ql2-q21, вокруг гена HER2/neu.
-
Сопоставить взаимное расположение структурных особенностей нуклеотидной последовательности ДНК вокруг гена HER2/neu и границ амплифицированных районов хромосомы 17ql2-q21, содержащих ген HER2/neu.
Научная новизна.
Предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ для анализа дозы гена HER2/neu;
Установлена высокая корреляция результатов (г=0.8,р<0.005), полученных с использованием предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu, с результатами определения HER2-статуса опухолей РМЖ с помощью методов ИГХ и FISH;
Впервые продемонстрирована возможность использования TaqMan ПЦР-РВ для оценки длины амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu;
Установлено наличие амплифицированных фрагментов ДНК разной длины (от 40 т.п.н. до более чем 1 м.п.н.), содержащих ген HER2/neu, в районе хромосомы 17ql2-q21, в разных образцах опухолей РМЖ;
Впервые продемонстрировано наличие сайтов высокой флексибиль-ности в районе хромосомы 17ql2-q21;
Впервые продемонстрировано, что в ряде опухолей РМЖ с увеличенной дозой гена HER2/neu границы амплифицированных фрагментов ДНК хромосомы 17ql2-q21 находятся в пределах одной из обнаруженных областей высокой флексибильности FlexZNF-2;
- На основе полученных данных выдвинуто предположение об участии районов высокой флексибильности в процессах инициации внутри-хромосомной амплификации ДНК в клетках опухолей РМЖ.
Научно-практическая значимость.
По своему содержанию работа носит фундаментально-прикладной характер и представляет собой исследование, позволившее говорить о том, что амплификация фрагмента хромосомы 17ql2-q21, содержащего ген HER2/neu, по крайней мере, в некоторых точках ассоциирована с наличием районов высокой флексибильности ДНК. Данные о связи сайтов высокой флексибильности с границами амплифицированных районов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, могут оказаться полезными для изучения механизмов амплификации данного онкогена в клетках РМЖ, а также для выявления общих закономерностей процессов амплификации онкогенов в опухолевых клетках. Кроме того, дальнейшее исследование подобных взаимосвязей, возможно, окажется полезным для поиска новых подходов при разработке таргетной терапии РМЖ.
Прикладное применение данной работы связано с возможностью выбора рациональных схем терапии при РМЖ в зависимости от длины амплифицированных фрагментов хромосомы 17q, содержащих ген HER2/neu. В ходе работы был предложен новый протокол TaqMan ПЦР-РВ, на основе которого был создан прототип набора для определения дозы гена HER2/neu в опухолевой ткани РМЖ с дальнейшей возможностью применения его в клинической практике.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Предложенный протокол TaqMan ПЦР-РВ для определения дозы гена HER2/neu в образцах ткани опухоли РМЖ обладает более высокой чувствительностью (1 нг геномной ДНК), воспроизводимостью (КВ<5%) и более широким диапазон измерений (1-100 нг геномной ДНК), по сравнению с параллельно разработанным в данной работе, протоколом SYBR Green ПЦР-РВ.
-
Результаты определения дозы гена HER2/neu с помощью предложенного протокола TaqMan ПЦР-РВ хорошо коррелируют с данными методов ИГХ и FISH определения НЕ112-статуса опухолей РМЖ (г = 0.8, /Х0.005).
-
Увеличение дозы гена HER2/neu выявлено в 34.5% исследованных опухолей РМЖ.
-
В различных образцах опухолей РМЖ в районе хромосомы 17ql2-q21 обнаружены различные по протяженности амплифицированные фрагменты хромосомы, содержащие ген HER2/neu.
-
В районе хромосомы 17ql2-q21 (NT.0107555 (1722059...1731701) Gene Bank), прилегающем к гену HER2/neu, располагаются нуклеотидные последовательности ДНК с высокой флексибильностью.
6. Расположение границ ряда амплифицированных фрагментов хромосомы, содержащих ген HER2/neu, совпадает с локализацией одного из сайтов высокой флексибильности FlexZNF-2 в районе хромосомы 17ql2-q21, что свидетельствует об его возможном участии в процессах внутри-хромосомной амплификации.
Апробация работы.
Результаты работы были представленны и обсуждены на VIII Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2004); на I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» (Санкт-Петербург, 2005); на 2-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2006» (Санкт-Петербург, 2006); на XI Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2007); на 3-й Российской конференции по фундаментальной онкологии «Петровские чтения - 2007» (Санкт-Петербург, 2007); на 14-й Европейской конференции по Онкологии, ЕСС014 (Barcelona, Spain, 2007); на 5-й Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2008), на всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).
Публикации. По материалам диссертации имеется 11 печатных работ.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 8 таблиц, 31 рисунок, и состоит из 8 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, изложения собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 186 ссылок, и 3 приложения.
