Введение к работе
Актуальность проблемы. Совершенствование стратегии и тактики борьбы с инфекционными болезнями неразрывно связано с раз- . работкой и внедрением в практику здравоохранения эффективных методов диагностики.
В настоящее время в инфекционной патологии достаточно распространены методы иммунодиагностики, основанные на феномене агглютинации или яреципитации, с помощью которых возможно определение антигенов (АГ) или антител (AT) в биосубстратах больных (Покровский В.И. и др., 1976, 1983; Демина А.А. и др., 1978, 1987; Латинский Ю.И, и др., 1979; Laureli с.в., sveger г., 1975; Madden D.L. et al., 1978; tlajumdar A.S. et al., 1981; Uppei i.e. et ai., 1983). Однако эти широко и давно применяющиеся классические методы иммунодиагностики, использующие вторую стадию взаимодействия антигена с антителом (образование агглютината или преципитата), требуют значительной концентрации реагентов, длительного времени проведения реакции, не всегда іосгагочно чувствительны. Кроме того, часть из них основана на іспользованли биологического сырья - эритроцитов, поэтому труд-to поддаются стандартизации (Ермолин Г.А., 1986; Егоров A.M., 1988; Lanetti д.н. et al., 1979; Hata L. et al., 1983; (lack а.ї. et al., 1984). В то же время методы анализа должны >твечать современным требованиям: быть высокоспецифичными и [увствительными, информагивными, требовать минимальных количеств юагентов и биопроб, иметь возможность экспрессностл и автоматизации, давать количественную характеристику изучаемых пара-іетров. Таким требованиям в большой степени отвечают методы гаследнего поколения, которые основаны на анализе первой фазы ммунологической реакции - образовании комплекса АГ-АТ и ис-
_ 4 - '
пользуют высокочувствительные способы регистрации отдельных компонентов комплекса - радиоактивную, ферментную или флуорес- . центную метку. Основная особенность этих методов заключается в том, что один из компонентов реакции - АГ или AT - иммобилизован на нерастворимой матрице - твердой фазе. Цленно идея применения твердофазного анализа послужила толчком для развития принципиально новых иммунологических методов - иммунофлуорес-центного анализа (ЙЕНА), иммуноферментного анализа (ИЗА). Необходимо подчеркнуть, что с появлением иммуноферментного.метода для определения АГ и AT в биосубстратах больных начался новый, перспективный этап в совершенствовании диагностики не только ' инфекционных, но и других заболеваний (Падоков Л.Н.,Семенов Б.Ф.» 1989; Дзангиев Б.Б., 1989). Принципиально только методы, базирующиеся на анализе первой фазы иммунологической реакции, способны создать основу современной биотехнологии в иммунохтличе-ской диагностике (Покровский В.И. и др., 1989).
В инфекционной патологии названные методы применяются недостаточно широко. Вместе с тем их использование открывает реальные возмозкности не только для ранней диагностики, но и для более глубокого изучения патогенеза и эпидемиологии инфекционных болезней.
Наиболее перспективно использование этих методов для экспресс-диагностики таких широко распространенных и имеющих боль-' шую социально-экономическую значимость инфекционных заболеваний, как острые кишечные, нейроинфекции, инфекции дыхательных путей. В группе острых кишечных инфекций 50-7(3? приходится на шигеллезы (Наркевич М.И. и др., 1989). Среди нейроинфекции, обусловливающих до сих пор, несмотря на проводимую интенсивную терапию, высокую летальность, длительные сроки нетрудоспособности и в ряде случаев - стойкую инвалидность, видное место
-5--принадлежит ыенингококковой инфекции (Шкровский В.И., 1986; Демина А.А., Девяткина Н.П., Ларина Л.И., 1986). К числу тякело протекающих и часто сопровождающихся осложнениями относится также дифтерия. В лоследние годы заболеваемость ею возросла, причем наиболее поражаемым оказался контингент молодых, работоспособных лиц (Шкровский В.И., Болотовский В.М., Майская Л.М., 1987). Диагностика дифтерии значительно затруднена из-за большого количества случаев бактерионосительства,ангин с сопутствующим выделением коринебактерий, а также из-за атипичности клинического течения у взрослых (Покровский В.И. и др., 1984, 1985).
Цель исследования - совершенствование иммунодиагностики менпнгококкозой инфекции, шигеллезов, дифтерии путем разработки тест-систем Еа основе твердофазного микроанализа, обеспечивающих информативнее тестирование специфической антигенемии и гуморальных антител у больных.
Основкке задачи работы
-
Разработать диагностические тест-системы для обнаружения специфических антигенов и антител при мешшгококковой инфекции ,. шгеллезах и дифтерии на основе методов твердофазного микроанализа - иммуноферментного, иммунофлуоресцентного, ишу-носорбентного.
-
Довести апробацию разработанных тест-систем для установления их клинико-диагностической значимости.
-
Установить закономерности антигенемии и формирования иммунного ответа при названных заболеваниях с помощью разработанных тест-систем.
-
Выявить клинико-иммунологические параллели путем сопоставления результатов специфических иммунологических реакций с клинической формой, периодом и тяжестью течения болезни.
-
Дать сравнительную характеристику примененных в работе методов и обосновать показания к использованию их в практике.
Научная новизна
Разработаны принципы конструирования тест-систем, основанных на методах твердофазного микроанализа - иммуноферментном, ишунофлуоресцентном, иммуносорб'ентном и дано научное обоснование применению методов микроанализа при некоторых бактериальных инфекциях (менингококковая, шигеллезы, дифтерия). Обоснован новый подход к оценке специфических факторов иммунитета и их роли в патогенезе и исходах изучаемых бактериальных инфекций.
При отработке иммуноферментных тест-систем подтверждено предположение о роли "экранирующего барьера", возникающего при иммобилизации избытка связывающего агента на твердую фазу, что сникает чувствительность диагностикума на 30-4С$.
Изучены закономерности динамики специфической антигенемии и дана клинико-патогенетическая значимость ее при бактериальных инфекциях, а также обосновано использование ее количественных показателей для ранней диагностики менингококковой инфекции, шигеллезов, дифтерии.
Впервые применен количественный иммунохимический метод-США) для определения токсигенности бактериальных культур (дифтерийных) .
Показана возможность определения бактериальных токсинов (на примере дифтерийного) не только в свободном состоянии, но и в составе циркулирующих иммунных комплексов.
Практическая значимость
Отработаны параметры конструирования твердофазных диагно-стикумов на основе методов микроанализа и впервые созданы оригинальные тест-системы для количественного определения специфических АГ при менингококковой инфекции, шигеллезах, дифтерии, позволяющие проводить раннюю диагностику этих заболеваний и обеспечивающие более полное выявление инфицированных.
Впервые создана иммуноферментная тест-система для количественного определения противоменингококковых AT.
При анализе большого клинического материала, на примере трех различных по этиологической и патогенетической характеристике бактериальных инфекций, выявлено преимущество иммунофер-ментных диагностикумов по сравнению с диагностикумами, основанными на других методах твердофазного микроанализа. Подготовлены "Методические рекомендации по применению Шк в диагностике бактериальных инфекций".
Показано, что применение 3?(ав ^-фрагментов антител из раз-новидовых антисывороток в процессе получения реагентов при конструировании иммуноферментноя диагностической тест-системы для выявления дифтерийного токсина существенно повышает чувствительность и специфичность этой тест-системы.
Предложен новый аспект использования иммуноферментной диагностической тест-системы - для экспресс-определения токсиген-носги бактериальных культур (на примере дифтерийной).
Разработанные методы оптимизации при конструировании иммуноферментной тест-системы для определения дифтерийного токсина явились основой создания технической документации на производство этого даагносмгкума.
Внедрение результатов. Отдельные фрагменты настоящего исследования защищены охранными документами:
авторское свидетельство СССР й 771931 "Способ диагностики менингококковой инфекции" по заявке В 2746558 с приоритетом от 5 апреля 1979 г.;'
авторское свидетельство СССР Ш 788472 "Способ получения антитело-иммуносорбента к небелковым антигенам" по заявке
№ 2633785 с приоритетом от 23 июня 1979 г.;
. -.авторское свидетельство СССР В 899043 "Способ выявления менингококкового антигена" по заявке J5 2881414 с приоритетом от 5 декабря 1979 г.;
- авторское свидетельство СССР )Ь 1337775 "Способ иммуно-ферментного определения антигенов" по заявке й 3830997 с приоритетом от 26 декабря 1984 г.
Внедрена в промышленное производство и выпускается Пермским НИИВС "Тест-система иммуноферментная для определения антигенов дифтерийного токсина" (Экспериментально-производственный регламент № 69-87)х\
Предложенные методы определения бактериальных антигенов внедрены во 2 КИБ г.Москвы-(гл. врач В.Д.Абубакиров).
Материалы диссертации используются в лекционном курсе на кафедре инфекционных болезней ММСИ им.Н.А.Семашко и кафедре, детских инфекций ЦОЛЙУВ.
Материалы диссертации использованы в "1,'етодических рекомендациях по применению иммуноферментного анализа в диагностике бактериальных инфекций" (Минздрав СССР, 1990 г.).
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на: конференциях отдела инфекционной патологии ЩШИЭ Гйнздрава СССР в 1973-1989 гг., Всесоюзной конференции по клинической-иммунологии (Симферополь, 1981), межведомственном Совете при ГКНТ (Шсква, 1982), Всесоюзной конференции по иммуноферментному -анализу (Москва, 1983), рабочем совещании координационного центра по проблеме гетерогенных сывороток (Пермь, 1983), Всесоюзном симпозиуме "Актуальные вопросы бактериологии и прикладной
х) Разработка тест-системы, создание технической документации и промышленное внедрение осуществлялось совместно с сотрудниками Пермского НИИВС (Л.И.Райхер, И.И.Райхер, Л.Ю.Смуро-ва, Е.Х.Хазина) и ЦНИИЭ Минздрава СССР (Р.Д.Гавряляка).
иммунологии" (Тбилиси, 1984), Всесоюзном семинаре "Современные методы микроанализа" (Тбилиси, 1985), II Пленуме правления Всесоюзного общества микробиологов, эпидемиологов и паразитологов (Нальчик, 1S86), Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы биотехнологии" (Ленинград, 1987), У съезде гигиенистов,-санитарных врачей, эпидемиологов, микробиологов и инфекционистов Узбекистана (Ташкент, 1Э87), пленуме правления Всесоюзного общества инфекционистов (Кемерово, 1988).
Публикации. Ш материалам, диссертации опубликована 41 печатная работа в отечественных- и международных изданиях.
. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения,
четырех глаз, заключения, выводов, указателя литературы. Еиб- .
лиография включает отечественных и иностранных ис-
