Введение к работе
Актуальность проблемы
Трансплантация аллогенных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) является важным компонентом терапии при многих гематологических заболеваниях, врожденных нарушениях иммунной системы, наследственных анемиях, некоторых болезнях обмена и злокачественных новообразованиях (Thomas E.D., 1990; Афанасьев Б.В. и соавт. 1994; Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Савченко В.Г. и соавт. 1996; Румянцев А.Г., 1996; Птушкин В.В., 1997; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2004); однако, поиск подходящего донора костного мозга - дорогой и длительньш путь, и иногда пациент не доживает до трансплантации (Falkenburg J.H.F.,1996; Афанасьев Б.В. и соавт. 1998; Gluckman Е., 2000). Вероятность того, что для пациентов, принадлежащих к этническим меньшинствам, найдется HLA-идентичный неродственный донор, может быть еще меньше, поскольку встречаемость определенных HLA-типов в различных этнических группах значительно варьирует (Armitage J., 1994). Создание банков пуповинной крови (ПК) в значительной степени облегчает поиск материала для трансплантации, что в сочетании с дешевизной получения такого материала и легкой его доступностью является предпосылкой для увеличения количества трансплантаций ГСК ПК (Wagner J. Е., 1992; Harris D. Т., 1996; Kogler G., 1996; Ikuta К., 1998; Rubinstein P., 1999; Gluckman E., 2005). Технологии получения ГСК ПК для последующей криоконсервации требуют разработки условий контроля течения беременности и родов и поиска надежных прогностических факторов пригодности получаемого материала для последующей трансплантации. Известно, что состав клеток ПК отражает течение беременности и родов, а также перенесенных заболеваний. Несмотря на многочисленные исследования клеточного состава ПК (Monroe B.L., 1979; Stokman Р.А., 1992; Alacron Р.А., 1992; Торубарова Н.А., 1993; Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005) отсутствуют референтные значения клеточного состава ПК доношенных и недоношенных новорожденных. Появившиеся в последнее время сообщения о различии клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела новорожденного, вида родоразрешения, сроков, прошедших после родов и сбора ПК до начала процесса обработки, (Cairo M.S., 2005; Aravita S., 2005) демонстрируют влияние множества факторов на клеточный состав ПК и, как следствие этого, на эффективность заготовки трансплантационного материала. Кроме того, ПК имеет некоторые физиологические отличия от периферической крови взрослого человека (Solves Р., 2005; Bradley М.В., 2005), в связи с чем исследование состава и характеристик клеток ПК, проводимое при помощи автоматических счетчиков, не вполне удовлетворительно.
Успех трансплантации во многом зависит от достаточного количества ГСК, поэтому, важным вопросом при применении ПК в клинике является оценка трансплантата, в основе которой лежит определение количества и жизнеспособности ГСК, содержащихся в трансплантационном материале (Bender J.G., 1994; Gonzalez В.Е., 1997; Traineau R., 1998; Allan D.S., 2002; Cotta S.V. et al., 2002; Marino M.P. et al., 2002).
В течение последних 10 лет в качестве источника гемопоэтических стволовых клеток все чаще используют мобилизованную при помощи Г-КСФ периферическую кровь (Bensinger W. et al., 1995; Schmitz N. et al., 1995; Масчан A.A., 1995; Афанасьев Б.В. и соавт. 1996; Савченко В.Г. и соавт. 1996); в связи с чем, важно определить условия и механизмы воздействия Г-КСФ на систему гемопоэза, для получения наиболее эффективного трансплантационного материала (Asano S., 1991; Welte К., et al., 1996; Kronenwett R., et al., 2000; Cutler C, et al., 2001; Maianski NA., et al., 2002).
Использование различных источников ГСК для трансплантации, а также использование множества технологических приемов для получения непосредственного трансплантационного материала из ПК и периферической крови требует тщательного описания и сравнения клеточного состава и характеристик ГСК в различных источниках и определение факторов, оказывающих на них влияние.
Изучение и разработка технологий моделирования биологических свойств ГСК ПК также представляется актуальной задачей, так как в таком случае можно получить возможность влиять на степень и направленность их дифференцировки (Medcalf D., 1989; Ogawa М., 1993; Varnum-Finney В. et al, 1998). Разработка генных векторов «третьей» генерации на базе вируса иммунодефицита человека первого типа позволяет проводить работу с неделящимися клетками, к которым относится большинство ГСК, что дает возможность получить эффективную и безопасную модель для изменения свойств ГСК в клинических целях (Hawley R. et al., 1987; Dull Т. et al., 1998; Sutton R.E., 2002, Marino M. et al., 2002; Follenzi A. 2002). Выбор в качестве индуктора/ингибитора пролиферативной активности стволовых клеток генов из семейства Notch наиболее перспективен, так как они принимают участие в процессах, как самообновления клеточной популяции, так и активации антидифференцировочных клеточных программ (Weinmaster G. et al., 1992; Artavanis-Tsakonas S. et al., 1995; Lewis J., 1996; L. Wu., 2000; Baldi A. et al., 2004).
Таким образом, решение указанных вопросов позволит оптимизировать технологии заготовки, процессинга и модификации ГСК ПК и периферической крови для клинического использования.
Цель исследования:
Разработать и внедрить в практику научно обоснованные методы сбора, тестирования и хранения гемопоэтических стволовых клеток пуповшіной и периферической крови для неродственных трансплантаций, а также изучить возможность моделирования их биологических свойств для клинического применения.
Задачи исследования:
Охарактеризовать клеточный состав ПК, определить количество и субпопуляции CD34+ и CD133+khctok, а также колониеобразующую активность ГСК ПК доношенных новорожденных.
Разработать и внедрить систему критериев для оценки и отбора потенциальных доноров ПК с целью получения максимально эффективного трансплантационного материала.
Изучить механизмы мобилизации ГСК периферической крови при использовании Г-КСФ у здоровых доноров и пациентов с различными онкогематологическими заболеваниями.
Усовершенствовать и внедрить технологии процессинга ПК и мобилизации ГСК периферической крови для получения максимально эффективного трансплантационного материала.
Охарактеризовать клеточный состав и жизнеспособность трансплантационного материала ПК и мобилизованной периферической крови.
Разработать эффективную технологию моделирования биологических свойств ГСК для клинических целей.
Обосновать и усовершенствовать организационные принципы работы банков ПК и стандарты работы с ГСК ПК для практических целей.
Научная новизна
Получены референтные значения состава ПК с использованием автоматического анализатора клеток крови и микроскопии окрашенных мазков, определены величины расхождения результатов и факторы, влияющие на разницу определения. Определено количество основных субпопуляций лимфоцитов, CD34+ и CD133 клеток. Функциональная оценка ГСК ПК доношенных новорожденных изучена на модели колониеобразования in vitro.
Проведена оценка влияния течения беременности и родов, острой и хронической
гипоксии плода на показатели клеточного состава ПК доношенных новорожденных,
впервые показаны различия клеточного состава ПК в зависимости от пола и массы тела
новорожденного, причем эти различия независимы друг от друга.
Впервые получены референтные значения уровня спонтанного апоптоза основных клеточных популяций ПК, обработанной по разработанным стандартам, базирующимися на системе NetCord. Определены степень и характер влияния особенностей течения беременности и родов, а также основных технологических параметров процессинга на жизнеспособность клеток ПК.
Отработана технология процедуры лейкоконцентрации при различных состояниях беременности, родов, новорожденного и технологических параметрах ПК, подробно охарактеризован клеточный состав концентрата ПК, являющегося трансплантационным материалом.
Изучен характер и степень влияния препаратов Г-КСФ на состав и жизнеспособность клеток периферической крови при выполнении протоколов мобилизации гемопоэтических стволовых клеток у здоровых доноров, детей с различными онкогематологическими заболеваниями в ремиссии с целью аутологичной трансплантации и при лечении медикаментозной цитопении. Определены концентрации мобилизующих цитокинов и ферментов - IL-8, G-CSF, ММР-9 - в сыворотке ПК доношенных новорожденных и периферической крови при использовании препаратов Г-КСФ у детей с различными онкогематологическими заболеваниями и здоровых доноров. Определено количество основных субпопуляций лимфоцитов, CD34* и С1МЗЗ+клеток, а на модели колониеобразования in vitro изучено количество и состав ГСК мобилизованной периферической крови и продукта цитафереза, являющегося трансплантационным материалом.
Впервые показана возможность эффективной трансфекции генов в неделящиеся клетки при помощи модифицированного вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1). Впервые на модели NOD/SCID мышей показана возможность изучения гемопоэтической дифференцировки СБ133+клеток ПК человека. Модифицированная авторами векторная система, созданная на базе ВИЧ-1, способная обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в неделящиеся клетки, а также показанное эффективное угнетение колониеобразующей активности и увеличение уровня спонтанного апоптоза CD133+ioieTOK генами Notch 1 и Notch 2, могут быть использованы при моделировании биологических свойств ГСК человека.
Разработан комплекс практических рекомендаций по усовершенствованию технологических операций отбора доноров, сбора, процессинга и тестирования ПК для последующей трансплантации, а также по усовершенствованию протоколов мобилизации ГСК периферической крови.
Практическое значение
Практическое значение работы заключается в установлении референтных значений ПК, как при использовании автоматического анализатора клеток крови, так и при подсчете клеток крови при светооптической микроскопии. Получены значения, характеризующие состав лейкоцитов ПК, которые рекомендуется использовать в качестве факторов, определяющих показания и противопоказания к сбору ПК для безвозмездного донорства ГСК. Кроме того, полученные данные имеют важное практическое значение при проведении технологических расчетов в работе банков стволовых клеток.
Практическое значение имеют данные объективной оценки эффективности методов сбора ПК, различных способов процессинга ПК с целью получения подготовленного к хранению трансплантационного материала, а также выявленные зависимости эффективности процессинга ПК от особенностей течения беременности, родов и ряда технологических элементов.
Эффективность мобилизации и сбора ГСК периферической крови зависит от количества циркулирующих гранулоцитов и ряда вторичных посредников (IL 8, ММР-9), что позволяет оптимизировать процедуру мобилизации и получения более эффективного трансплантационного материала у пациентов в ремиссии различных онкогематологичсских заболеваний.
Полученные сравнительные характеристики количества и жизнеспособности ГСК в трансплантационном материала ПК и мобилизованной периферической крови могут использоваться в качестве стандартов по определению качества заготавливаемого трансплантационного материала в банке стволовых клеток.
Модифицированная авторами векторная система, созданная на базе ВИЧ-1, способная обеспечить эффективный перенос исследуемого генетического материала в неделящиеся клетки, а также показанное эффективное влияние генов Notch 1 и Notch 2 на колониеобразующую активность и уровень спонтанного апоптоза СГЛЗЗ+клеток могут быть использованы при моделировании биологических свойств стволовых клеток человека. Отработана модель для изучения приживления и дифференцировки различных популяций гемопоэтических стволовых клеток человека на основе трансплантации предварительно облученным NOD/SCID мышам.
Практическое значение выполненной работы заключается в разработке рекомендаций по отбору потенциальных доноров ПК, методикам сбора ПК и соблюдению временных параметров в зависимости от индивидуальных характеристик каждого образца ПК.
Положения, выносимые на защиту
Трансплантационный материал ПК содержит около 11x106 CD34+KneTOK, что меньше, чем в Г-КСФ мобилизованной периферической крови здоровых доноров (104х106 СТ)34+клеток); однако популяция ГСК ПК содержит статистически значимо большее количество более ранних CD133+ предшественников гемопоэза, мезенхимальных и эндотелиальных клеток-предшественников, по сравнению с трансплантационным материалом, полученным из мобилизованной Г-КСФ периферической крови (р<0,0001).
Условием получения наиболее эффективного трансплантационного материала служат обоснованные стандарты сбора (соблюдение стандартного списка противопоказаний для отбора доноров, срок гестации от 37 до 41 недель, физиологические роды, сбор ПК до отделения плаценты, в срок до 5 минут после родов), процессинга (проведение процедуры лейкоконцентрации в условиях GMP не позднее 18 часов после родов в системе, максимально ограничивающей контаминацию, с использованием стандартного метода двойного центрифугирования или аппаратного автоматического выделения), количественной и качественной оценки материала при помощи автоматического анализатора клеток крови, учитывающего наличие нормобластов, определение количества и состава ГСК с учетом количества CD34+, CD133+, CD3+, СШб+56+ клеток, определения эффективности клонирования в 14 суточной культуре в метилцеллюлозе с учетом КОЕ-ГЕММ, КОЕ-ГМ, КОЕ-Г, КОЕ-М, КОЕ-Э, уровня спонтанного апоптоза (РҐУАппехіп ^клетки).
Клетки ПК могут служить моделью для регуляции пролиферативной активности ГСК, что может быть использовано для предтрансплантационной подготовки материала для клинического использования, и подтверждено экспериментальными исследованиями. Трансфекция генов системы Notch с помощью векторной системы на базе модифицированного ВИЧ-1 позволяет изменять пролиферативную активность и жизнеспособность CD133YCK ПК.
Произведена оценка трансплантационного материала, полученного из периферической крови, мобилизованной Г-КСФ. При использовании препаратов Г-КСФ в периферической крови увеличивается количество всех субпопуляций лейкоцитов. Эффект мобилизующего действия Г-КСФ зависит от количества неитрофилов перед началом мобилизации и связан со степенью повышения концентрации в сыворотке крови IL 8 и ММР-9.
5. Усовершенствованы и внедрены в работу БСК стандарты сбора, процессинга и тестирования пригодности трансплантационного материала ПК для клинического использования.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в работу ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, ГУЗ «Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения г. Москвы». Основные положения и выводы диссертации используются в подготовке специалистов гематологов, онкологов и иммунологов на кафедре клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ. По теме диссертации опубликовано 38 работ, в том числе пособие для врачей «Влияние Г-КСФ на клеточный состав крови и костного мозга человека» (2003) и монография «Биологические основы и перспективы терапии стволовыми клетками» (2005).
Результаты работы доложены на IV Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 1997 г., I Съезде детских онкологов и гематологов России, Москва, в ноябре 1997 г., I Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 1999 г., VII Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 2000 г., П Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2001 г., Ш Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2003 г., IV Российском симпозиуме «Биологические основы терапии онкогематологических заболеваний у детей», Москва, в феврале 2005 г., I Всероссийском съезде темагтологов, 16 - 18 апреля 2002 г., IX Российском Национальном конгрессе «Человек и Лекарство», Москва, в апреле 2002 г., 7th Meeting of the European Hematology Association, Florence, Italy в июне 2002., X Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» в апреле 2003 года, Москва., 5th International Symposium on Leukemia and Lymphoma, Amsterdam, The Netherlands в марте 2003, 8th Annual Congress of the European Hematology Association, Lyon, France в июне 2003, 9й Congress of the European Hematology Association, Geneva, Switzerland в июне 2004, 6th International Symposium and Expert Workshops on Leukemia and Lymphoma, Amsterdam, the Netherlands в марте 2005, ХП Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» в апреле 2005, 31th Annual Meeting of the European Group for Blood and Marrow Transplantation, Prague, Czech Republic в марте 2005, на научном конгрессе Science Workshop, Halwerston, Texas, в апреле 2004 г., на Национальном конгрессе CAGT Cell & Gene Therapy, The Woodlands, Houston, Texas, в марте 2003., на
съезде Медицинского Колледжа Бэйлор, The Warwick Hotel, Houston, Texas, в феврале 2004., собраниях лабораторий департамента Молекулярной вирусологии и микробиологии, Медицинского Колледжа Бэйлор, Houston, Texas, в 2002-2004 гг., на конгрессе «Национальные дни лабораторной медицины России», Москва, в октябре 2005, на X Съезде педиатров России, Москва, в феврале 2006, и Российском Съезде гематологов и трансфузиологов, Москва, в апреле 2006, Всероссийской конференции РНОИ, Курск, в мае 2006, Российском конгрессе «Новые технологии в перинатологии», Москва, в ноябре 2006.
Апробация диссертации
Диссертация апробирована на совместной научно-практической конференции сотрудников клинических и лабораторных отделов ФГУ ФНКЦ детской гематологии, онкологии и иммунологии Росздрава, кафедр факультетской педиатрии Московского факультета и клинической гематологии, онкологии и иммунопатологии с курсом поликлинической и социальной педиатрии ФУВ РГМУ, ГУЗ «Банк стволовых клеток» Департамента здравоохранения г. Москвы, Российской детской клинической больницы 18 сентября 2006 г.
Структура и объем диссертации
