Содержание к диссертации
Введение
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА I. title1 ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И ПРОИСХОЖДЕНИЕ /-ЛАКТАМАЗ 9 ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ^-ЛАКТАМАЗ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 13 2.1. Субстратные спектры -лактамаз и новые -лактамные антибиотики 19 2.2. Ингибиторы и индукторы -лактамаз 20 ГЛАВА 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ. /- ЛАКТАМАЗ 26 3.1. Микробиологические методы определения -лактамаз 26 3.2. Методы регистрации j3-лактамазной активности 26 3.3. Аналитическое изоэлектрическое фокусирование .jS-лактамаз 31 3.4. Методы выделения и очистки .р-лактамаз 32 ГЛАВА 4. СИСТЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ Л-ЛАКТАМАЗ... 35 4.1. Основные принципы классификации -лактамаз 35 4.2. Использование ^-лактамаз при скрининге ./з-лактамных структур и характеристике новых полусинтетических 3-лактамных соединений 40 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Бактериальные штаммы - источники Ji-лактамаз title2 44
2. Антибиотики и основные реактивы 44
3. Методы очистки и изучения jS-лактамаз 45
РЕЗУЛЬТАТЫ
ГЛАВА I. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ И ХАРАКТЕРИСТИКИ СВОЙСТВ J3 -ЛАКТАМАЗ. 48
1.1. Определение л-лактамазной активности модифицированным микроиодометрическим методом... 49
1.2. Модифицированный потенциометрический метод определения активности- jG-лактамаз 54
1.3. Метод препаративного изоэлектрического фокусирования jS-лактамаз. 61
ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И КЛАССИФИКАЦИИ jS-ЛАКТАМАЗ ИЗ ПОЛИРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 65
2.1. Характеристика ферментов цефалоспориназного типа действия 67
2.2. Свойства пенициллиназ различных классов 71
ГЛАВА 3. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ J3-J1AKTAMA3 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭВМ 78
3.1. Вывод расчетной формулы 79
3.2. Применение программы BLAC ДЛЯ анализа спектров jB-лактамазной активности и подтверждение данных ЭВМ методами препаративного разделения ферментов 81
ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА /-ЛАКТАМАЗЫ ПЕНИЦИЛЛИНАЗНОГО ТИПА, ОБРАЗУЕМОЙ CITRQBACTER FREUITOII 1039 87
ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА jtf-ЛАКТАМАШ ЦЕФАЛ0СП0РИНАЗНОГО ТИПА ИЗ КЛЕТОК E1TTER0BACTER AEROGMES 6803 101
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 114
ВЫБОЛИ 122
ЭКСПЕРЕМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ
РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ 124
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 125
- 9 ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА ^-ЛАКТАМАЗ ГРАМПОЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ 13 2.1. Субстратные спектры -лактамаз и новые -лактамные антибиотики 19 2.2. Ингибиторы и индукторы -лактамаз 20 ГЛАВА 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ. /- ЛАКТАМАЗ 26 3.1. Микробиологические методы определения -лактамаз 26 3.2. Методы регистрации j3-лактамазной активности 26 3.3. Аналитическое изоэлектрическое фокусирование .jS-лактамаз 31 3.4. Методы выделения и очистки .р-лактамаз 32 ГЛАВА 4. СИСТЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ Л-ЛАКТАМАЗ... 35 4.1. Основные принципы классификации -лактамаз 35 4.2. Использование ^-лактамаз при скрининге ./з-лактамных структур и характеристике новых полусинтетических 3-лактамных соединений 40 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1.
- Определение л-лактамазной активности модифицированным микроиодометрическим методом...
link1 История открытия, биологическая роль и происхождение /-лактамаз
Яактамазы составляют обширную группу ферментов, катали--зирующих расщепление -лактамного кольца у природных и полусинтетических пенициллинов, цефалоспоринов и монобактамов. Расщепление jS-лактамного кольца ведет к потере антибиотической активности.
Инактивация, пенициллина бесклеточными экстрактами Е.СОІІ была обнаружена еще в 1940 г. Спустя четыре года для названия фермента был использован термин "пенициллиназа". В 1.949 г. в качестве продукта.гидролиза была идентифицирована пешщиллоиновая кислота /13,14,84,85/. ..
Уже в 40-х - 50-х годах было показано, что пенициллиназяой активностью обладают различные виды грамположителышх и грамот-рицательных бактерий. Свойства пенициллиназ разных организмов нередко не совпадали.
Практически единственным -лактамным антибиотиком, широко применявшимся в клинике в указанные годы, являлся бензилпеницил-лин, поэтому основное внимание оказалось сосредоточенным на пе-нициллиназах грамположительных организмов.
К середине 60-х годов, после внедрения в лечебную практику пенициллинов широкого спектра действия, а также первых цефалоспоринов резко возрос интерес к пенициллиназам и "цефалоспорина-зам" грамотрицательных бактерий /6/. С начала 60-х годов для их обозначения используется название " J3 -лактамазы". По классификации и номенклатуре ферментов их индексы - 3.5.2.6 и 3.5.2.8 соответственно.
Мире ферментами: они обнаружены в клетках прокариот - не только эубактерий, но и актиномицетов и миксобактерий /61,66,105,114, 159,160/, в клетках микроорганизмов эукариот, например, дрожжей /85/ .
В последние годы, наряду со все большим вниманием к у?-лактамазам в связи с антибиотикорезистентностью патогенных бактерий, опубликован ряд исследований, посвященных выяснению их биологической роли в природных условиях, установлению их происхождения и степени родства с теми или иными ферментами первичного метаболизма микробной клетки.
Расщепление /-лактамного кольца у js-лактамных антибиотиков происходит при контакте не. только с js-лактамазами, но и.некоторыми, ферментами, завершающими синтез пептндогликана клеточной стенки бактерий. Эти ферменты играют роль мишеней для /-лакта-мов. Их инактивация: приводит к антибиотическому эффекту. Расщепление и теми и другими ферментами j -лактамного кольца послужило основанием для предположения о возможности эволюционного родства между выполняющими защитные функции js-лактамазами и ферментами, завершающими образование пептндогликана у бактерий, в частности, D-аланин карбоксипептидазами /213,223/..
D-аланин карбоксипептидазы, также как и з-лактамазы составляют группу ферментов с заметными различиями в свойствах. Некоторые из них обладают фактически, js-лактамазной активностью, но скорость отделения продукта гидролиза антибиотика от фермента крайне невысока. Сопоставление аминокислотной последовательности ряда jJ-лактамаз и D-аланин карбоксипептидаз, выделенных из
Бактериальные штаммы - источники Ji-лактамаз
Источниками изучавшихся /-лактамаз служили полирезистентные штаммы грамотрицательных бактерий, выделенные в ряде хирургических и урологических клиник г.Москвы, а также, в отдельных случаях, трансконъюганты, полученные в лаборатории химиотерапии ВНИИА в результате передачи R плазмид из некоторых клинических штаммов грамотрицательных бактерий в Е.СОІІ.
Бесклеточные (неочищенные) препараты s-лактамаз были получены из 50 клинических штаммов и 6 трансконъюгантов. Использованные клинические штаммы принадлежали к 10 видам бактерий (относящихся к 7 родам): Escherichia coli , Proteus vulgaris , Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacer freundii, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca.
Штаммы были устойчивы к ампициллину ( 125 мгк/мл), стрептомицину ( 25.мкг/мл), тетрациклину ( 50 мкг/мл), хлорамфениколу ( 25 мкг/мл).
Трансконъюганты (реципиент, как указывалось выше, E.coli) содержали R плазмиды из Citrobacter freundii и различных штаммов Pseudomonas aeruginosa.
2. Антибиотики и основные реактивы
При изучении субстратного спектра и кинетических свойств /-лактамаз были использованы препараты бензилпенициллина, ампициллина, метициллина, оксациллина, диклоксациллина, карбеницилли-на и цефалексина отечественного производства, цефазолнн фирмы Eli billy and Со (США), цефалоридин, цефуроксим и цефалотин фирмы ПЛИВА (ГДР).
При проведении препаративных и других исследований использовались: сефадексы - Pharmacia, Швеция; ДЭАЭ-целлюлоза - Whatman, Великобритания, оервалиты (амфолины), цитохром с фиртлы Serva, Швеция; полиакриламид, трипсин, пиридоксаль - 5 -фосфат протаминсуль-фат - Reanai, Венгрия; РНК-аза фирмы Sigma, бычий сывороточный альбумин, яичный альбумин - Calbiochem, США.
3. Методы очистки и изучения _/}-лактамаз
Исходные культуры бактерий хранились на мясо-пептонном агаре при +5С. Клетки, используемые для выделения -лактамаз, выращивали в течение 18 часов в бульоне Хоттингера, рН 7,0,при 37 на качалках (220 об/мин). Объем среды - 200 мл (в колбах на 750 мл).
Выращенные клетки отделяли от среды центрифугированием, промывали, вновь. суспендировали в дистиллированной воде до концентрации 10 млрд. на мл в объеме 10 мл и обрабатывали ультразвуком с частотой 35 кГц в течение 4 минут при 5С (УЗ-дезинтегратор, УДН-І). После центрифугирования при 20 000 g с охлаждением (цент рифуга Beckman G-2i) получали супернатантную фракцию, которая использовалась в качестве бесклеточного (неочищенного) ферментного препарата.
Для определения jS-лактамазной активности использовали модифицированные наш потенциометрический и микроиодометрический методы. Описание.методов и их модификаций приводится ниже в отдельных разделах.
Определение л-лактамазной активности модифицированным микроиодометрическим методом
Апробирование некоторых описанных в литературе и часто используемых методов определения активности s-лактамаз, разработанных применительно,в первую очередь,к jS-лактамазам грамполо-жительных бактерий и бензилпенициллину как субстрату, показало, что их применение имеет существенные ограничения,особенно при сравнительных исследованиях, проводимых с набором js-лактамаз.
Это обусловлено чувствительностью, причем неодинаковой у отдельных -лактамаз (из грамотрицательных бактерий, в частности) к некоторым из применяемых при определении их активности реагентов; далее, тем, что продукты ферментативного гидролиза различных -лактамных структур (на определении которых непосредственно основан конкретный метод) могут иметь неодинаковую стабильность. Поскольку разнообразие jS-лактамных антибиотиков, внедряемых в . клинику и соответственно изучаемых в качестве субстратов jS-лак-тамаз, постоянно возрастает, указанное обстоятельство требует все большего внимания.
В случае некоторых из применяемых методов на точность определения влияет непостоянство буферной емкости растворов по мере протекания ферментативной реакции, не всегда соблюдаемое строгое постоянство условий при протекании последней и т.д.
В данной главе описаны разработанные нами модификации двух методов определения активности -лактамаз (каждый из которых имеет свою область применения), позволяющие повысить точность определения и получать более объективные результаты при сравнении свойств jS-лактамаз разного происхождения.
Описан также модифицированный применительно к -лактамазам метод изоэлектрического фокусирования. Модификация метода позволила использовать его в препаративных целях. Кроме того, уменьшена возможность инактивации ферментного белка при проведении процедуры изоалектрофокусирования.
