Электронная библиотека диссертаций и авторефератов России
dslib.net
Библиотека диссертаций
Навигация
Каталог диссертаций России
Англоязычные диссертации
Диссертации бесплатно
Предстоящие защиты
Рецензии на автореферат
Отчисления авторам
Мой кабинет
Заказы: забрать, оплатить
Мой личный счет
Мой профиль
Мой авторский профиль
Подписки на рассылки



расширенный поиск

Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Хоменко Инна Петровна

Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера
<
Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера
>

Диссертация - 480 руб., доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Автореферат - бесплатно, доставка 10 минут, круглосуточно, без выходных и праздников

Хоменко Инна Петровна. Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера : Дис. ... канд. биол. наук : 14.00.16 Москва, 2006 141 с. РГБ ОД, 61:06-3/986

Содержание к диссертации

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы 12

1.1. Болезнь Альцгеймера и медикаментозная терапия 13

1.2. Нейротоксические механизмы действия Р-амилоидного пептида: накопление свободных радикалов, изменение кальциевого гомеостаза и воспалительный ответ 21

1.2.1. Накопление свободных радикалов 23

1.2.2. Изменение кальциевого гомеостаза 25

1.2.3. Воспалительный ответ 26

1.2.4. Активация сигнальных путей 27

1.3. Белки теплового шока и их роль в защите мозга от нейродегенерации 27

1.4. Адаптация к факторам среды и перспективы немедикаментозной терапии и профилактика БА 34

1.4.1. Адаптация к гипоксии 42

1.4.2. Прекондиционирование и адаптация к оксидативному стрессу 45

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 48

2.1. Эксперименты на животных 50

2.1.1. Адаптация к периодической гипобарической гипоксии 51

2.1.2. Моделирование нейродегенеративного процесса 52

2.1.3. Поведенческие тесты 53

2.1.3.1.Условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) 53

2.1.3.2. Тест экстраполяционного избавления (ТЭИ) 55

2.1.3.3. Тест "открытое поле" 55

2.1.4. Забор и хранение тканей отделов мозга 56

2.1.5.Определение содержания вторичных продуктов перекисного окисления липидов в гомогенатах структур головного мозга крыс 56

2.2. Эксперименты на культуре клеток 58

2,2.1. Процедура выращивания и пересадки клеток 58

2.2.2.Повреждение клеток оксидативным стрессом и измерение их метаболической активности (МТТ-тест) 59

2.2.3. Адаптация клеток к неповреждающим воздействиям оксидативного стресса 60

2.2.4. Оценка содержания белков теплового шока (Вестерн-блот анализ) 61

2.2.5. Ингибирование синтеза белков теплового шока 63

2.3. Статистическая обработка данных 64

ГЛАВА 3. Результаты исследований и их обсуждение 65

3.1. Адаптация к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций, вызванное введением 3-амилоида, у крыс линии Вистар 65

3.2. Адаптация к гипоксии ограничивает оксидативный стресс в гиппокампе, вызванный введением Р-амилоида, у крыс линии Вистар 69

3.3. Различия в устойчивости крыс Вистар и Август к нейродегенеративному повреждению мозга 70

3.4. Прекондиционирование и адаптация к Н2О2 защищают изолированные нейроны от гибели, вызванной последующим воздействием оксидативного стресса 74

3.5. Белки теплового шока вовлечены в адаптационную защиту нейронов от оксидативного повреждения 94

3.6. Ингибитор синтеза белков теплового шока, кверцетин, устраняет защитный эффект адаптации нейронов к Н2О2 98

3.7. Обсуждение результатов 100

Выводы 112

Литература 114

Введение к работе

Актуальность исследования

Старение является главным фактором риска нейродегенеративных нарушений, таких как болезнь Альцгеймера (БА), Паркинсона, и число людей с этими тяжелыми состояниями быстро увеличивается. БА представляет собой главную причину слабоумия и поражает некоторых людей уже в сорока- и пятидесятилетнем возрасте со всем специфическим сочетанием клинических и патологических признаков. Это заболевание убивает сотни тысяч человек в год (Вуртман, 1985; Reiman et al., 2004). По приблизительным оценкам демографического прогноза Организации Объединенных Наций, число людей старше 80 лет в 2050 году приблизится к 370 млн (Suh, Checler, 2002). В настоящее время известно, что 50% людей старше 85 лет страдают болезнью Альцгеймера. Следовательно, если данная статистика верна, то менее чем через 50 лет свышеЮО миллионов человек во всем мире будут поражены слабоумием и потребуют огромных затрат на лечение и уход (Suh, Checler, 2002; Di et al., 2005).

Это заболевание, впервые описанное немецким невропатологом Алоисом Альцгеймером в 1906 г. и названное его именем, по-прежнему является неразгаданной загадкой, поскольку до сих пор неизвестны средства, способные остановить безжалостное течение этой болезни. Различные фармацевтические препараты, применяемые для профилактики и лечения БА, как правило, обладают весьма ограниченными возможностями и большим количеством побочных эффектов. Поэтому серьезное внимание в настоящее время уделяется средствам, которые могли бы повысить адаптивный потенциал и мобилизовать защитные системы организма. Вместе с тем сейчас становится все более очевидным, что долгое время после начала БА ее развитие сдерживается эндогенными системами защиты мозга, которые включают антиоксидантную систему, систему белков теплового шока (HSPs), оксида азота (NO) и другие

так называемые стресс-лимитирующие системы (Meerson, 1984; Malyshev, Manukhina, 1999; Манухина, Малышев, 2000).

Таким образом, факторы, активирующие эндогенные защитные системы, могут оказывать нейропротекторное действие. Эффективным альтернативным способом стимулирования эндогенной защиты организма, которое может составить альтернативу медикаментозной терапии, является адаптация организма к умеренному, дозированному воздействию факторов окружающей среды, таких как гипоксия, стресс, тепло, физическая нагрузка и т.д. (Меерсон и др. 1993 а). Известно, что ключевая роль в формировании адаптационной защиты принадлежит активации синтеза стресс-белков (HSPs), которые в настоящее время считаются важным компонентом внутриклеточной протекторной системы, обладающей адаптогенными, антиоксидантными, цитопротекторными и антиапоптотическими свойствами (Манухина, Малышев, 2000; Malyshev, Manukhina, 1999; Meerson et al., 1992).

В соответствии с вышеизложенным, цель настоящего исследования состояла в изучении возможности нефармакологической адаптационной защиты мозга и определении роли HSPs в эндогенных нейропротекторных механизмах, формирующихся на уровне клеток и целого организма.

В рамках поставленной цели решались следующие основные задачи:

  1. Оценить возможность предупреждения нарушений когнитивных функций у животных (крыс линии Вистар) с помощью адаптации к гипоксии на экспериментальной модели болезни Альцгеймера.

  2. Оценить возможность ограничения индукции оксидативного стресса в гиппокампе крыс линии Вистар с помощью адаптации к гипоксии.

  3. Сопоставить устойчивость к нейродегенеративному повреждению мозга у крыс линий Август и Вистар, обладающих различной врожденной устойчивостью к острому стрессу.

  4. Оценить возможность адаптационной защиты нервных клеток гиппокампа мыши НТ22 в культуре от гибели, вызванной оксидативным стрессом.

5. Изучить возможную роль HSPs в нейропротекторном эффекте адаптации in vitro.

Научная новизна исследования определяется следующими основными результатами.

Впервые продемонстрирована возможность предупреждения и/или ограничения нейродегенеративного повреждения нейронов мозга и сопутствующих поведенческих нарушений у крыс Вистар с помощью предварительной адаптации к гипоксии.

В экспериментах in vivo впервые установлено, что один из механизмов защитного действия адаптации к гипоксии на когнитивную функцию может быть связан с ограничением оксидативного стресса в гиппокампе.

Впервые показано, что крысы линий Август и Вистар, обладающие разной врожденной устойчивостью к острому стрессу (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996), различаются также по устойчивости к нейродегенеративному процессу по показателям поведенческих реакций и по уровню интенсивности свободнорадикального окисления в структурах мозга.

Разработана модель дозированной адаптации культуры нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу, обладающая защитным эффектом. Таким образом, впервые установлено, что адаптационная защита может формироваться на уровне изолированных нервных клеток в отсутствие нейрогуморальных факторов.

Впервые установлено, что один из механизмов адаптации нейронов гиппокампа к неповреждающему оксидативному стрессу связан с увеличением синтеза HSP70.

Теоретическое значение работы определяется тем, что в ней доказана возможность адаптационной защиты мозга и ограничения поведенческих нарушений у крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера; показано, что

устойчивость к нейродегенеративным повреждениям мозга в значительной степени определяется врожденной активностью защитных стресс-лимитирующих систем; доказана возможность формирования адаптации на клеточном уровне в отсутствие нейрогуморальных факторов; раскрыта роль HSPs в защитных эффектах адаптации на клеточном уровне.

Практическое значение работы состоит в том, что результаты работы
позволяют обосновать новые подходы для немедикаментозного

предупреждения болезни Альцгеймера и нейродегенеративных расстройств. Это в перспективе может обеспечить существенный прогресс в клинике болезни Альцгеймера и других тяжелых заболеваний человека, связанных с нейродегенеративными повреждениями головного мозга.

Положения, выносимые на защиту:

  1. Адаптация организма к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций у крыс Вистар, вызванное введением Ар, и ограничивает оксидативный стресс, индуцированный в гиппокампе.

  2. Крысы линии Август, обладающие повышенной врожденной устойчивостью к острому стрессу, по сравнению с крысами линии Вистар, более устойчивы к развитию нейродегенеративного процесса, вызванного введением Ар.

  3. Адаптационная защита от оксидативного стресса может формироваться на клеточном уровне в отсутствие нейрогуморальных влияний.

  4. Стресс-белки HSP70 вовлечены в формирование адаптационной защиты на клеточном уровне.

Апробация работы

Основные результаты работы доложены на Международной конференции по болезни Альцгеймера (Cold Spring Harbor Laboratory, США, 2002), V международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Инсбрук, Австрия, 2003),

Международной конференции "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2003), XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), научной конференции "Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты" (Москва, 2005), 4-ой Национальной научно-практической конференции с международным участием "Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека" (Смоленск, 2005), 4-ой Российской конференции с международным участием "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва, 2005). На III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004) был получен диплом за лучшую научную работу "Конкурса молодых ученых".

Белки теплового шока и их роль в защите мозга от нейродегенерации

Белки теплового шока (HSPs) являются объектами исследования в течение многих лет. Они характеризуются как семейство высоко консервативных и универсально индуцибельных белков, встречающихся почти во всех организмах и культивируемых клетках в ответ на стресс (Chopp et al., 1989). Первым об этих белках упомянул Ritossa (1962). Сейчас хорошо известно, что живые клетки - от растений до людей - реагируют на тепловой и другие физиологические, или патологические стрессы синтезом HSPs. Против последующего повреждения HSPs действуют путем увеличения толерантности организма (Lu et al., 2004).

В настоящее время обнаружены HSPs с молекулярным весом 16, 22, 28, 32, 70, 80, 90, 100, 110 кДа. Из-за высокой насыщенности тканей организма при самых разных стрессорных воздействиях белками теплового шока с молекулярным весом 70 кДа эти белки привлекли особое внимание и оказались наиболее изученными.

HSP70 делятся на две группы: конститутивные и индуцибельные. Конститутивные HSP70 имеют высокий базальный уровень и при стрессе индуцируются слабо. Индуцибельные, напротив, в нормальных условиях практически не обнаруживаются, но при стрессе их синтез резко увеличивается. Наиболее важную роль конститутивные HSP70 играют в свертывании третичной и четвертичной структур белков (Morimoto et al., 1994). HSP70 связываются с вновь синтезированными цепями белков в тех областях, где может произойти нежелательное гидрофобное слипание белковых цепей друг с другом. Затем, благодаря энергии АТФ, HSP70 транспортирует белковую цепь или к эндоплазматическому ретикулуму, или к митохондриям, или к аппарату Гольджи. Там происходит передача белковой цепи через мембрану на другой белок теплового шока. И далее уже эти HSPs органелл регулируют формирование окончательной субъединичной структуры белка.

Стрессорное повреждение клетки приводит к тому, что многие внутриклеточные белки частично денатурируют. При этом обнажаются гидрофобные области, благодаря которым происходит слипание поврежденных белков с образованием нерастворимых агрегатов. Одновременно стресс также резко усиливает синтез индуцибельных HSP70. Эти HSP70 имеют высокое сродство к денатурированным белкам (Blond-Elguindi et al., 1993). Взаимодействуя с гидрофобными поверхностями, HSP70 ограничивают дальнейшую агрегацию белков. Кроме этого, за счет энергии АТФ происходит изменение конформации как самого HSP70, так и денатурированного белка, с которым HSP70 был связан (Todd et al., 1994). В результате происходит ослабление гидрофобных связей между поврежденными белками, белки освобождаются и приобретают исходную пространственную структуру (Pelham, 1986).

Функции, которые HSPs выполняют в регуляции правильного свертывания вновь синтезированных белков и в дезагрегации аномальных белковых агрегатов обозначают как шапероные функции, а сами белки теплового шока часто называют шаперонами.

Очевидно, что не все белки после дезагрегации приобретут нативную структуру; часть из них по-прежнему останется необратимо поврежденными. Но природа предусмотрела несколько способов утилизации таких клеточных "шлаков", и в двух из них - лизосомальной деградации и убиквитин-зависимом протеолизе - участвуют HSPs. В этом случае HSP70 выполняют транспортную функцию либо облегчая перенос денатурированного белка к лизосомам (Chiang et al., 1989), либо доставляя комплекс протеолитических ферментов к денатурированному белку (Mayer et al., 1991).

Экспрессия генов HSP70 регулируется фактором транскрипции HSF1 (heat shock transcription factor). HSF1 и HSP70 вместе с механизмами их активации и синтеза представляют собой внутриклеточную стресс-сенсорную систему, которая воспринимает, оценивает и соответствующим образом отвечает на внутри- и внеклеточные стрессорные сигналы (Abravaya et al., 1992). Эти сигналы могут появляться в результате действия факторов внешней среды, таких как повышенная температура, токсические, органические и неорганические химические соединения, микробные патогены и другие.

В настоящее время стресс-белки семейства HSP70 рассматриваются как цитопротекторные факторы. Экспрессия этих белков тесно связана с экспрессией белка-предшественника Ар. HSPs регулируют пути апоптоза, подавляют продукцию свободных радикалов, стабилизируют кальциевый гомеостаз в клетке и играют важную роль в развитии заболеваний, связанных с нарушениями конформации белков, к которым относится и БА (Renkawek et al., 1993;Pappollaetal., 1996).

У больных БА содержание мРНК HSP70 значительно ниже, чем у больных с сосудистой деменцией и у недементных испытуемых. Предполагается, что низкий уровень мРНК конститутивных HSP70 при БА играет важную роль в развитии БА и что определение мРНК HSP70 может быть полезно для диагностики БА (Wakutani et al., 1995). Getchell и соавторы (1995) считают, что возрастное снижение HSP70 в нейронах можно объяснить их большей уязвимостью к стрессу.

Неизвестно, какие нарушения регуляции процесса синтеза HSPs приводят к ослаблению защитных механизмов при БА. Однако изучение распределения HSPs при БА позволило предположить, что эти белки образуются в ответ на различные стрессорные стимулы, как эндогенные, так и экзогенные. Это предположение подтверждается многочисленными исследованиями, продемонстрировавшими развитие стресс-реакции в мозге при БА (Shanavas, Papasozomenos, 2000).

Адаптация к факторам среды и перспективы немедикаментозной терапии и профилактика БА

Адаптация организма к факторам среды характеризуется постепенным угасанием стресс-реакции и формированием защитных эффектов (Меерсон, 1993а; Meerson, 1984).

Процесс приспособления к факторам среды или адаптация играет решающую роль в сохранении устойчивости организма в различных условиях. Существует генотипическая адаптация, в результате которой на основе наследственности, мутаций и естественного отбора сформировались современные виды животных и растений. Комплекс видовых наследственных признаков - генотип, сформированный в процессе такой адаптации и становления вида, представляет основу формирования следующего этапа адаптации, приобретаемую в процессе индивидуальной жизни. Этот вид адаптации - фенотипическая адаптация - формируется в процессе взаимодействия особи с окружающей средой и обеспечивается глубокими структурными изменениями организма (Меерсон, 1993а, б).

Таким образом, фенотипическую адаптацию можно определить как развивающийся в ходе индивидуальной жизни процесс, в результате которого организм приобретает отсутствовавшую ранее устойчивость к определенному фактору среды и, таким образом, получает возможность жить в условиях, ранее не совместимых с жизнью, и решать задачи, ранее не разрешимые (Меерсон, 19936). Генетическая программа организма обеспечивает реализацию только тех адаптационных реакций, которые жизненно необходимы в данных условиях, и за счет этого - экономное расходование энергетических и структурных ресурсов организма. Ключевым звеном механизма, обеспечивающего этот процесс, является существующая в клетках взаимосвязь между функцией и генетическим аппаратом. Запуск этого процесса осуществляется в результате развития стресс-реакции в ответ на действие фактора среда, к которому проводится адаптация.

При рассмотрении различных адаптационных реакций организма показано, что их развитие приводит к тому, что организм приобретает новое качество устойчивости к фактору, к которому приобретена адаптация. Однако, благодаря широкому спектру структурных изменений, адаптация к одному фактору нередко защищает организм не только от самого этого фактора (прямой защитный эффект), но и от нескольких других (перекрестные защитные эффекты). Значительная часть таких защитных эффектов нашла применение в клинике, при этом, такие защитные эффекты адаптации могут быть воспроизведены не только до встречи с возможными повреждающими факторами, но и на фоне протекающей болезни. Это делает возможным не только адаптационную профилактику, но и адаптационную терапию (Меерсон, 19936).

В развитии адаптационных реакций прослеживается два этапа: этап срочной, но несовершенной адаптации и последующий этап относительно устойчивой и достаточно совершенной долговременной адаптации (Меерсон, 1993а, б). Срочный этап возникает непосредственно после начала действия раздражителя и реализуется на основе готовых, ранее сформировавшихся биологических механизмов. Важнейшая черта этого этапа адаптации состоит в том, что деятельность организма протекает на пределе его физиологических возможностей и далеко не в полной мере обеспечивает необходимый адаптационный эффект. На этом этапе наблюдается значительная стресс-реакция, характеризующаяся увеличением концентрации катехоламинов и кортикостероидов, эозинопенией и т.п. (Меерсон, 19936). Еще одним существенным компонентом срочной адаптации может быть более или менее выраженное повреждение организма.

Долговременный этап адаптации формируется постепенно в результате длительного или многократного действия на организм факторов среды. По сути, он развивается на основе многократной реализации срочной адаптации, при этом на основе накопления количественных изменений формируется качественное - организм превращается в адаптированный. Таким образом, именно долговременная адаптация обеспечивает расширение возможностей осуществления физиологических функций и существование в условиях несовместимых с жизнью неадаптированного организма. Переход от срочного к долговременному этапу адаптации осуществляется через фазу активации генетического аппарата.

Интенсивность стресс-реакции играет важную роль в формировании адаптации организма. В основе стресс-реакции лежит активация адренергической и гипофизарно-адреналовой системы и мобилизация энергетических и структурных ресурсов организма. Стресс-реакция чрезмерной интенсивности или длительности может индуцировать развитие болезни, например, язвенного поражения двенадцатиперстной кишки, аритмий или иммунодефицита. При действии стрессов умеренной интенсивности и адекватной стресс-реакции начинается развитие адаптации к действию стрессора, что ведет к последующему ограничению стресс реакции через активацию стресс-лимитирующих систем. Стресс-лимитирующие системы организма - это центральные и локальные регуляторные системы организма, сопряженные со стресс-реализующей системой. Они ограничивают стресс-реакцию на уровне мозга и эффекты стрессорных гормонов и медиаторов на уровне органов-мишеней, предупреждают стрессорные повреждения. Различают центральные и локальные стресс-лимитирующие системы. К центральным относятся такие системы нейронов головного мозга, как ГАМКергическая, опиоидергическая, серотонинергическая, дофаминергическая и др., действие которых ограничивает продукцию стресс-гормонов в мозге. Локальные стресс-лимитирующие системы работают на уровне конкретных органов и структур и представлены простагландиновой, аденозинергической, антиоксидантной системами, а также HSPs. Все эти системы являются универсальными регуляторами физиологических функций организма (Меерсон, 1984). Следует отметить, что в настоящее время к числу стресс-лимитирующих систем организма относят и систему генерации N0, который является универсальным физиологическим регулятором большинства процессов, протекающих в организме (Манухина, Малышев, 2000).

Первоначально накопление HSPs связывали с теплоустойчивостью, но позднее были получены доказательства того, что HSPs повышают устойчивость клетки и организма к различным стрессам (см. пункт 1.3). В связи с высокой консервативностью представителей семейства HSPs и их способностью индуцироваться в ответ на самые разнообразные стрессогенные стимулы, очевидно, что эти белки должны играть ведущую роль в реакции клетки на стресс. Однако HSPs играют роль и в условиях нормального функционирования клетки, о чем говорит наличие конститутивных форм этих белков (см. пункт 1.3).

Так как работа HSPs играет ключевую роль в условиях повреждения, их синтез в ответ на действие стрессогенных стимулов сам по себе является важной защитной реакцией клетки. Очевидно, что клетки, более эффективно синтезирующие HSPs, получают преимущество в борьбе с повреждениями. Таким образом, воздействие умеренного стресса, вызывающее индукцию синтеза HSPs, но недостаточное для серьезного повреждения, может защитить клетку или организм от последующего тяжелого стресса.

В экспериментах нашей лаборатории многократно подтверждалось повышение синтеза HSP70 в различных органах при разных видах адаптации организма (Meerson et al., 1992; Malyshev et al., 2000). Кроме того, есть данные об участии HSP32 в защите сердечно-сосудистой системы: нокаутные по HSP32 мыши обладают пониженной устойчивостью сердца к гипоксии (Yet et al., 1999).

Существуют данные, которые демонстрируют, что адаптация к диетическим ограничениям, физическая и умственная активность и мягкие стрессорные воздействия могут снизить частоту и степень тяжести нейродегенеративных расстройств у человека.

Van der Auwera и соавторы (2005) показали, что потребление холестерина и насыщенных жиров коррелирует с отложениями Ар и развитием БА у людей и животных. В своей работе авторы использовали трансгенных мышей в качестве модели БА и обнаружили, что использование диеты с высоко насыщенными жирами и низкомолекулярными углеводами может уменьшать уровни Ар.

Оценка содержания белков теплового шока (Вестерн-блот анализ)

Клетки отмывали ледяным фосфатным буфером от культуральной среды. Добавляли в каждую лунку 6-ячеечных чашек (Costar) по 250 мкл лизис-буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl (рН 7,5), 50 мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 1% Тритон Х-100, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид и коктейль ингибиторов протеаз (2,5 мкг/мл антипаин, 2,5 мкг/мл леупептин, 1,75 мкг/мл пепстатин А и 0,95 мкг/мл апротинин; Sigma) (10 мкл на 1 мл лизис-буфера), и инкубировали клетки в течение 5 минут на льду. Затем клетки удаляли скребком, собирали в эппендорфы и центрифугировали данную суспензию в течение 10 мин при 13000 об./мин и 4С. Часть надосадочной жидкости отбирали и добаляли к ней буфер для образцов 4Х (SB4X) (33% глицерин, 0,3 М дитиотреитол, 6,7% додецилсульфат натрия (ДСН), 0,01% бромфеноловый синий, 80 мМ Трис-HCl, рН 6,8; Sigma) в соотношении - 3 части пробы : 1 часть SB4X. После этого пробы перемешивали на вортексе и прогревали 7 минут при 96С для разворачивания и стабилизации белков. Полученные таким образом образцы замораживали и хранили при - 20С до последующего анализа - определения HSPs в клетках. В оставшейся части проб определяли содержание белка по методу Бредфорда (Bradford, 1976), основанному на реакции с Кумасси, с помощью реагента Бредфорда (Bioquant protein, Merck).

Электрофорез, иммупоблотинг, выявление HSP70 и HSP32 Электрофорез проводили в 12% ДСН полиакриламидном геле (ДСН ПААГ) по Laemmli (1970) в течение 50 минут в камере Mini-PROTEAN 2 Cell. Для разделения белков использовали электродный буфер, содержащий 25 мМ Трис-HCl, рН 8,3, 192 мМ глицина, 0,1% (вес/объем) ДСН. По окончании ДСН-электрофореза белки из ПААГ переносили на нитроцеллюлозную мембрану электроэлюцией по Towbin (1979), используя прибор Trans-Blot Cell. Для переноса белков использовали трансфер-буфер, содержащий 25 мМ Трис-НО, рН 8,3, 192 мМ глицина, 0,1 % (вес/объем) ДСН, 20% (объем/объем) этанола. Перенос белков осуществляли, используя источник тока фирмы "Bio-Rad" при напряжении 100В в течение 1 часа. Качество переноса проверяли, окрашивая после проведения вестерн-блоттинга мембрану 0,3% Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Краску с иммобилизованных белков смывали фосфатным буфером.

На завершающей стадии проводили проявление исследуемых белков на нитроцеллюлозной мембране при помощи иммуноферментной хемилюминесценции (ECL) (D Alessio, Ashley, 1992). После вестерн-блоттинга для блокирования оставшихся мест связывания, мембрану инкубировали в 5% растворе сухого обезжиренного молока на TPBS (0,2% ТВИН в фосфатном буфере) в течение 1 часа при комнатной температуре, далее блоты инкубировали с моноклональными антителами против индуцибельной формы HSP70 и HSP32 (мышиные моноклональные антитела к HSP70, мышиные моноклональные антитела к гемоксигеназе-1, фирмы StressGen Biotechnologies) в разведении 1:1000 в тех же условиях. После инкубации мембрану отмывали от первичных антител 0,1% раствором обезжиренного сухого молока, растворенного в TPBS (2 раза по 10 мин.). Затем мембрану инкубировали 1 час со специфичными к первым вторыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена ("Amersham", LIFE Sci.), в разведении 1:5000. В качестве буфера использовали 0,1% раствор обезжиренного сухого молока на TPBS. После этого мембрану вновь отмывали 0,1% раствором обезжиренного сухого молока на TPBS (1 раз 15 мин. и 3 раза по 10 мин.).

Для визуализации антигенной мишени использовали набор ECL RPN 2108 (Amersham). Экспонирование осуществляли на пленку Hyperfilm ECL ("Amersham Pharmacia Bioteh", Великобритания). Пленку проявляли и фиксировали, используя фотографические реактивы. О содержании HSP70 и HSP32 судили по ширине и интенсивности окрашивания полосы связывания антител.

Количественную обработку полученных иммуноблотов проводили путем сканирования и анализа с помощью компьютерной программы Photoshop. Результаты представляли в виде репрезентативных диаграмм, как отношение площади сигнала в пикселях к интенсивности сигнала.

В качестве ингибитора синтеза белков теплового шока был использован кверцетин (Sigma) (Nagai et al., 1995) в концентрации 50 мкМ (Wu, Yu, 2000). В нашей работе оценивалось влияние кверцетина только на выживаемость нервных клеток по МТТ-редуктазной активности, так как данные об ингибировании синтеза HSP70 кверцетином не являются новыми. Преинкубацию с кверцетином в растворе диметилсульфоксида (MP Biomedicals, Inc.) начинали за 1,5 часа до начала каждого сеанса адаптации. В контроль вместо кверцетина добавляли стерильный раствор диметилсульфоксида в концентрации, соответствующей кверцетину, то есть 50 мкМ. По окончании всего эксперимента измеряли метаболическую активность клеток.

Полученные данные обрабатывали, используя методы математической статистики. Различия между группами определяли по t-критерию Стьюдента и считали их достоверными при р 0,05. Результаты представляли в виде М+т. Также мы использовали непараметрические методы анализа - критерий Т (парный критерий Вилкоксона) для определения значимости изучаемого параметра внутри каждой группы животных и критерий U (Вилкоксона -Манна - Уитни) для оценки достоверности различий между группами. Для оценки достоверности различий по степени запоминания животных использовали точный метод Фишера.

Адаптация к гипоксии предупреждает нарушение когнитивных функций, вызванное введением 3-амилоида, у крыс линии Вистар

Почти столетняя история борьбы с болезнью Альцгеймера с помощью лекарственных средств показала, что их возможности невелики. Фармакотерапия замедляет прогрессирование когнитивного снижения, что обеспечивает экономию лишь около 52,5 тыс. руб. на пациента (McDonnell et al., 2001). Кроме того, разработка и применение лекарств, направленных на нормализацию когнитивной функции у больных БА поднимает много этических вопросов, связанных с общим самочувствием и качеством жизни этих больных (Berghmans, 2000).

К настоящему времени разработано несколько классов лекарств, которые используются для лечения БА. В их число входят ингибиторы ацетилхолинэстеразы (Heilbronn, 1961; Enz et al., 1993), ингибиторы моноаминоксидазы, антиоксиданты, эстроген замещающая терапия и антивоспалительные агенты (Behl et al., 1992; Perry et al., 2003; Huang et al., 2004; Zimmermann et al., 2005; Luximon-Ramma et al., 2005). Однако на сегодняшний день медикаментозная терапия является главным образом симптоматической и часто обладает серьезными побочными эффектами (Suh, Checler, 2002).

Нефармакологическим способом стимулирования эндогенной защиты организма может оказаться адаптация организма к умеренному, дозированному воздействию факторов окружающей среды, таких как гипоксия, стресс, тепло, физическая нагрузка и т.д. Показано, что адаптация к кратковременным стрессорным воздействиям характеризуется угасанием стресс-реакции и перекрестными защитными эффектами, что выражается в повышении резистентности организма не только к стрессу, но и к физической нагрузке, тепловому шоку и другим факторам (Меерсон, 1993а). Наши эксперименты впервые показали, что мозг крыс линии Вистар, предварительно адаптированных к периодической гипобарической гипоксии, обладал большей устойчивостью в отношении развития нейродегенеративного процесса, что убедительно подтверждалось результатами поведенческих тестов. Так, в тесте УРПИ предварительная адаптация к гипоксии полностью предупредила нарушение памяти у крыс, вызванное введением токсичного фрагмента Ар. В другом поведенческом тесте - ТЭИ - предварительная адаптация к гипоксии достоверно увеличила быстроту начала поиска решения в стрессорной ситуации и предупредила нарушение этой функции у животных, получивших инъекции Ар. Результаты наших экспериментов впервые продемонстрировали, что один из механизмов защитного действия адаптации к гипоксии на когнитивную функцию может быть связан с ограничением оксидативного стресса в гиппокампе.

В представленной работе были изучены различия в устойчивости крыс линий Вистар и Август к нейродегенеративному повреждению мозга, вызванному введением Ар. Известно, что разные люди, а также животные одного вида, но разных генетических линий обладают различной наследственной устойчивостью (резистентностью) к стрессорным воздействиям (генетические различия). Кроме того, в пределах одной линии степень резистентности у разных особей также может быть неодинаковой, существуют индивидуальные различия, то есть различия, приобретенные в ходе индивидуальной жизни (фенотипические различия). Таким образом, предрасположенность к стрессорным повреждениям и устойчивость к ним определяется двумя основными факторами: генетически обусловленными особенностями организма и фенотипически обусловленными особенностями (Пшенникова, 2003). Ранее было установлено, что крысы линии Август обладают большей врожденной устойчивостью к стрессу по сравнению с крысами линии Вистар (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996); а также обладают большей устойчивостью к эмоциональному стрессу, что связано с тем, что в ответ на одинаковое стрессорное воздействие у крыс Август стресс-реакция меньше и сопровождается, соответственно, повреждающими эффектами, чем у крыс Вистар (Пшенникова и др. 1996). Это, в свою очередь, определяется тем, что у крыс Август, по сравнению с крысами Вистар, выше базальная и при остром стрессе активность стресс-лимитирующих систем, ограничивающих стресс-реакцию и ее эффекты (Пшенникова, 2003). Поскольку эмоциональный стресс играет важную роль в патогенезе такого неиродегенеративного процесса, как БА (Small, 2002; Radecki et al., 2005), мы предположили, что противостояние этому процессу в определенной мере может быть связано с наследственной повышенной устойчивостью организма к стрессорным повреждениям. В пользу этого предположения говорят данные о том, что крысы Август более устойчивы, чем крысы Вистар, к острому инфаркту миокарда (Белкина и др. 2001), в патогенезе которого, как известно, важную роль играет компонент эмоционального стресса. Также мы предположили, что крысы линий Август и Вистар, обладающие разной устойчивостью к острому эмоциональному стрессу (Пшенникова и др., 1999; Пшенникова и др., 1996), могут различаться по устойчивости к развитию неиродегенеративного процесса. В связи с этим мы сопоставили устойчивость к моделированному нейродегенеративному процессу типа БА у крыс линий Август и Вистар. Ключевую роль в патогенезе как стрессорных повреждений, так и нейродегенеративных повреждений, отводят в настоящее время оксидативному стрессу (Schafer et al., 2004; Migliore et al., 2005), поэтому у крыс линий Август и Вистар при моделировании БА мы сопоставили уровни свободнорадикальных процессов в структурах головного мозга. В целом наша работа показала, что у крыс линий Август и Вистар с генетически обусловленными различиями в устойчивости к эмоциональному стрессу обнаруживается также разная устойчивость к моделированному нейродегенеративному процессу по показателям поведенческих реакций в тестах УРПИ и "открытое поле".

Похожие диссертации на Адаптационная защита мозга от оксидативного повреждения при экспериментальной модели болезни Альцгеймера