Агрегация тромбоцитов и некоторые регуляторные механизмы тромбоцитарного гемостаза у больных нестабильной стенокардией [Электронный ресурс] Знаменская Илона Александровна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1 Некоторые механизмы изменений в системе гемостаза и возможности их регуляции при нестабильной стенокардии (обзор литературы) 12-31

1.1. Роль вазоактивных простаноидов в эндотелиальнои регуляции сосудов и эндотелиальнои дисфункции 13-20

1.2. Тромбоцитарный гемостаз в норме и при патологии 20-23

1.3. Особенности фармакологического действия ацетилсалициловой кислоты 23-31

Глава 2 Клиническая характеристика больных 32-44

Глава 3 Методы исследования 45-55

3.1. Выделение тромбоцитов и их стандартизация 46-47

3.2. Определение индуцированной агрегационной способности тромбоцитов 47-48

3.3. Определение активности 4 фактора тромбоцитов в плазме 48-49

3.4. Определение активности фактора Виллебранда в плазме 49-50

3.5. Определение уровней тромбоксана Вги 6-кето-простагландина FicB плазме крови 50-53

3.6. Определение концентрации АСК в сыворотке крови 53-54

3.7. Статистическая обработка материала 55

ГЛАВА 4 АСК и состояние тромбоцитарного гемостаза у больных нестабильной стенокардией (собственные наблюдения) 56-106

4.1. Агрегация тромбоцитов у больных нестабильной стенокардией 56-65

4.2. Тромбоцитарно-эндотелиальная дисфункция у больных НС 65-78

4.3. Показатели функциональной активности тромбоцитов и эндотелиальной функции у больных нестабильной стенокардией

в динамике лечения с применением АСК 78-100

4.4. Особенности концентрации АСК у больных нестабильной стенокардией 100-102

4.5. Сопряженность эндотелийзависимых факторов, концентрации АСК и функциональной активности тромбоцитов 102-105

Обсуждение 106-115

Выводы 116-117

Практические рекомендации 118

Библиография 119-150

• Роль вазоактивных простаноидов в эндотелиальнои регуляции сосудов и эндотелиальнои дисфункции
• Тромбоцитарный гемостаз в норме и при патологии
• Клиническая характеристика больных
• Выделение тромбоцитов и их стандартизация

Введение к работе

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания стабильно удерживают лидирующие позиции среди причин смертности в мире. В России от сердечно-сосудистых заболеваний ежегодно умирает более 1 млн. человек, составляя почти 60% в структуре общей смертности, и ведущее место здесь занимает ишемическая болезнь сердца (ИБС), протекающая с периодами стабильного течения и обострений. Обострение заболевания в форме острого коронарного синдрома (ОКС) без подъема сегмента ST представлено группой нестабильной стенокардии (НС). Из всех форм ОКС нестабильная стенокардия является самой перспективной в плане предупреждения неблагоприятного исхода при обострении ИБС [60]. Одним из патогенетически значимых расстройств у больных нестабильной стенокардией является нарушение тромбоцитарно-сосудистого гемостаза, включающего биологически активные системы регуляции функции тромбоцитов и эндотелия сосудов (тромбоксан, простациклин, эндотелии, тромбомодулин, фактор Виллебранда, 4 тромбоцитарный фактор и др.) [4, 5, 10, 135]. В основе действия ацетилсалициловой кислоты (АСК) как лечебного и профилактического антиагрегационного средства лежит ее способность ингибировать циклооксигеназу тромбоцитов, подавляя тем самым их гиперагрегацию, которая является начальным звеном активации свертывающей системы крови [231, 250, 278]. Это в свою очередь нарушает синтез активных циклооксигеназных метаболитов арахидоновой кислоты (АК), в частности тромбоксана и простациклина, изменяет состояние эндотелия и тонуса сосудов.

С одной стороны, доказана эффективность АСК при лечении ИБС. С другой, использование этого препарата осуществляется эмпирически - без учета индивидуальных особенностей регуляции тромбоцитарного гемостаза у конкретного больного и в отсутствии данных о концентрации препарата в

крови и клетках, непосредственно участвующих в гемостазе. Недостаток информации об индивидуальных темпах фармакокинетики АСК при нестабильной стенокардии в совокупности с отсутствием данных о состоянии активных метаболитов АК и других регуляторов эндотелиально-тромбоцитарной функции, опосредующих ее действие на агрегацию, может служить одной из возможных причин недостаточной клинической эффективности применения препаратов АСК, что имеет важное значение в случаях коронарной патологии.

В связи с этим изучение регуляторов эндотелиально-тромбоцитарной функции, включая метаболиты АК, и их влияния на состояние тромбоцитарного гемостаза может оказаться весьма перспективным с позиции установления предикторов результативности антиагрегационной терапии у больных с нестабильной стенокардией.

Цель исследования

Оптимизация лечения больных и расширение возможностей прогнозирования течения нестабильной стенокардии на основе изучения агрегации тромбоцитов, некоторых регуляторных механизмов тромбоцитарного гемостаза и сывороточной концентрации ацетилсалициловой кислоты.

Основные задачи исследования:

1. Определить индуцированную адреналином агрегацию тромбоцитов у больных нестабильной стенокардией до начала, а также на седьмой и четырнадцатый день лечения с применением АСК.

2. Изучить содержание в сыворотке крови регуляторов активности тромбоцитов и функции эндотелия (тромбоксана, простациклина, фактора Виллебранда, IV фактора свертывания) до и через две недели лечения.

3. Сопоставить показатели агрегации тромбоцитов, регуляторов их
активности с клиническими особенностями стенокардии (длительность
коронарного анамнеза, количество эпизодов обострения, сроки стабилизации,
развитие инфаркта миокарда и др.).

4. Изучить взаимосвязь агрегации тромбоцитов и уровня тромбоцитарно-эндотелиальных регуляторов с исходами впервые возникшей, постинфарктной и прогрессирующей стенокардии.

5. Определить содержание АСК в крови в ходе нагрузочного теста после первого приема и через две недели лечения во взаимосвязи с выраженностью гипоагрегационного эффекта и состоянием регуляторов тромбоцитарной функции.

6. С учетом полученных данных охарактеризовать прогностическое
значение изучаемых тромбоцитарно-эндотелиальных регуляторов,
вариативность эффекта АСК, установить предикторы недостаточного
гипоагрегационного действия препарата как основу оптимизации
гипоагрегационной терапии.

Научная новизна исследования

Впервые на большом клиническом материале у больных нестабильной стенокардией проведено изучение агрегационной функции тромбоцитов, регуляторов тромбоцитарно-эндотелиальной функции - фактора Виллебранда, IV фактора тромбоцитов, тромбоксана В₂ и стабильного метаболита простациклина - 6-кето-ПТТі_а во взаимосвязи с фармакокинетикой ацетилсалициловой кислоты и основными клиническими характеристиками заболевания. Получены новые данные об особенностях AT и состоянии регуляторов этого процесса в различных клинических группах нестабильной стенокардии и у пациентов с различным течением заболевания. Впервые установлено, что негативные характеристики НС, а также нарастание тяжести осложнений и ассоциированных клинико-биохимических расстройств сопровождаются универсальной реакцией тромбоцитарно-

эндотелиальных регуляторов в виде более высокой активности ФВ, содержания 4ТФ и Т_ХВ₂ в крови, снижения уровня 6-кето-ГПТі_а и нарушения соотношения вазоактивных простаноидов. Впервые выявлена зависимость исходов нестабильной стенокардии от уровней AT и состояния регуляторов этого процесса. Получены принципиально новые данные о фармакокинетике АСК в динамике нагрузочных тестов при первом приеме и через 2 недели лечения. Выделена группа больных с особенностями фармакокинетики АСК, которые могут быть одной из причин недостаточного гипоагрегационного эффекта. Обоснована целесообразность определения концентрации АСК в крови на 14-й день лечения во взаимосвязи с оценкой исходного состояния эндотелиально-тромбоцитарных регуляторов для прогнозирования выраженности гипоагрегационного действия. Разработаны биохимические предикторы клинических исходов при различных вариантах нестабильной стенокардии.

Практическая значимость работы

Установление взаимосвязи между индуцированной адреналином агрегацией тромбоцитов, состоянием тромбоцитарно-эндотелиальных регуляторов и основными клинико-лабораторными и инструментальными характеристиками нестабильной стенокардии позволяет выделить группы больных с замедленным наступлением гипоагрегационного эффекта ацетилсалициловой кислоты. Выявленные различия в уровнях AT, 4ТФ, ФВ и простаноидов, измеренных до начала лечения, при разных исходах нестабильной стенокардии дают возможность использовать показатели AT и регуляторов тромбоцитарного гемостаза для целей прогнозирования ее течения. Полученные новые данные об особенностях действия АСК и вариативности ее концентраций в крови у больных НС на 14-й день лечения в совокупности с исходными плазменными показателями 4ТФ, Т_хВг и ФВ позволяют диагностировать и прогнозировать недостаточный

гипоагрегационный эффект АСК с целью использования альтернативных методов гипоагрегации.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- повышение стимулированной адреналином агрегации тромбоцитов у
больных нестабильной стенокардией с максимумом при наличии негативных
характеристик течения болезни, осложнений и ассоциированных
расстройств;

- универсальная реакция тромбоцитарно-эндотелиальных регуляторов у
больных с тяжелым и осложненным течением стенокардии в виде высокой
активности ФВ, содержания 4ТФ, Т_хВг в крови и снижения 6-кето-Ш F_]a;

- различие сроков наступления гипоагрегации и состояния
тромбоцитарно-эндотелиальных регуляторов в ходе лечения с
использованием ацетилсалициловой кислоты в разных клинических группах
нестабильной стенокардии;

взаимосвязь показателей AT и регуляторов тромбоцитарной функции с разными исходами нестабильной стенокардии;

возможность использования мониторинга сывороточной концентрации АСК, показателей AT и соотношения вазоактивных простаноидов для выделения больных с вероятной резистентностью к препаратам ацетилсалициловой кислоты.

Практическое использование полученных результатов

Итоговые материалы диссертационного исследования используются в лечебной практике терапевтических отделений ГУЗ «СККЦ ОСВМП», МУЗ «Городская клиническая больница №4», кардиологических отделений №1 и №2 ГУЗ «Краевой клинический кардиологический диспансер», МУЗ «Городская клиническая больница №3» г. Ставрополя, в учебном процессе на кафедрах внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии,

11 внутренних болезней №2, клинической фармакологии Ставропольской государственной медицинской академии.

Материалы диссертации изложены в 16 печатных работах, в том числе опубликованы в журнале, входящем в перечень изданий, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, доложены на XI-XIII итоговых научно-практических конференциях молодых ученых и студентов СГМА (Ставрополь, 2002-2006), V Российском научном форуме «Кардиология 2003» (Москва, 2003), II международном симпозиуме «Доказательная медицина - основа современного здравоохранения» (Хабаровск, 2003), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Проблемы и перспективы клинической фармакологии» (Барнаул, 2004), на V съезде кардиологов ЮФО «Диспансеризация, качество, диагностика, лечение и реабилитация - залог успеха кардиологической службы» (Ростов-на-Дону, 2006).

Апробация работы проведена на совместном заседании кафедр внутренних болезней №1 с курсом поликлинической терапии, внутренних болезней №2, клинической фармакологии Ставропольской государственной медицинской академии.

Роль вазоактивных простаноидов в эндотелиальнои регуляции сосудов и эндотелиальнои дисфункции

Сосудистый эндотелий является высокоспециализированным метаболически активным монослоем клеток, выстилающим все сосуды организма человека. Эндотелиальная выстилка и ее целостность являются основой нормального функционирования кровеносных сосудов. Эндотелиальные клетки (ЭК), специфически реагируя на различные молекулярные сигналы, генерируемые как локально, так и дистантно, выполняют многообразные функции, в том числе селективные, транспортные и барьерные, участвуют в метаболизме внеклеточного матрикса, биосинтезе цитокинов, ангиогенезе, регулируют процессы свёртывания и агрегацию тромбоцитов, сосудистый тонус, иммуновоспалительные реакции [77, 86, 235]. Нормальный эндотелий обладает выраженной антитромбогенной активностью. Существует несколько объяснений, почему неповрежденный эндотелий препятствует образованию тромбоцитарных агрегатов в просвете нормальных сосудов. Во-первых, как эндотелиальные клетки, так и тромбоциты имеют отрицательный электрический заряд и, следовательно, взаимно отталкиваются. Во-вторых, эндотелиальные клетки синтезируют и секретируют в кровоток по меньшей мере 2 фактора, которые тормозят адгезию и агрегацию, а именно простациклин и эндотелий-зависимый фактор расслабления. В-третьих, на внутренней поверхности эндотелиальных клеток располагается такой фермент, как АДФ-аза, который расщепляет аденозиндифосфат (АДФ) до аденозинмонофосфата (АМФ). АДФ в свою очередь является одним из самых сильных индукторов агрегации и обеспечивает рост тромбоцитарного тромба [88]. Активация и (или) повреждение эндотелия имеет значение в развитии широкого спектра патологических процессов, лежащих в основе сосудистой патологии при заболеваниях [105]. Активно обсуждается роль дисфункции эндотелия сосудистой стенки в развитии атеросклероза в целом и НС, в частности [26, 34, 36, 43, 87, 126, 139, 211, 288]. Состояние эндотелия при этом проявляется снижением дилятации сосудов и нарастанием вазоконстрикции, активацией системы цитокинов и нарушением тромборезистентности сосудистой стенки [35, 169, 239]. Показатели дисфункции, активации и повреждения эндотелия зависят как от выраженности хронической сердечной недостаточности, так и от клинических проявлений ИБС [25, 90]. Количество циркулирующих в крови эндотелиоцитов у больных ИБС зависит от возраста и степени систолической дисфункции левого желудочка, отчетливо повышаясь при фракции выброса менее 35% [3]. Возникающий вследствие повреждения или дисфункции эндотелия дисбаланс в продукции или метаболизме некоторых вазоактивных медиаторов может играть одну из основных ролей в происхождении вазоспазма, например, при легочной гипертензии [64, 80, 129, 246]. Кроме того, считается, что дисфункция может носить наследственный характер [42, 68,133].

На мембране ЭК экспрессируется одноцепочный гликопротеин тромбомодулин (ТМ), исполняющий роль клеточного рецептора для тромбина и предотвращающий опосредуемое тромбином расщепление фибриногена и AT [116, 150, 151, 215].

В 1988 году М. Yanagisawa с сотрудниками выделили из супернатанта культуры клеток эндотелия свиньи вещество, обладающее выраженной вазоконстрикторной активностью, которое получило название эндотелии-1 [290]. Эндотелии образуется также в гладкомышечных клетках сосудистой стенки, нейронах и астроцитах головного и спинного мозга, мезентелиальных клетках почки, внутриматочных клетках, гепатоцитах, в эпителиоцитах молочной железы [245]. Помимо мощного вазоконстрикторного действия на легочные сосуды эндотелии-1 оказывает пролиферативное влияние на сосудистые гладкомышечные клетки [168, 263], оказывается причастным к развитию ишемической болезни сердца, нарушениям ритма сердца, легочной и системной гипертензии, атеросклеротическим сосудистым нарушениям, почечной патологии, диабету и рассматривается как предиктор тяжести этих патологических состояний [30, 31, 101,130, 171,177, 191, 199, 220, 228].

Эндотелиальными клетками и мегакариоцитами синтезируется мультимерный гликопротеин - фактор Виллебранда (ФВ), который, являясь субъединицей фактора VIII, усиливает прилипание тромбоцитов к сосудистой стенке, формируя молекулярные мостики между пластинками и субэндотелием поврежденных сосудов [248, 252]. Увеличение количества ФВ в крови является маркером повреждения эндотелиальных клеток [118, 208], может иметь определенное значение в развитии тромботических осложнений, атерогенезе [117], ишемической болезни сердца [14, 167, 273, 289], играет ключевую роль в развитии диабетической ангиопатии и раннего атеросклероза у больных сахарным диабетом I типа [91]. Об участии ФВ в повреждении почек свидетельствует повышение концентрации его в плазме крови больных волчаночным нефритом [15]. Повышение его уровня в сыворотке крови у больных с первичным синдромом Шегрена является лабораторным маркером сосудистых осложнений этого заболевания [102]. В целом повышение уровня в крови фактора Виллебранда является маркером повреждения эндотелиальных клеток [118, 208]. ФВ выполняет одну из основных посреднических ролей во взаимодействии компонентов плазменного и сосудисто-тромбоцитарного гемостаза [10, 16]. Повышение активности ФВ выявлено у больных НС [26]. При разнообразных патологических состояниях происходит дисбаланс эйкозаноидов - биологически активных медиаторов, из которых наиболее важным является арахидоновая кислота [201, 250, 259]. Арахидоновая кислота выделяется из клеточных фосфолипидов под воздействием фосфолипазы А2. Существует два пути ее метаболизма. Первый путь циклооксигеназный, в результате функционирования которого образуются простагландины, простациклин и тромбоксан. Второй - липоксигеназный, с формированием лейкотриенов, гидроксиэйкозатетраеновых и гидропероксиэйкозатетраеновых кислот [200]. Допускается наличие альтернативного - эпоксигеназного пути метаболизма арахидоновой кислоты [71,229].

Профиль эйкозаноидов различен в зависимости от их тканевой и клеточной принадлежности. Окислительный метаболизм арахидоновой кислоты по циклооксигеназному пути широко распространен среди разных типов клеток [13, 123, 205, 225]. Вид образующегося циклооксигеназного метаболита зависит от типа превращающего фермента, который присутствует в той или иной ткани. Например, тромбоксан А2 (ТХА2) образуется главным образом в тромбоцитах (Т), а ПГІ2 - преимущественно в клетках сосудистого эндотелия [20, 257].

Тромбоцитарный гемостаз в норме и при патологии

Тромбоциты являются безъядерными образованиями диаметром 2-5 мкм и толщиной 0,5-0,75 мкм., ограниченными снаружи клеточной мембраной. В здоровом организме происходит постоянная гибель Т, которая может увеличиваться при патологии. Нормальное содержание в крови поддерживается постоянным тромбоцитопоэзом по принципу обратной связи между их количеством и тромбоцитопоэзом. Длительность циркуляции Т, поступивших в кровоток, определяется двумя факторами: старением пластинок и их утилизацией. Максимальная продолжительность жизни тромбоцитов не превышает 12-13 суток [9].

Тромбоциты обладают рядом свойств, которые обеспечивают их участие в патогенезе ИБС. Они способны адгезировать к поврежденному эндотелию сосудистой стенки, что является одним из пусковых механизмов в развитии пристеночного тромбоза коронарных артерий, могут агрегировать друг с другом, образуя тромбоцитарные тромбы, и синтезировать ТХА2, который в свою очередь является мощным агрегирующим агентом. Тромбоциты также способны к различным реакциям освобождения, в результате которых выделяются биологически активные вещества: В-тромбоглобулин, IV фактор тромбоцитов, фактор роста, АДФ, участвующие в атеро- и тромбогенезе [38]. При действии индукторов агрегации происходит потеря дисковидной формы тромбоцитов с превращением в беспорядочную, грубо сферическую конфигурацию, образованием множественных псевдоподий, концентрированием произвольно распределенных органелл в плотно упакованные массы в центре клетки, что является основной особенностью физиологической реакции Т на действие индукторов агрегации. Согласно клиническим данным, уже при начальных изменениях в коронарных артериях отмечаются признаки дезорганизации фосфолипидного состава мембран Т, а при активных проявлениях коронароспазма эти явления усугубляются [65].

Тромбоциты первыми реагируют адгезией на повреждение целостности эндотелия. Это связано с тем, что рецепторы их мембраны «узнают» адгезивные белки субэндотелиального матрикса [75, 141]. После прикрепления Т к поверхности поврежденного эндотелия происходит процесс агрегации. Активация тромбоцитов при повреждении эндотелия обусловлена действием агонистов - индукторов агрегации на специфические рецепторы [2]. Первичными индукторами являются коллаген, обнажаемый при повреждении эндотелия, катехоламины, тромбин. Вторичными - АДФ, серотонин, тромбоксан Аг и фосфолипидный пластиночный агрегирующий фактор (PAF) [4, 5]. Секреция биологически активных веществ из гранул Т получила название реакции «освобождения», в результате которой в процесс агрегации вовлекаются новые Т и он становится самоподдерживающим, завершающимся формированием мостиков между адгезивными белками и активированными рецепторами Т [76]. Интенсивность образования тромбоцитарных агрегатов и тромба зависит от силы индукторов AT, которые в свою очередь взаимодействуют со специфическими рецепторами и приводят к активации фосфолипазы Аг мембраны Т, что индуцирует синтез простагландинов по типу «каскада арахидоновой кислоты», с образованием ТХА2. Агрегация тромбоцитв при действии агонистов связана с внутриклеточным обменом Са2+, циклических нуклеотидов и простагландинов [74]. Распространению процесса агрегации и тромбоцитарного тромба от места его образования на поврежденной стенке сосудов препятствует простациклин [23].

Агрегация тромбоцитов значительно варьирует у здоровых людей в течение суток, дней, сезонов года, на нее оказывают влияние изменения солнечной активности, метеоусловий [7].

На активность Т могут влиять эритроциты способные взаимодействовать с простациклином и нейтрализовать его антиагрегационный эффект [52].

Гиперхолестеринемия имеет прямое отношение к образованию больших гиперактивных Т [47, 172]. Обнаружена тесная обратная корреляционная связь между уровнем ХС ЛГШП и антитромбогенной активностью стенки сосудов: чем выше уровень атерогенных липопротеинов, тем ниже антитромбогенная активность стенки сосудов [48]. ЛПНП обладают свойством резко тормозить активность простациклинсинтетазы, в отличие от ЛПВП, активирующих этот фермент и подавляющих синтез ТХА2 [97].

При агрегации происходит слипание пластинок друг с другом, резко изменяется их форма. Реакция индуцируется АДФ из поврежденной сосудистой стенки и тромбоцитарных гранул, тромбином и серотонином. Молодые Т обладают повышенной адгезивностью и агрегационной способностью [9].

На основании многофакторного дискрименантного анализа удалось установить, что состояние тромбоцитарного звена гемостаза и характер регистрируемых нарушений состояния кровяных пластинок у больных с НС имеют существенное значение в определении прогноза этого заболевания [99]. Уже при стабильной стенокардии определяется возрастание АДФ-индуцированной AT [127]. При дестабилизации ИБС отмечается гиперагрегация тромбоцитов, о чём свидетельствует повышеная АДФ-индуцированная агрегация у 86% больных с НС [94]. Подтверждением гипотезы о том, что физическое напряжение служит одним из факторов трансформации стабильной ИБС в ОКС и что ускорение коронарного кровотока в атеросклеротических измененных артериях активирует тромбоциты, являются результаты исследования AT в коронарном синусе и в аорте у больных с различной степенью поражения коронарных артерий [148, 149].

Для артериальной гипертензии также характерна повышенная AT. Причем агрегационные ответы на различные индукторы агрегации соответствовали более выраженной гипертрофии левого желудочка при гипертонической болезни, с увеличением степени гипертрофии значительно возрастал агрегационный ответ тромбоцитов [84].

У больных с ИБС с нарушениями ритма сердца, по сравнению с больными без аритмий, выявлено достоверное снижение степени дезагрегации Т, наиболее существенные изменения функционального-состояния клеток наблюдались у больных с желудочковой экстрасистолией, т. е. у лиц с высоким риском наступления внезапной смерти [59, 67].

Изучая AT в разные сроки ИМ, было выявлено, что при неосложненном течении заболевания имеет место повышенная АДФ-индуцированная агрегация, но в первые сутки она оказывается более низкой, чем на 7-й и 10-й дни болезни [56]. При исследовании АДФ-индуцированной AT у больных со стабильной стенокардией, НС и ОИМ максимальная скорость агрегации была увеличена у всех больных, причем в одинаковой степени [4, 5].

Вышеизложенные данные свидетельствуют в пользу того, что при НС существуют причинно-следственные связи между антитромбогенной активностью стенки сосудов, уровнем липидного обмена, состоянием системы гемостаза и реологическими свойствами крови [78].

Клиническая характеристика больных

Забор крови производили в утренние часы, натощак из кубитальной вены иглой с широким просветом без наложения жгута и массажа предплечья.

В силиконовые пробирки объемом 10 мл предварительно помещали 1 мл 3,8% раствора трехзамещенного цитрата натрия и собирали свободно вытекающую кровь до метки в соотношении 1:9, немедленно перемешивая с антикоагулянтом. Пробирки центрифугировали 5-10 минут на малых оборотах (1000-1500 об/мин) в центрифуге с плавающим ротором при комнатной температуре. Получали плазму богатую тромбоцитами, которую осторожно извлекали при помощи пипетки в пластмассовые пробирки (для исключения контактной активации тромбоцитов работали только с пластмассовой посудой - кюветы, пробирки, пипетки) и использовали для определения функциональной активности тромбоцитов. При дальнейшем центрифугировании образцов крови в течение 15-20 минут, но уже на более высоких оборотах (3000-4000 об/мин), над осадком эритроцитов располагалась плазма бедная тромбоцитами.

При изучении агрегационных свойств тромбоцитов важным этапом является стандартизация суспензии клеток по их количеству. Калибровка шкалы оптической плотности прибора с учетом зависимости светопропускания от числа клеток в плазме позволяла быстро в кювете прибора определить исходное количество тромбоцитов и путем разбавления богатой тромбоцитами плазмы бедной клетками плазмой до уровня 2,0-2,5x10 /мл приготовить пробы, содержащие необходимое для работы количество тромбоцитов. Плазму хранили при комнатной температуре. Все тесты выполняли не позднее 3-х часов после отделения плазмы [44, 98]. Для получения сопоставимых результатов строго соблюдали выбранный режим центрифугирования.

Изучение активности тромбоцитов (турбодиметрический метод G. Born) [124] основано на регистрации светопропускания обогащенной клетками плазмы. Агрегационную функцию тромбоцитов регистрировали на анализаторе агрегации тромбоцитов АР 2110 («Solar», Беларусь), сопряженном с IBM-совместимым компьютером. Прибор включает в себя небольшую прозрачную кювету, в которую помещается проба тромбоцитов (450 мкл) в стандартной концентрации. К образцу тромбоцитарной плазмы добавляется индуктор в количестве 50 мкл. Через кювету свет от калиброванного источника пропускается на фотоэлемент. В зависимости от изменения коэффициента пропускания исследуемой плазмы в кювете изменяется величина светового потока, прошедшего через плазму и попадающего на фотоприемник измерительного канала. Ток фотоприемника регистрируется электронной схемой через промежутки времени, равные секунде. Это позволяет зарегистрировать изменение коэффициента пропускания исследуемой плазмы во времени. Если тромбоциты представлены суспензией одиночных клеток (до агрегации), то пропускание света минимально. С увеличением агрегации плазма, содержащая клетки, становится светлее, а пропускание света возрастает [11, 58, 103]. Максимальное время записи на агрегометре - 10 минут.

Индуцированную агрегацию кровяных пластинок изучали путем добавления индуктора к богатой тромбоцитами плазме. В качестве индуктора в работе использовали адреналин (5мкМ/ мл «А.О. Гедеон Рихтер», Венгрия). Оценивались качественные и количественные параметры агрегации: наличие одноволновой, двухволновой, необратимой агрегации, дезагрегации, амплитуда агрегации (максимальный уровень светопропускания плазмы после внесения индуктора, %).

Выделение тромбоцитов и их стандартизация

Для определения количества тромбоксана В2 использовали иммуноферментные тест-системы фирмы «Amersham», включающие следующие реактивы и оборудования: тромбоксан В2 - пероксидазный конъюгат, микротитровальный планшет (96-луночный) с иммобилизованными антителами против глобулинов кролика, кроличья сыворотка против тромбоксана В2; стандарт тромбоксана В2 с концентрацией 1,28 пг/мл; все необходимые ингредиенты - буфер для анализа, промывной буфер и ТМВ-субстрат (тетраметилбензидин).

ИФА основан на конкуренции между тромбоксаном В2, находящемся в пробах, и тромбоксаном Вг, конъюгированным с пероксидазой хрена, за взаимодействие со специфической сывороткой против тромбоксана Вг. Количество связанного конъюгата с сывороткой определяется после добавления субстрата - ТМВ. Реакция останавливается раствором кислоты, и результаты учитываются по изменению окраски при длине волны 450 нм на фотометре - ИФА-ОЭП (Россия). Концентрация тромбоксана Вг в пробах определяется по стандартной кривой.

Перед постановкой ИФА была проведена хроматография на колонках типа Amprep С2 100 mg (код RPN 1903). Готовили хроматографические колонки, промыв их 2 мл метанола и для удаления примесей последовательно пропускали следующие растворы: 5 мл дистиллированной воды, 5 мл 10% этанола, 5 мл гексана. Для получения тромбоксана в колонку вносили 5 мл элюирующего раствора - метилформиата и пропускали через колонку подкисленные образцы (рН 3,0), собирая содержимое во флаконы. Через 12 часов флаконы с очищенными пробами помещали в вакуумный шкаф для выпаривания на 1 час.

Для постановки ИФА во флаконы с пробами вносили по 0,1 мл буфера для анализа. Разводили до необходимой концентрации все ингредиенты.

Анализ осуществляли следующим образом: в одну лунку вносили 0,1 мл буфера для анализа (контроль неспецифического связывания лунки полистирола), в другую лунку - 0,05 мл буфера для анализа - нулевой стандарт лунки, в третью лунку ничего не вносили - это «бланк»-лунка. В остальные лунки вносили по 0,05 мл стандартов и подготовленных (после хроматографии) проб. Во все лунки кроме «бланк» и лунки «неспецифического связывания» вносили по 0,05 мл сыворотки против тромбоксана В2. Затем во все лунки, кроме «бланк» вносили конъюгат пероксидазный, инкубировали 1 час при температуре 24С при постоянном встряхивании. Далее лунки 4 раза промывали промывной жидкостью и вносили по 0,15 мл раствора субстрата. Через 15 мин реакцию останавливали 1 М раствором серной кислоты и вели учёт при длине волны 450 нм.

Для определения количества 6-кето-простагландина Fia использовали иммуноферментные системы фирмы «Amersham» включающие: 6-кето 53 простагландин Fia, микротитровальный планшет (96-луночный) с иммобилизованными антителами против глобулинов кролика, кроличьяю сыворотку против 6-кето-простагландина Fia, стандарты 6-кето-простагландина Fja, все необходимые ингредиенты - буфер для анализа, промывной буфер и ТМВ-субстрат. Методика определения 6-кето-простагландина Fia аналогична методике определения тромбоксана Вг (см. выше).

Концентрацию АСК в сыворотке крови определяли у 23 пациентов на аппарате TDX-SYST фирмы «ABBOT» (США). TDX представляет собой полностью автоматизированную систему, состоящую из автоматического анализатора, набора реагентов, стандартов, контролей и основана на методике поляризации флуоресценции. Принципы флуоресцентной поляризации известны еще с 1920-х годов, в последующем она была применена для биологических систем [284]. Применительно для реакции антиген - антитело принцип впервые был описан Дандликером и Фейгеном [145]. С тех пор был описан целый ряд обзоров, описывающих флуоресцентную поляризацию и флуоресцентный иммуноанализ [144, 146]. Флуоресцентно-поляризационный иммуноанализ измеряет комплекс «метка - антитело» прямо в растворе, используя особые свойства флюоресцентного красителя - флюоресцеина. Флюоресцеин поглощает голубой свет и флуоресцирует зеленым после времени действия в возбужденном состоянии примерно в течение 4-х наносекунд (4x10-9 сек). Если молекулу флюоресцеина возбуждать плоско-поляризационным светом, то она будет излучать также поляризационный свет. Степень поляризации будет обратно пропорционально тому, насколько молекула повернется за время между возбуждением и излучением. Время, требуемое молекуле для поворота на угол примерно 68,5 градусов, было определено как время вращательной релаксации для молекулы или частицы. Это время мало ( 1 нсек) для маленьких молекул и велико ( 100 нсек) для больших молекул [193, 194, 195]. Молекулы флюоресцеина в растворе хаотично ориентированы. Их вращение за время между поглощением возбуждаемого света и излучением флюоресцеина большое. Результирующая поляризация флуоресценции поэтому низка. Размер комплекса «лекарство - флюоресцеин», используемого как метка, так мал, что свободная метка в сыворотке также дает низкую поляризацию. Концентрация терапевтических лекарств в образцах сыворотки определяется с помощью флуоресцентно-поляризационного иммуноанализа. Вещество, которое надо определять, метится флуоресцеином как меткой. Метка, возбуждаемая линейно-поляризационным светом, флуоресцирует со степенью поляризации обратно пропорциональной ее скорости вращения. Не связанная метка станет хаотично ориентирована за время между поглощением возбуждаемого света и излучением флуоресценции. Немеченое лекарство, присутствующее в образце пациента, конкурирует с меткой за ограниченное число центров связывания антител, и наблюдаемая поляризация флуоресценции метки будет иметь значение где-то между той, что была для свободной и связанной метки. Если образец содержит высокую концентрацию лекарства, то наблюдаемое значение поляризации будет близко к тому, которое имеет свободная метка, т. е. значение будет низким. Если образец содержит низкую концентрацию лекарства, то значение поляризации будет близко к тому, что имеет связанная метка, т. е. значение будет высоким [158, 184, 193, 194, 210, 236].

Похожие диссертации на Агрегация тромбоцитов и некоторые регуляторные механизмы тромбоцитарного гемостаза у больных нестабильной стенокардией [Электронный ресурс]

Адаптационные механизмы системы гемостаза и реологии крови у больных различными формами стенокардииПаршина Светлана Серафимовна

Ишемическое прекондиционирование и дистанционное ишемическое прекондиционирование у здоровых лиц и больных стабильной стенокардией и их влияние на агрегацию тромбоцитовГаллямов Нияз Вагизович

Клиническая и прогностическая ценность показателей эндотелиальной дисфункции и агрегации тромбоцитов у пациентов с нестабильной стенокардиейЛермонтова Наталья Юрьевна

Динамика изменения агрегации тромбоцитов при применении ацетилсалициловой кислоты в малых дозах у больных с нестабильной стенокардией и острым инфарктом миокардаХайруллина Светлана Геннадиевна

Эффективность оптимизированного метода внутривенной лазеротерапии по показателям гемостаза у больных с нестабильной стенокардиейПирогов Николай Сергеевич

Влияние терапии дальтепарином в сравнении с нефракционированным гепарином на клиническое течение и маркеры активации системы гемостаза у пациентов с нестабильной стенокардиейРябыш Екатерина Викторовна

Влияние миллиметровой терапии на гемостаз и реологические свойства крови у больных нестабильной стенокардиейЩелкунова, Инесса Геннадиевна

Взаимосвязь между уровнем воспалительного ответа, агрегацией тромбоцитов и клиническим состоянием больных при эндоваскулярном лечении острого инфаркта миокарда с подъемом сегмента ST на ЭКГБелоносов Денис Александрович

Эффект антигипертензивной терапии на параметры агрегации тромбоцитов и активность симпатоадреналовой системы у больных с метаболическим синдромомПятницкая Леся Михайловна

Влияние светодиодного облучения на агрегацию тромбоцитовДементьева Ирина Николаевна