Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Структура, свойства и модуляция If/HCN канала и возможности создания биологических пейсмекеров 13
1.1. Механизмы пейсмекерной активности 13
1.2. Ионная проницаемость через If канал 24
1.3. Модуляция If канала 26
1.4. Биологические пейсмекеры и эмбриональные стволовые клетки 37
1.5. Модуляция кардиогенной клеточной дифференцировки 48
Глава 2. Материалы и методы исследования 52
2.1. Электрофизиологические методы 54
2.2. Молекулярно-биологические эксперименты 61
2.3. Манипуляции с эмбриональными стволовыми клетками 74
2.4. Изоляция нативных кардиомиоцитов 82
Глава 3. Электрокардиофизиологическая характеристика кардиоспецифических HCN изоформ, экспрессированных в овариальных клетках китайских хомячков 86
3.1. Свойства HCN 1, HCN2 и HCN4 изоформ канала If в 86 модификации «вся клетка» в физиологическом растворе...
3.2. Свойства изоформ HCN 1, 2, 4 по данным метода «вся 95 клетка» в высококалиевом растворе
3.3. Сравнение электрофизиологических показателей изоформ HCN в физиологическом и высококалиевом растворах 100
3.4. Свойства кардиоспецифических HCN изоформ по данным метода «один канал» 106
Глава 4. Модуляция HCN-токов Р-субъединицей калиевых каналов MiRPl, экспрессированных в овариальных клетках китайских хомячков 113
4.1. Влияние р-субъединицы калиевого канала MiRPl на изоформу HCN1 114
4.2. Влияние Р-субъединицы калиевого канала MiRPl на изоформу HCN2 122
4.3. Влияние р-субъединицы калиевого канала MiRPl на изоформу HCN4 126
Глава 5. Прямые доказательства проведения кальция через HCN канал и человеческий нативный If ток при физиологических концентрациях кальция 133
5.1. Доказательства HCN2 канала в патче 135
5.2. Доказательства проведения кальция через HCN2 канал при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков 137
5.3. Кальций проницаем для If тока в нативных крысиных и человеческих кардиомиоцитах 143
5.4. HCN2 проводит кальций в присутствии Na+или К+ 148
5.5. Влияние кальция на ионную селективность и проводимость HCN канала 152
Глава 6. Электрофизиологическая и морфологическая идентификация пейсмекероподобных клеток в эмбриональных стволовых клетках мышей 158
6.1. Использование предсердного натрийуретического протеина в качестве промотора для идентификации пейсмекероподобных клеток 158
6.2. Создание эмбриональных тел и визуализация клеток с векторами 160
6.3. Иммуноблоттинг эмбриональных телец 164
6.4. Электрофизиологическая идентификация флюоресцирующих эмбриональных стволовых клеток 167
Глава 7. Влияние факторов дифференцировки эндотелина-1, ретиноевой кислоты и нейрорегулина-1 на ANP-EGFP- позитивные линии в эмбриональных стволовых клетках 176
7.1. Эндотелии-1, нейрорегулин-1 и ретиноидная кислота как факторы дифференцировки 176
7.2 Влияние эндотелина-1 на дифференцировку кардиомиоцитов в эмбриональных стволовых клетках 178
7.3 Влияние нейрорегулина-1 на дифференцировку кардиомиоцитов в эмбриональных стволовых клетках 185
7.4 Влияние ретиноевой кислоты на дифференцировку кардиомиоцитов в эмбриональных стволовых клетках 187
Глава 8. Обсуждение 191
8.1 Заключение 217
Выводы 221
Практические рекомендации 223
- Механизмы пейсмекерной активности
- Молекулярно-биологические эксперименты
- Влияние р-субъединицы калиевого канала MiRPl на изоформу HCN1
- Доказательства проведения кальция через HCN2 канал при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Широко известно, что частота сердечных сокращений (ЧСС) является важным фактором риска у больных с ишемической болезнью сердца и хронической сердечной недостаточностью [Шальнова С.А. и соавт., 2005; Gilman М. et al, 1993]. В связи с тем, что кардиальная проводящая система генерирует и синхронизирует сокращения сердца, её дисфункция может приводить к аритмиям и нарушениям проводимости различных степеней тяжести, вплоть до внезапной смерти. Ионный канал (If) активирующийся при гиперполяризации, регулируя ритм сердца, является определяющим для спонтанной диастолической деполяризации синоатриального узла (СА). Четыре изоформы данного канала HCN 1-4 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel) различаются не только своим распределением в тканях сердца и нервной системы, но и кинетикой, амплитудой и другими электрофизиологическими свойствами [Moosmang S. et al., 2001] и являются переносчиком ионов не только К+ и Na+ но и Са2+ [Yu X. et al., 2004]. В связи с тем, что кальций является важным внутриклеточным мессенджером, важной задачей представляется изучение электрофизиологических свойств тока ионов кальция через канал If. В последние годы интенсивно разрабатываются варианты трансплантации биологических пейсмекеров (БП), созданы селективные блокаторы канала If, что требует глубокого понимания особенностей механизмов его фунционирования [Kehat I. et al., 2001; Barbutti A. et al., 2007]. Идентификация изоформы HCN, наиболее близкой по своим свойствам к нативному каналу If, является необходимой предпосылкой путем трансфекции клеток-кандидатов для создания искусственных биологических пейсмекеров, которые будут использованы в терапевтических целях при поражении СА узла.
Несмотря на то, что изменение внеклеточного раствора в случае нативных кардиомиоцитов (КМЦ), в частности, повышение концентрации
7 калия, меняет кинетику тока и проницаемость ионов через канал If [Leitch S.,
1995; Azene E. et al., 1999], подобные исследования в трансфицированных
клетках, экспрессирующих некоторые изоформы HCN, проведены не были.
Р-субъединицы всех калиевых каналов обладают рядом важных
свойств, модулирующих изменение проводимости, селективности и других
параметров. Однако, по данным различных авторов, неоднозначным
является воздействие Р-субъединицы канала HCN MiRPl (MinK-related
protein, белок, относящийся к семейству MinK), кодируемый геном KCNE2,
на его электрофизиологические свойства: от снижения кинетики активации
канала до увеличения плотности тока [Altomare С. et al., 2003; Qu J. et al.,
2004]. Точное знание модулирующих свойств Р-субъединицы канала HCN
позволит создать биологические пейсмекеры с заданными
электрофизиологическими характеристиками, которые могут быть
использованы для лечения больных с различными поражениями
синоаурикулярного узла. t
Другой способ получения биологических пейсмекеров заключается в использовании эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), которые дифференцируются в различные клетки организма и, в том числе, в кардиомиоциты (КМЦ), и представляют собой удобную модель для исследования механизмов дифференцировки пейсмекерных клеток [Gassanov N. et al., 2004]. В настоящее время факторы дифференцировки КМЦ исследованы не достаточно.
Селекция КМЦ в направлении пейсмекерных клеток (ПК), в том числе с использованием факторов дифференцировки, таких как сосудистый цитокин эндотелии-1, нейрорегулин-1 и ретиноевая кислота, является перспективным направлением развития клеточных терапевтических стратегий для регенерации и/или репарации кардиальной проводящей системы и создания биологических пейсмекеров.
8 Цель исследования. Изучение механизмов функционирования и
регуляции If/HCN канала и селекция пейсмекероподобных клеток из
эмбриональных стволовых клеток.
Задачи исследования:
На основании микроэлектродных экспериментов представить характеристику кардиоспецифических субъединиц каналов HCN1 (hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel), HCN2 и HCN4. Определить HCN изоформу, наиболее близкую по электрофизиологическим параметрам нативному If току, в качестве кандидата для создания биологических пейсмекеров при поражении синоатриального узла.
Определить патогенез нарушений электрофизиологических свойств изоформ HCN1, 2 и 4 при повышении уровне калия.
В микроэлектродных и молекулярно-биологических исследованиях изучить влияние Р-субъединицы калиевых каналов MiRPl (MinK-related peptide) на кардиоспецифические изоформы канала HCN1, 2 и 4 в моделях трансгенной экспрессии изоформ в овариальных клетках китайских хомячков.
Установить патогенетические механизмы предсердного аритмогенеза путем исследования проведение ионов кальция через канал изоформы HCN2 при его трансгенной трансфекции в овариальных клетках китайских хомячков и в человеческих предсердных и неонатальных крысиных кардиомиоцитах.
На модели эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide), изучить возможности выделения по морфологическим критериям EGFP-ANP-позитивной сублинии клеток с фенотипом пейсмекерных клеток.
9 6. Определить влияние факторов дифференцировки - эндотелина-1,
нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты - на клетки EGFP-ANP-позитивной
сублиний эмбриональных стволовых клеток.
Научная новизна. В ходе решения поставленных задач получены
следующие новые научные результаты:
Установлены электрофизиологические характеристики
кардиоспецифичных изоформ HCN при их экспрессии в овариальных
клетках китайских хомячков. Получены прямые доказательства
проводимости ионов Са через канал HCN2, что может быть важным в
определении патогенетических механизмов предсердных аритмий и
возможностей их лечения. Показана модуляция
электр окардио физиологических свойств кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4 р-субъединицей MiRPl.
Для создания биологического пейсмекера выделены трансгенные линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие EGFP под транскрипционным контролем кардиоспецифичного промотора, в том числе линии клеток со свойствами пейсмекерных клеток. Оценен эффект факторов дифференцировки эндотелина-1, нейрорегулина-1 и ретиноевой кислоты на линии эмбриональных стволовых клеток, экспрессирующие EGFP под контролем кардиоспецифичного промотора: эндотелии-1 увеличивает концентрацию пейсмекероподобных клеток, нейрорегулин-1 не влияет на
7 О
данный показатель, а ретиноевая кислота в концентрациях 10" — 10" обладает эмбриотоксическим действием, в концентрации менее 10"9 -увеличивает концентрацию клеток, схожих с кардиомиоцитами предсердий.
Научно-практическая значимость:
1) В микроэлектродных экспериментах установлены
электрофизиологические свойства кардиоспецифичных изоформ HCN1, HCN2 и HCN4. Наиболее близкой по электрофизиологическим свойствам к
10 нативному каналу If оказалась изоформа HCN2, что позволяет считать её
кандидатом для создания биологических пейсмекеров.
2) Показано, что в растворе с высоким содержанием калия в изоформе
HCN1 и, в первую очередь, в HCN4 происходит замедление активации тока
через канал, что проявляется снижением ЧСС. Данная модель исследования
и полученные результаты могут быть использованы при изучении влияния
гиперкалиемии плазмы крови на состояние сердечно-сосудистой системы.
В микроэлектродных экспериментах показано модулирующее влияние р-субъединицы калиевых каналов MinK-related peptide (MiRP)l на электрофизиологические свойства и экспрессию HCN канала. При создании биологического пейсмекера коэкспрессия Р-субъединицы MiRPl способна модулировать свойства канала в зависимости от выбранной изоформы HCN.
Присутствие кальциевого тока в канале Ij/HCN, как важного клеточного мессенджера, может иметь значение для понимания механизмов развития некоторых сердечно-сосудистых заболеваний и состояний, а также в исследованиях аритмогенных свойств канала If.
5) Среди эмбриональных стволовых клеток, трансфицированных геном
EGFP под контролем кардиоспецифичного промотора, по морфологическим
критериям возможно выделение линии клеток, обладающих
пейсмекероподобным фенотипом.
6) В связи с тем, что эндотелии-1 способствует дифференцировке
кардиальных эмбриональных стволовых клеток в сторону
пейсмекероподобного фенотипа, данный фактор роста может быть
использован для увеличения количества пейсмекероподобных клеток в
данной клеточной линии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Кардиоспецифичные изоформы HCNl, HCN2 и HCN4 при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков обладают различной кинетикой активации.
В растворе с высоким содержанием калия в несколько раз возрастает амплитуда токов у всех изоформ; изоформы HCN1 и HCN4 замедляют активацию тока ионов через канал, что может быть причиной отрицательного хронотропного действия при гиперкалиемии.
Р-субъединица калиевых каналов MiRPl модифицирует функции канала HCN: увеличивает плотность тока в HCN2 и HCN4, кинетику активации всех изоформ HCN, экспрессию мембранных белков HCN2 и HCN4 и дифференцировано действует на вероятность нахождения канала в открытом/закрытом состояниях, доступность, вероятность открытия и, в то же время, увеличивает амплитуду открытия канала для всех изоформ.
Установлено проведение тока ионов Са через изоформу HCN2 и нативные крысиный и человеческий токи канала If.
В эмбриональных стволовых клетках возможно выделение клеток, экспрессирующих зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced fluorecsent protein) под транскрипционным контролем атриумспецифичного промотора гена ANP (atrial natriuretic peptide). В ANP-EGFP-позитивной линии клеток клетки веретенообразной формы обладали электрофизиологическими характеристиками пейсмекерных клеток.
Эндотелин-1 направляет дифференцировку ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону пейсмекероподобного фенотипа и увеличивает их количество в популяции. Нейрорегулин-1 не обладает таким действием. Ретиноевая кислота в низкой концентрации способствует дифференцировке ANP-EGFP-позитивных клеток в сторону фенотипа предсердных клеток, а в более высоких - обладает тератогенным действием.
Апробация работы и публикации. Результаты исследований были представлены на Всероссийском конгрессе молодых кардиологов (Москва, 2004), конгрессе Немецкого общества кардиологов (Манхайм, 2005), конгрессе Европейского общества кардиологов (Вена, 2007), Российских национальных конгрессах кардиологов (Москва, 2007, 2008), Конгрессе по
12 кардиоваскулярной терапии и профилактике (Москва, 2008), обсуждены на
заседании проблемной комиссии по кардиологии Башкирского
государственного медицинского университета и межкафедральном
совещании Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова. По материалам
диссертации опубликовано 23 работы, в том числе 9 - в рецензируемых
журналах, рекомендуемых ВАК, и из них 3 - в иностранных журналах.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 244 страницах компьютерного текста, содержит 105 рисунков, 30 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы из 270 наименований, включающего 5 отечественных и 265 зарубежных источников.
Выражаю искреннюю и сердечную благодарность руководителю
лаборатории клинической и молекулярной кардиофизиологии Кельнской
университетской клиники (Германия) проф. У. Хоппе и сотрудникам
лаборатории за предоставленную возможность выполнения
экспериментальной части исследовательской работы.
Механизмы пейсмекерной активности
Сердечно-сосудистые заболевания составляют в структуре смертности до 45% от смертности в популяции. Неоднократно было показано, что частота сердечных сокращений (ЧСС) является независимым фактором риска кардиоваскулярных заболеваний и, в частности, ишемической болезни сердца (ИБС). ЧСС является основной детерминантой потребления миокардом кислорода и метаболических веществ и, соответственно, кардиальной нагрузки. Повышенная ЧСС ведет к стрессу желудочковой стенки, снижению артериального комплаенса, повышению артериального давления (АД), уменьшению риска развития аритмий и повышению нестабильности атеросклеротической бляшки — рис. 1.
Персистирующее увеличение частоты сердечных сокращений является проявлением снижения тонуса вагуса и/или преобладанием симпатической активности, и независимым фактором риска сердечно-сосудистых заболеваний как у пожилых лиц, пациентов с ИБС, сердечной недостаточностью [Hjalmarson A. et al., 1990; Jouven X., 2005], так и в популяции в целом [Kannel W.B. et el., 1987; Kristal-Boneh E. et al., 2000]. В исследованиях Framingham Heart Study [Шальнова C.A. и соавт., 2005,; Gilman M. et al.,1993], NHANES I [Gillum R. et al., 1991,] показана корреляция ритма сердца с сердечной и общей смертностью, в некоторых других - со степеныо развития атеросклероза [Shell W. et al., 1973; Perski A. et al., 1988]. Частота сердечных сокращений является одним из важнейших факторов, определяющих потребление миокардом кислорода [Sonnenblick F. et al., 1968; Colin P. et al., 2003]. Снижение ЧСС и, соответственно, удлинение диастолы может увеличить время перфузии кровеносных сосудов, снизить метаболические затраты миокарда и улучшить миокардиальный ток крови. Одним из самых важных кардиопротективных эффектов Р-блокаторов (ББ), показавших впечатляющие результаты по их воздействию на сердечную и общую смертность [CIBIS-II, 1999], и как раз является снижение ЧСС [Kjekshus J. et al., 1985]. Однако, некоторые побочные эффекты ББ, такие как удлинение AV-проводимости, бронхоконстрикция, отрицательное действие на липидный и гликемический профили, лимитируют применение данной группы препаратов. Поэтому в настоящее время интенсивно продолжаются исследования, направленные на изучение как фундаментальных механизмов образования, контроля ритма сердца и аритмогенеза, а также создание новых лекарственных средств, способных модулировать ритм сердца, а также
Канал, активирующийся при гиперполяризации (If) Нормальная пейсмекерная сердечная активность происходит из специализированной области правого предсердия, называемой синоартриальным (СА) узлом. Этот участок в правом предсердии генерирует спонтанные электрические импульсы, и данная спонтанная активность регулируется симпатическими и парасимпатическими системами. Во время диастолы напряжение в клетках СА узла не стабилизируется, а, как известно, постепенно увеличивается, чтобы достичь порога для нового потенциала действия и продукции ритмических импульсов возбуждения. Период между двумя потенциалами действия (ПД), названный диастолической деполяризацией (ДД), вольтаж которой находится в пределах от - 65 до - 40 мВ, выполняет 2 задачи: генерирует спонтанную активность СА узла и регулирует ЧСС. Свойства ДД обуславливают натрийзависимый фоновый, медленный Т-кальциевый, исходящий выпрямляющий калиевый и NaVCa 4" обменный и другие каналы мембраны кардиомиоцитов, однако решающую роль в данном периоде, а также в генерации спонтанной активности пейсмекерных клеток играет так называемый ионный канал If (funny) [Thollon С. et al.,1994; Bois P. et al., 1996; Bucchi H. et al., 2002]. If или канал, активирующийся при деполяризации, заинтересовал электрокардиофизиологов еще 30 лет назад с самого открытия. Тогда Н. Brown и соавт. (1979) впервые сообщили о нахождении в СА узле медленного, направленного внутрь клетки, временно- и потенциалзависимого тока, который был назван Ih — hyperpolarizing (гиперполяризирующий). После открытия канала он стал объектом пристального изучения и его свойства исследовались весьма подробно [Noma A. et al., 1980; DiFrancesco D. et al., 1985; Thuringer D. et al.,1992]. Помимо сердечной ткани канал был найден также в центральных и периферических нейронах [McCormick D.A. et al., 1990; Pope H.C.et al. 1996; Seifert R. et al., 1999; Ludwig A. et al., 2003;] и фоторецепторах сетчатки [Fain G. et al., 1978; Bader С et al., 1979; Woolmuth L.P. et al., 1992]. Вскоре D. DiFrancesco et al. (1986) дали подробную кардио физиологическую характеристику канала, назвав его If — funny (забавный) или Iq — query (странный). Подобное оригинальное название канал получил из-за того, что он активируется при потенциале мембраны менее — 50 60 мВ, то есть в период потенциала покоя. Кроме того, он оказался неселективным и проницаем не только для Na+, но и К+ в соотношении примерно от 1:3 до 1:5. If ток меняет направление с входящего на исходящий при потенциале — 10/ -20 мВ, а его активацию можно описать одинарной или двойной S - образной экспоненциальной функцией, форма и крутизна которой различаются в зависимости от типа клеток. Он относится к семейству калиевых каналов и состоит из 4 субъединиц с 6 трансмембранными сегментами в каждом с позитивно заряженным 4-м сегментом, который и является потенциалзависимым сенсором [Ishii Т.М. et al., 1999; Chen S. et al., 2002] — рис. 2. Пора, через которую происходит трафик ионов внутрь клетки, находится между 5 и 6 субъединицами [Roncalia P. et al., 2002].
В подтверждении определяющей функции If канала в качестве пейсмекера как в человеческой популяции, так и в экспериментальных моделях была показана ассоциация мутаций HCN с брадикардией и синдромом слабости синусового узла [Baker К. et al., 1997; Vaca L. et al., 2000; Ziccha S. et al., 2004; Milanesi R. et al., 2006].
На основании свойств канала был предположен следующий механизм диастолической деполяризации [DiFrancesco D., 1993]. If деактивируется во время начала ПД и активируется во время реполяризации, когда напряжение достигает порогового значения (- 40 мВ). Медленная активация входящего If канала антагонизирует гиперполяризирующий эффект ток отложенного калиевого канала Ik до достижения максимального диастолического потенциала, и этим заставляет потенциал мембраны медленно деполяризироваться до порогового уровня с последующей активацией быстрым входящим током активации (кальциевый ток) и развитием нового ПД (рис. 3).
Молекулярно-биологические эксперименты
Во втором случае используется стеклянная пипетка с горазда меньшим кончиком и, соответственно, с более высоким сопротивлением (от 7 до 13 Ом). В том случае, если в месте контакта удается обнаружить наличие одного или более искомых каналов, то без проведения разрыва мембраны записываются его/их характеристики (активация/деактивация) с помощью стандартного программного обеспечения. Это будет являться вариантом «прикрепленный к клетке» (cell-attached) модификации «один канал» [Hamill О.Р. et al., 1981]. В некоторых случаях требуется измерить свойства каналов при равенстве вне- и внутриклеточных растворов. В таком случае используется вариант «вне клетки» (excised membrane), в котором при получении необходимого контакта пипетки с мембраной производят резкий подъем микроманипулятора с пипеткой таким образом, чтобы участок мембраны с каналом оторвался от клетки и оказался во внеклеточной жидкости. Микроэлектродные эксперименты в модификации «вся клетка» Микроэлектродные эксперименты в модификации «вся клетка» проводились с усилителем Axopatch 200В (Axon instruments, Foster City, CA, USA) с шагом 10 кГц и фильтрами 2 кГц. Записи токов были проведены при комнатной температуре (21-23 С). Внешний раствор состоял из КС1 (5 ммоль), NaCl (135 ммоль), СаСЬ (2 ммоль), глюкоза (10 ммоль), MgCb (1 ммоль), HEPES (4-(2-гидроксиэтил1)-1-пиперазинэтинсульфоновая кислота) 10 ммоль; рН было оттитрован до 7,4 с помощью NaOH. В некоторых экспериментах концентрация калия хлорида была снижена до 5 ммоль и, соответственно, натрия хлорида была увеличена до 135 ммоль. При записи If тока в стволовых клетках, клетках неонатальных мышей и предсердных клетках ВаСІг в концентрации 2 ммоль, CdCb - 200 нмоль и 4-аминопиридин - 4 ммоль были добавлены в экстраклеточный раствор для Растворы в микропипетках с электродом стандартно состояли из: К-глютамат (130 ммоль), KCI (15 ммоль), NaCI (5 ммоль), MgC (1 ммоль), HEPES (10 ммоль) и Mg-АТФ (5 ммоль); рН был отрегулирован до 7,3 с КОН. Боросиликатные микропипетки имели сопротивление кончика 2-4 МОм и были заполнены внутрипипеточным раствором. Величина If тока в экспериментах «вся клетка» была измерена при тестировании клетки (клочка) тестовыми потенциалами в диапазоне от — 30 до -150 мВ, в некоторых экспериментах до - 180 мВ с увеличивающимся шагом 10 мВ и плато в конце гиперполяризиции в течении 2,45-3 с как разница между «мгновенным» током в начале гиперполяризации и уровнем «плато» тока. Быстрая активация тока была получена пульсовой деполяризации + 20 мВ. При получении тока высокого качества вычислялись следующие параметры: амплитуда тока, равная разнице между «мгновенным» током в начале гипердеполяризации, измеряемая в пА (рис. 22), плотность тока, равная соотношению амплитуде тока и емкости клетки (в пА/пФ), кинетика активации (т), соответствующая точке, в которой регистрируется 66,6% перехода кривой тока в «плато». деактивацией импульсом + 20 мВ. Двухсторонней стрелкой показана точка вычисления силы тока канала, а односторонней - вычисляемая точка активации, то есть 66,6% от момента полной активации (в мс). Полученные данные по каждому их этих параметров в последующем были использованы для построения следующих кривых: 1. Соотношения напряжение/сила тока, 2. Нормализованное по силе тока соотношение напряжение/сила тока, 3. Кинетика активации (соотношение т/напряжение). Во втором случае вычислялась сигмоидальная регрессия при подстановке нормализованных данных плотности тока от максимального значения в формулу Больцмана: I=Imax/(l+exp(-(VtCst-Vi/2)/s), где I - плотность тока, Imax — максимальная плотность тока, Vtcst — использованное тестовое напряжение, Vi/2 - точка полуактивации и s - фактор уклона кривой. Полученные данные позволили с помощью статистической программы Origin 7.0 получить сигмоидальную кривую и вычислить следующие параметры: точка полуактивации, соответствующая напряжению, при котором кривая активировалась между верхним и нижним «плато», точка уклона (s-slope) — угол наклона кривой, определяемый в точке полуактивации. В некоторых экспериментах при температуре человеческого тела (36С) записывался также потенциал действия (ПД), инициированный короткими деполяризующими токовыми импульсами (2 мс, 500-800 пА). В ПД определялись следующие параметры (рис. 23):
Влияние р-субъединицы калиевого канала MiRPl на изоформу HCN1
Для проведения следующей серии экспериментов по изучению влияния Р-субъединицы MiRPl (MinK-related protein) на электрофизиологические свойства изоформ HCN и экспрессию каналов на поверхность мембраны клеток нами были созданы плазмиды pAdCGI-HCN1, pAdCGI-HCN2, pAdCGI-HCN4, содержащие в себе соответственно гены HCN1, HCN2 и HCN4, а также enhanced green fluorescent protein (EGFP) - зеленый флюоресцирующий белок для детекции клеток (рис. 31). Кодирующая последовательность красного флюоресцирующего белка RFP (red fluorescent protein) - была клонирована вместо RFP для генерации плазмиды PAdCRI. Полная кодирующая последовательность гена человеческой Р-субъединицы KCNE2, кодирующей MiRPl, была клонирована в плазмиду PAdCRI, чтобы создать соответственно pAdCRI-KCNE2.
Для исследования влияния р-субъединицы на электрофизиологические свойства трансфицированных изоформ HCN нами выбрана клеточная система овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ), хорошо зарекомендовавшая себя в экспериментах с экспрессией калиевых и других каналов. За 24 часа до трансфекции ОККХ линии К1 клетки были посеяны на чашки Петри размером 35 мм с плотностью 2,0 105 на каждую. Клетки были котрансфицированы необходимой HCN плазмидой с плотностью 0,25 мкг/чашка или/и 0,5 мкг/чашка плазмидой с KCNE2 с помощью Липофектамина Плюс в соответствии с рекомендациями производителя. Трансфицированные клетки выявлялись под микроскопом как клетки с зеленым (изоформы HCN) и зеленым+красным (коэкспрессия с 114 KCNE2) излучением с помощью ксеноновой лампы при 488/530 нм (возбуждение/эмиссия). Электрофизиологические эксперименты были проведены с помощью микроэлектродных экспериментов (МЭ) в модификациях «одна клетка» (тип «прикрепленный к клетке») и «вся клетка». Электрофизиологические эксперименты типа «вся клетка» patch clamp проводились в варианте «вся клетка» при физиологических концентрациях ионов внешнего (экстраклеточного) раствора (табл. 19). При проведении Вестерн блоттинга мембранных белков использовались спиртовое разрушение мембраны клеток, стандартный анализ на нитроцеллюлярной мембране и визуализация с помощью усиленной цветной флюоресценции (см. глава 2). Анти-HCNl антитела выявляли белковую фракцию с размером около 100 кБ, aHTH-HCN2 — около 120 кБ и aHTH-HCN4 (Alomone Labs, Израиль) - около 158 кБ. Субъединица HCN1 встречается в миокарде, преимущественно в незначительных количествах в желудочках, и обладает самой быстрой активационной кинетикой. После замены ростовой среды на достаточное количество экстраклеточного раствора в чашке с имеющимися ОККХ оптически 115 проводили поиск клеток с зеленым (HCN1) и красным (KCNE2) свечением под микроскопом с помощью флюоресцентного освещения с диной волны 488/530 нм (рис.19). К найденной клетке подводилась стеклянная пипетка, заполненная внутрипипетичным раствором и содержащая серебряный электрод, соединенный с устройством для регистрации сигналов. При достижении достаточного контакта пипетки с электродом с клеткой (гигасиль) производился разрыв мембраны в месте контакта (break in) с помощью резкого подсасывания воздуха. Затем при потенциале покоя - 35 мВ проводилась подача тестовых импульсов с напряжением от - 30 мВ до - 150 мВ. Для характеристики электрофизиологических свойств полученных кривых токов клеток использовались следующие параметры: амплитуда и плотность тока, значения кинетики активации (т). После построения нормализованных кривых соотношения плотности тока/напряжения вычислялись наклон кривой и точка полуактивации. На рисунке 49 представлены примеры записей HCN1 токов при тестовых потенциалах от - 30 до — 150 мВ в контроле и при коэкспрессии KCNE2, а на рисунке 50 - усредненные потенциалы в группе. Ни при одном тестовом потенциале достоверной разницы определено не было. При нормализации данных по плотности тока и сигмоидальном регрессионном анализе по формуле Больцмана кривые активации в обеих группах также были почти идентичны (рис. 51). Соответственно, и параметры нормализованных кривых не отличались между собой в двух группах (V,/2(HCN1)= - 108,6±3 против V1/2(HCN1+KCNE2)= - 113,6±1, р 0,05; k(HCNl)= 15,9±2,4 против k(HCNl+KCNE2)= 18,8±1,6, р 0,05) -табл. 20. В то же время, при сравнении кинетики активации в обеих группах клеток при сочетании HCN2+KCNE2 она оказалась «быстрее» контроля, а достоверность различия достигалась в диапазоне физиологической активации от - 70 до - 90мВ (x(HCNl)= - 342,8±52 против T(HCN1+KCNE2)= - 237±37,3 при - 90 мВ, р 0,05) - рис. 51,52. 119 При исследовании клеток в данных двух группах с помощью микроэлектродных экспериментов в модификации «один канал» (рис. 54, табл. 21) полученные результаты оказались несколько противоречивыми: с одной стороны, во 2-й группе (HCN1+KCNE2) достоверно снизилась доступность (с 99,25±0,7% до 74,47±12%, р 0,01) и увеличилась средняя первая латенция (с 179,8±94,8 мс до 652,59±14,7 мс, р 0,01), то есть в целом уменьшалась активность канала, но, с другой, увеличилась амплитуда отдельных открытий (с - 1,9±0,ЗпА до - 2,62±0,2пА, р 0,05). Наконец, при Вестерн Блот анализе мембранных белков клеток, трансфицированных HCN1 и котрансфицированных HCN1+KCNE2, не было найдено достоверных различий в плотности белков HCN1 (р 0,05) Таким образом, Р-субъединица калиевых каналов KCNE при коэкспрессии совместно с изоформой HCN1 в МЭ типа «вся клетка» не изменяла плотность тока и наклон кривой активации, однако приводила к сдвигу кривой активации влево и ускорению тока в физиологическом диапазоне. В микроскопических экспериментах уменьшилась доступность, но увеличилось среднее время нахождения в открытом состоянии и средняя первая латенция и амплитуда тока. Плотность тока на мембране, по данным Вестерн Блот анализа, достоверно не изменилась. В аналогичных условиях (см. подглаву 4.1) ген HCN2 и 0-субъединица калиевых каналов KCNE2 были экспрессированы в ОККХ. На рисунке 56 представлены примеры записи микроэлектродным методом «вся клетка» HCN токов в контроле и при коэкспрессии с KCNE2. На рисунке 57 также показаны кривые соотношения плотность тока/напряжение в обеих группах. В целом, плотность тока при коэкспресии с KCNE2 превосходила плотность тока в контроле, но достоверность различий была получена только в диапазоне от - 120 до -150 мВ (72,8±15,8 против 142,9±24,4 мВ при - 140 мВ, р 0,01). При нормализации данных по плотности тока и построении сигмоидальной регрессии по формуле Больцмана было показано, что Р субъединица не оказала никакого влияния на кривую активации в изоформе HCN2 (V1/2(HCN2)= 103,1±2 против V,/2(HCN2+KCNE2)=107,1±1 мВ и k(HCN2)= =19,72±1,4 против k(HCN2+KCNE2)=20,46, р 0,05) - рис. 58, табл. 20.
Доказательства проведения кальция через HCN2 канал при экспрессии в овариальных клетках китайских хомячков
Для проведения микроэлектродных экспериментов по определению наличия тока ионов кальция через If/HCN канал из трех кардиоспецифических изоформ HCN2 изоформа была выбрана как наиболее распространенная в миокарде [Moosmang G. et al., 1999; Santoro В. et al., 1999]. Вектор-плазмида pAdCGI-HCN2, содержащая, соответственно, ген HCN2, в качество промотера, а также в качестве репортера зеленый флюоресцирующий белок EGFP (enhanced green fluorescent protein) были использованы для трансфекции овариальных клеток китайских хомячков (ОККХ) линии К1. Клеточные линии были трансфицированы плазмидой с плотностью 0,25 мкг/чашка с помощью системы «Lipofectamin Plus».
Ушки правых предсердий были получены от 4 пациентов (2 мужчины, 71,5 ± 5,5 лет; 2 женщины, 70,0 ±14 лет) во время проведения операций аортокоронарного шунтирования в кардиохирургической клинике. Для получения предсердных кардиомиоцитов был использован стандартный метод изоляции предсердий (см. главу 2). Кардиомиоциты неонатальные крыс Sprague-Dawley (1-3 суток) были энзиматически диссоциированы и выделены по стандартной методике (см. главу 2).
Одноканальные эксперименты были выполнены с использованием стандартного микроэлектродных экспериментов "patch clamp" в модификации «один канал» с усилителем Axopatch 200 Вт и дигитайзером Digidata 1200 (Axon instruments, Foster City, CA, USA) при комнатной температуре (от 2 ГС до 23 С). После получения сопротивления в пипетке более одного гигасиля емкостные токи мембраны (от 15 до 105 пФ) были компенсированы до минимума, используя нейростабилизатор емкости, встроенный в усилитель Axopatch 200 Вт. Одноканальные записи были сделаны в конфигурациях «вне клетки» и «прикрепленный к клетке» при усилении в 2000 раз. Для записей «вне клетки» как пипеточный, так и внешний раствор содержали: КС1 (160 ммоль), MgCl2 (1 ммоль), HEPES (10 ммоль) (4-(2-гидроксиэтил1)-1-пиперазинэтинсульфоновая кислота), ЭДТА (1 ммоль); рН 7,4 с КОН. Для кальциевых записей «вне клетки» как внутрипипеточный, так и внеклеточный растворы содержали: Са2+-глютамат 2 или 20 ммоль и ТЕА-бромид (136 или 100 ммоль); рН был оттитрован до 7,4 с ТЕА-ОН. Для записей типа «прикрепленный к клетке» был использован следующий состав внутрипипеточного раствора (ммоль): К-глютамат 1, 4, 7, 10 или натрия глютамат 10, 100 и/или Са-глютамат 2, 20 и HEPES 10. Общая осмолярность 140 ммоль достигалась добавлением ТЕА-бромида (рН оттитрован до 7,4 с ТЕА-ОН). Внеклеточный раствор состоял из (ммоль): К-глютамат 140, Mg-глютамат 1, Са-глютамат 0,1, HEPES 10. Для регистрации «чистого» тока кальция через If канал к раствору были добавлены блокаторы всех известных на сегодняшний день кальциевых каналов: нифедипин в концентрации 10 мкмоль (Sigma, ФРГ), эфонидипин - 10 мкмоль (Nissan Chemical Industry, Япония), КВ-R79435 - 10 мкмоль (Calbiochem, ФРГ), 6-карбоксиэозин - 10 мкмоль (Sigma, ФРГ) и SKF-96365 - 10 мкмоль (Sigma, ФРГ) для блокирования соответственно L-тип кальциевого, Т-тип кальциевого, натрий-кальциевого обменного, плазма-мембранного АТФ-кальциевого и емкостного кальциевых каналов [Lee T.S. et al., 2006; Watanabe Y. et al., 2006; Nakayama H. et al., 2006] Кроме того, в некоторых экспериментах в экстрацеллюлярный раствор добавлялся 8-бром-аденозин 3 5 -циклический монофосфат 135 (Сигма, ФРГ) или ивабрадин (Сервье, Франция) в стоковом растворе в дважды дистиллированной воде в концентрации 10 ммоль. Одиночные каналы в патчах были деполяризованы на период 3 с с потенциала покоя - 35 мВ. В экспериментах с применением ивабрадина клетки гиперполяризовались (- 90/- 110 или - 130 мВ как указано с продолжительностью 150 мс) и деполяризовались (10 мВ; 150 мВ) на общий период 3 секунды. Ксеноновая лампа была настроена на определение зеленого флюоресцирующего белка при 488/530 нм (возбуждение/эмиссия). 5.1. Доказательства наличия HCN2 канала в патче Так как доступные данные о свойствах HCN единичных каналов различаются в зависимости от типа клеток и техники записи [Michels G. et al., 2004; Simeone T.A. et al., 2005; DiFrancesco D., 1986], то вначале мы решили подтвердить, что открытые каналы в записях это и есть HCN канал. Для этого была проведена регистрация тока в ОККХ с экспрессией данного канала в МЭ в модификации «один канал» при гиперполяризационном протоколе (тестовый потенциал от — 90 до — 130 мВ). Как показано на рисунке 68, оригинальные записи этих мультиканальных патчей после гетерогенной экспрессии HCN2 каналов проявляли время- и вольтажзависимости аналогично с записями типа «вся клетка» для токов Ij/HCN. Одноканальная проводимость изоформы HCN2 (24±4,62 пС) в патчах была сравнима с литературными данными в регистрациях типа «прикрепленный к клетке», в отличие от симметричного калиевого раствора в режиме «вне клетки». Симпатическая стимуляция с помощью цАМФ (1 ммоль) значительно увеличила вероятность открытия HCN2 канала с 24,7±11,1% до 51,0±14,1% (р 0,05) без изменения амплитуды одиночных каналов (рис. 69,70). Более того, было продемонстрировано значительное снижение вероятности открытия HCN2 канала при добавлении в раствор специфического ингибитора ивабрадина в концентрации 50 мкмоль (25,8±7,1 % против 6,08+3,45 %, р 0,05) - рис. 69, 70. Так как модуляция цАМФ и блокада специфическим ингибитором ивабрадином являются отличительными признаками I/HCN канала, то данные свойства полученных каналов подтверждают факт присутствия именно каналов HCN в патче при экспрессии в данной клеточной системе.
