Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы 13
1.1 .Современные представления о патогенезе ХОБЛ 13
1.2. Значение оксидативного стресса в развитии ХОБЛ 21
1.3. Т-клеточный иммунитет и ХОБЛ 32
1.4. Роль провоспалительных цитокипов в реализации хронического воспаления у больных ХОБЛ 40
1.5. Гемато-саливарный барьер и его роль в норме и патологии 49
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 59
2.1. Клиническая характеристика больных 59
2.2. Методы исследования 73
ГЛАВА III. Результаты исследования 84
3.1. Особенности функционирования оксидантной и антиоксидантной систем на различных этапах формирования ХОБЛ 85
3.1.1. Хемилюминесценция нейтрофилов крови и ХЛ плазмы у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением ХОБЛ 85
3.1.2. Динамика ХЛ системных нейтрофилов и ХЛ плазмы у больных с обострением ХОБЛ на фоне противовоспалительной терапии 93
3.1.3. Антиоксидантная активность плазмы у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением ХОБЛ 98
3.2. Системный Т-клеточный иммунитет и особенности клинического течения ХОБЛ 100
3.3. Особенности метаболизма провоспалительных цитокипов (ИЛ-ір, ФНО-а) при различных вариантах течения ХОБЛ 112
3.3.1. Динамика содержания провоспалительных цитокипов (ИЛ-1(3, ФНО-а) в различных биологических средах у больных с обострением ХОБЛ на фоне лечения 133
3.4. Особенности метаболизма макро- и микроэлементов, окислителыю-восстановтельных ферметов при ХОБЛ 140
3.4.1. Динамика содержания магния, свободного железа, ЛДГ в слюне у больных с обострением ХОБЛ на фоне лечения 151
3.5. Характеристика функционального состояния гемато-саливарного барьера у «здоровых» курильщиков и больных с обострением ХОБЛ 155
3.5.1.Влияние противовоспалительной терапии на функциональное состояние гемато-саливарного барьра у больных с обострением ХОБЛ 163
Заключение 182
Выводы 209
Практические рекомендации
- Т-клеточный иммунитет и ХОБЛ
- Роль провоспалительных цитокипов в реализации хронического воспаления у больных ХОБЛ
- Хемилюминесценция нейтрофилов крови и ХЛ плазмы у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением ХОБЛ
- Особенности метаболизма макро- и микроэлементов, окислителыю-восстановтельных ферметов при ХОБЛ
Т-клеточный иммунитет и ХОБЛ
В обычных условиях небиологические частицы и микроорганизмы при вдыхании задерживаются в верхних дыхательных путях, а нижние отделы остаются стерильными за счет высокой эффективности защитных механизмов (мукоцилпарный транспорт, компоненты местного клеточного и гуморального иммунитета и др.). Наличие бактерий в нижних дыхательных путях отражает нарушение работы защитных механизмов, как на местном, так и на системном уровне [285], свидетельствует о высокой вирулентности этиологического фактора [100], что позволяет бактериям преодолевать местную защиту.
Под влиянием токсических веществ небиологической природы, и в первую очередь, никотина, в бронхах замедляется мукоцилиарный транспорт, что обусловлено дезорганизацией биения ресничек, их потерей клетками мерцательного эпителия, плоскоклеточной метаплазией реснитчатого эпителия, усилением продукции слизи секретирующими железами [184]. В этих условиях усиливаются взаимодействия (адгезия) патогенной микрофлоры со слизистой оболочкой бронхов. Результатом усиления адгезии микробов к поверхности эпителия является его колонизация, клинически проявляющаяся только при высокой вирулентности микрофлоры [119,137]. Сама по себе колонизация микроорганизмов в нижних отделах респираторного тракта является индикатором местного дефекта защиты бронхов и вносит существенный вклад в хроническое течение воспаления [279]. Важнейшим свойством патогенных микроорганизмов является их способность к активной инвазии в клетки эпителия дыхательных путей. В ответ на инвазию бактерий в эпителий бронхов растормаживается процесс фагоцитоза, осуществляемый двумя типами клеток - полиморфпоядерными нейтрофиламн и альвеолярными макрофагами (AM). В мокроте и бронхоальвеолярной жидкости (БАЛЖ) у больных ХОБЛ обнаруживается повышенное число активированных нейтрофилов [239,274,290], хотя их роль до конца еще не ясна. У курильщиков без клинических проявлений ХОБЛ также определяется увеличение числа эндобронхиальных нейтрофилов [255]. А при обострении болезни имеет место более значительное накопление топических нейтрофилов в БАЛЖ [150J. Фагоциты участвуют в различных цитотоксических реакциях, уничтожении микроорганизмов путем высвобождения повреждающих продуктов (лизоцим, миелопероксидазы и эластазы, нейтрофильный липокаин, супероксиданион, перекись водорода, реактивные оксинитрогенные посредники (RONI), оксид азота) [204]. Антибактериальная активность фагоцитов также является и результатом кислороднезависимых бактерицидных механизмов, включающих продукцию катионных белков, лактоферрина, гидролитических ферментов [15,62]. Кроме этого, у больных ХОБЛ в бронхах определяется повышенное количество AM, что выявляется при гистологическом исследовании, в БАЛЖ, индуцированной мокроте [203,233]. Предполагают, что активированные AM играют регулирующую роль в воспалении путем высвобождения провоспалительных цитокинов, лейкотриенов, которые, в свою очередь, способствуют нейтрофильному воспалению [285].
Таким образом, современные положения о патогенезе ХОБЛ отводят ведущую роль в развитии хронического воспаления тканевым нейтрофилам. Однако особенности функционирования системных нейтрофилов у курильщиков без симптомов ХОБЛ и у больных ХОБЛ с различной степенью тяжести и в разные периоды болезни исследованы недостаточно.
Успехи в изучении биологической активности провоспалительных цитокинов продемонстрировали их роль в генезе хронического топического воспаления у больных ХОБЛ [156]. Данные молекулярные биомаркеры ответственны за широкий спектр патологических изменений и регуляцию иммунных реакций. Wilson R., 1996 [285] и Пипи Б., 2000 [89] показана отчетливая взаимосвязь между содержанием топического ФНО-а и степенью выраженности бронхообструкции. Некоторые из цитокинов имеют собственную антииатогенную активность и/или вносят свой вклад в активацию таких эффекторных клеток, как нейтрофилы, AM, Т-лимфоциты. Так, например, ИЛ-1(3 активирует Т-клеткн и усиливает секрецию ИЛ-2, который, в свою очередь, ИЕідуцирует высвобождение ФНО-а макрофагами [142].
Большинство работ, демонстрирующие результаты исследований цитокиновой агрессии на морфологические структуры бронхиальной стенки, бронхиальную секрецию, проходимость воздухоносных путей, имеют экспериментальное значение и проводились in vitro [243,285]. Установлено, что провоспалительные биомаркеры синтезируются в клеточных мембранах активированных клеток-эффекторов и осуществляют регуляцию сокращения бронхов, повышают сосудистую проницаемость, индуцируют секрецию слизи, усиливают хемотаксис. Меньше данных о механизмах продукции цитокинов у больных ХОБЛ, так как данные вещества были открыты позднее других провоспалительных факторов. Это открывает новые перспективы для дальнейших клинических исследований при данной патологии.
Постоянно растущее число исследовательских работ, посвященных изучению патогенетических механизмов ХОБЛ, свидетельствуют о том, что при ХОБЛ возникает дисбаланс оксиданты/антиоксиданты в сторону оксидантов. Маркеры оксидатнвного стресса найдены в жидкости на поверхности эпителия бронхов, конденсате выдыхаемого воздуха и индуцированной мокроте у «здоровых» курильщиков и больных ХОБЛ [174,220,222,242]. Оксидативный стресс участвует в патогенезе ХОБЛ различными путями. Оксиданты обладают прямым разрушающим действием на многие биологические молекулы, что приводит к гибели клеток. Кроме прямого действия, оксиданты активируют протеазы, что ведет к дисбалансу протеазы-антипротеазы, инициируют высвобождение провоспалительных цитокинов, участвующих в поддержании и прогрессировании хронического воспаления у больных ХОБЛ.
Роль провоспалительных цитокипов в реализации хронического воспаления у больных ХОБЛ
Учитывая, что настоящее исследование посвящено сравнительному изучению компонентов системного воспалительного ответа у больных с различной степенью тяжести ХОБЛ, вполне оправданным является анализ клинических проявлений системных эффектов. У пациентов с легким течением болезни системные клинические проявления ХОБЛ отсутствовали. Системные клинические эффекты хронического воспаления были зарегистрированы при средней и тяжелой степени тяжести ХОБЛ. Полицитемия установлена у 9 (20,4%) больных 2-й группы и 26 (76,4%) пациентов 3-й группы, кардиоваскулярные нарушения (хроническая сердечная недостаточность на фоне хронического легочного сердца) определялись у 5 (11,3%) обследованных 2-й группы и 34 (100%) больных с тяжелым течением болезни. Снижение массы тела (15 (44,1%) пациентов) и нарушения психической сферы (тревожно-депрессивный синдром, нарушение сна, анорексия) (28 (82,3%) пациентов) отмечались только на фоне тяжелых нарушений бронхиальной проходимости.
У всех больных с обострением ХОБЛ исследовали уровень гемоглобина, количество лейкоцитов, эритроцитов, СОЭ, фибриногена в периферической крови, проводили цитологическое исследование индуцированной мокроты. Каждому пациенту с обострением ХОБЛ выполнялось рентгенологическое исследование органов грудной клетки для исключения пневмонии, объемных образований, туберкулеза легких.
Исследование клинического анализа крови и белков острой фазы (фибриноген) относят к малоинформативным методам диагностики обострений ХОБЛ, что зафиксировано и в настоящем исследовании. Установлено, что ускорение СОЭ наиболее характерно для пациентов с обострением ХОБЛ легкой и средней степени тяжести. В этих группах обследованных уровень СОЭ выше 20 мм/ч определялся в 29,6% случаев при легких бронхообструктивных нарушениях и в 37,8% - на фоне средпетяжелого течения болезни. При обострении ХОБЛ тяжелой степени тяжести увеличение СОЭ зарегистрировано у 2-х пациентов (6,6%). Аналогичная тенденция отмечена и в отношении численности лейкоцитов крови. Исходно умеренный лейкоцитоз максимально до 13,6 xlO 9 г/л выявлен у 15,7 % больных 1-й группы, 18,4% пациентов 2-й группы и у 3,3% больных с тяжелым течением ХОБЛ. Содержание циркулирующего фибриногена при обострении ХОБЛ максимально повышалось до 8,8 г/л. Исследования показали, что при легком течении болезни концентрация фибриногена в крови у всех обследованных соответствовала показателям нормы. У пациентов со средней степенью тяжести ХОБЛ уровень фибриногена был повышен в 32,1% случаев. Обострение ХОБЛ тяжелой степени тяжести характеризовалось усиленным образованием фибриногена у 12 больных (40%).
Следующий этап диагностики ХОБЛ включал исследование ФВД (ЖЕЛ, ОФВ,, индекс Тиффно (ОФВ,/ФЖЕЛ), МОС75, МОС50, МОС25 и оценку бронходилатационного теста для подтверждения частичной необратимости бронхиальной проходимости. Результаты полученных данных в различных группах больных с обострением ХОБЛ, у курильщиков без симптомов ХОБЛ и в группе контроля представлены в таблице 2.1.4.
Кроме традиционных функциональных параметров (ОФВь индекс Тиффно), являющихся маркерами ХОБЛ были изучены средние значения максимальной объемной скорости выдоха (МОС75 - 2s)- Отмечено, что у больных с обострением ХОБЛ средней и тяжелой степени тяжести МОС на протяжении всех отделов воздухоносных путей характеризуется крайне низкими показателями, что отражает диффузное изменение проходимости бронхов, обусловленное генерализованным патологическим процессом. У пациентов с легкими обструктивными нарушениями зарегистрировано более значимое снижение МОС25, что, вероятно, отражает раннее формирование патологических изменений в мелких бронхах. В группе курильщиков без клинических симптомов ХОБЛ с нормальными показателями ОФВ] и иТ было выявлено достоверное снижение МОС25 по сравнению с группой здоровых добровольцев. Таблица 2.1.4. Параметры ФВД у больных с обострением ХОБЛ, курильщиков без симптомов ХОБЛ и здоровых некурящих лиц (X ± о)
Таким образом, ограничение МОС на уровне дистальных отделов бронхиального дерева у курящих лиц может служить дополнительным функциональным признаком тяжести заболевания.
Степень выраженности гипоксемии оценивали по величине напряжения (сатурации) кислорода в артериальной крови (Sa02). Снижение Sa02 от 98%) до 95% (легкая степень гипоксемии) определялось в 28,6% случаев, от 94 - 90% (среднетяжелая степень гипоксемии) - у 48,7% больных и ниже 90% (тяжелая степень гипоксемии) - в 22,7% случаев. Стандартным инструментальным исследованием для каждого больного с обострением ХОБЛ является электрокардиография. Анализ электрокардиограмм в изучаемых группах пациентов выявил нарушения, отражающие, прежде всего, изменения в правых отделах сердца, только при средней и тяжелой степени тяжести ХОБЛ (табл. 2.1.5.).
У больных с легким течением ХОБЛ в период обострения изменений ЭКГ не зарегистрировано. Во 2-й группе больных в разгар заболевания ЭКГ-признаки перегрузки правых камер сердца определены у каждого второго пациента (52,5%). Тяжелая степень ХОБЛ в стадии активации хронического воспаления сопровождалась ЭКГ-изменениями в 94,1% случаев.
Хемилюминесценция нейтрофилов крови и ХЛ плазмы у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением ХОБЛ
Таким образом, можно считать, что усиление интенсивности ХЛ плазмы, индуцированной перекисью водорода, у больных легкой и средней степени тяжести отражает усиление процессов ПОЛ и характеризует активность хронического воспаления на системном уровне.
Сравнительная оценка ХЛ системных нейтрофилов и ХЛ плазмы у больных с обострением ХОБЛ тяжелой степени тяжести выявила несколько иные изменения по сравнению с исследуемыми группами. Спонтанная ХЛ нейтрофилов крови у больных 3-й группы была достоверно выше по сравнению со здоровыми некурящими добровольцами (в 6,6 раз, р 0,01) и курильщиками без симптомов ХОБЛ (в 2 раза, р 0,05). Однако существенных различий данного показателя между пациентами с тяжелым течением ХОБЛ и больными 1-й и 2-й групп не зарегистрировано. Противоположные изменения зафиксированы для индуцированной пробы ХЛ системных нейтрофилов. Тяжелое течение ХОБЛ в стадию активации воспаления характеризовалось достоверным снижением стимулированного ХЛ-ответа граиулоцитов по сравнению с больными 1-й (в 1,8 раза, р 0,05) и 2-й (в 2 раза, р 0,01) групп. Однако мы не обнаружили различий между интенсивностью свечения активированных нейтрофилов крови у пациентов с тяжелой степенью тяжести ХОБЛ, здоровых некурящих лиц и курильщиков без нарушений ФВД.
Характерным признаком тяжелого течения ХОБЛ в период обострения явилось достоверное снижение коэффициента клеточной активности (в 1,5 раза, р 0,05) в отличие от здоровых некурящих добровольцев, курильщиков без симптомов ХОБЛ и больных 1-й и 2-й групп. Также следует отметить, что у пациентов 3-й группы время индукции не отличалось от нормативов здоровых некурящих лиц, но было ниже, чем у «здоровых» курильщиков и больных с легким и среднетяжелым течением ХОБЛ (в 1,6 раз, р 0,05).
Известно, что при тяжелом течении ХОБЛ на фоне гипоксии, токсического действия системного ФНО-а, усиленного высвобождения катехоламинов и других биологически активных веществ в значительной мере истощаются белковый, углеводный и жировой обмен [245,236]. Теоретически, можно предположить, что у больных ХОБЛ с тяжелыми нарушениями бронхиальной проходимости и, особенно, со сниженной массой тела следует ожидать снижение не только ХЛ-ответа нейтрофилов, но и интенсивности свечения плазмы, индуцированной перекисью водорода. В настоящем исследовании было получено подтверждение этой гипотезы. Установлено, что у больных с обострением ХОБЛ тяжелой степени тяжести стимулированная ХЛ плазмы достоверно снижалась относительно уровня данного показателя пациентов 1-й и 2-й групп (в 4 раза, pi 0,001). Неадекватный метаболический ответ стимулированных нейтрофилов крови при тяжелом течении ХОБЛ, возможно, связан с цитотоксической несостоятельностью системных фагоцитов и усилением апоптоза гранулоцитов под влиянием циркулирующего ФНО-а, что согласуется с данными литературы [65]. Угнетение процессов СРО в крови после воздействия активаторов (перекиси водорода) в данной группе пациентов, может обеспечиваться низкой активностью биоэнергетических процессов и нарастающим дефицитом липидного субстрата для окисления, ранее истощенного в ходе выраженных свободнорадикальных реакций.
Итак, снижение таких параметров оксидативного стресса, как интенсивность стимулированной ХЛ нейтрофилов крови и ХЛ плазмы, уменьшение коэффициента клеточной активности у больных с обострением ХОБЛ тяжелой степени тяжести могут свидетельствовать о снижении резервной способности нейтрофилов и рассматриваться в качестве диагностического критерия неблагоприятного течения болезни. Таким образом, изучение показателей ХЛ системных нейтрофилов и ХЛ плазмы у больных ХОБЛ и курильщиков без нарушений ФВД в сравнении со здоровыми некурящими добровольцами выявило их существенные различия, что связанно с активностью воспалительного процесса, стадией ХОБЛ и наличием факторов риска (курение). Выявленные закономерности позволили определить ранние диагностические критерии системного воспалительного ответа у «здоровых» курильщиков — одновременное усиление ХЛ-ответа системными нейтрофилами и увеличение времени индукции. Тяжесть клинически значимой ХОБЛ характеризуется снижением или повышением интенсивности ХЛ циркулирующих нейтрофилов, активности ПОЛ (по уровню ХЛ плазмы), величиной периода индукции и коэффициента клеточной активности.
Для подтверждения взаимосвязи системного воспаления и топических воспалительных нарушений у больных ХОБЛ был проведен корреляционный анализ между интенсивностью ХЛ системных нейтрофилов и показателями ОФВ). Оказалось, что степень и направленность коррелятивных связей между изучаемыми параметрами зависели от тяжести ХОБЛ. При легком течении заболевания в период обострения выявлены негативные корреляции между индуцированной ХЛ циркулирующих нейтрофилов и ОФВ] (г=-0,37, р 0,05), а также между интенсивностью собственного свечения системных гранулоцитов и ОФВ) (г=-0,31, р 0,05). ХОБЛ средней степени тяжести характеризовалась потерей взаимосвязей между спонтанной ХЛ нейтрофилов и ОФВі (г=-0,11), но сохранением отрицательных связей стимулированной ХЛ клеток-эффекторов крови и степени бронхиальной обструкции (г=-0,32, р 0,05).
Особенности метаболизма макро- и микроэлементов, окислителыю-восстановтельных ферметов при ХОБЛ
Следует подчеркнуть, что выраженность дефицита магния в слюне у больных ХОБЛ имеет линейную зависимость от тяжести бронхообструктивных нарушений. Так, недостаток саливарного магния у больных 2-й и 3-й групп превышал выраженность магниевого дефицита пациентов с легкой степенью тяжести ХОБЛ в 1,5 и 1,9 раза соответственно (Р 0,05).
При сравнительном изучении содержания кальция в слюне обнаружены нормальные значения данного макроэлемента во всех группах обследованных, что свидетельствует о высокой стабильности метаболизма кальция, несмотря на ирогрессирование воспаления и ухудшение бронхиальной проходимости. Полученные результаты свидетельствуют о том, что формирование хронического воспаления на фоне активного курения при ХОБЛ не связано с нарушением метаболизма кальция в крови и слюне.
В ходе сравнительного исследования содержания свободного железа в слюне выявлено его достоверное избыточное накопление у больных 2-й группы (в 2 раза, р 0,05) по сравнениюс контрольной группой здоровых некурящих добровольцев. Однако достоверных различий концентрации саливарного железа между группами больных с обострением ХОБЛ не зарегистрировано.
Динамика содержания ЛДГ в слюне у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением заболевания отличалась разнонаправленными сдвигами и зависела от тяжести вентиляционных нарушений. На фоне активного курения у лиц без нарушений ФВД уровень ЛДГ в слюне превышал нормативы здоровых некурящих добровольцев в 1,8 раза (р 0,05). При легком и среднетяжелом течении болезни в период активации саливарный уровень ЛДГ достоверно повышался по сравнению с нормативами некурящих лиц - в 3,4 раза и 3 раза - соответственно (р 0,01). Обострение ХОБЛ тяжелой степени тяжести сопровождалось статистически значимым снижением концентрации ЛДГ в слюне (в 1,5 раза, р 0,05) относительно контрольной группы. Кроме того, определены достоверные различия содержания ЛДГ в секрете ротовой полости между группами больных с обострением ХОБЛ. Саливарный уровень ЛДГ у пациентов 3-й группы был в 5,2 раза (р 0,01) ниже, чем у больных с легким течением ХОБЛ и в 4,6 раза (р 0,01) меньше по сравнению со 2-й группой обследованных. Сопоставление концентрации данного фермента в слюне между 1-й и 2-й группами достоверных различий не выявило.
Помимо изучения активности ЛДГ слюны у всех обследованных проанализировали содержание таких известных ферментов как ACT и АЛТ. Установлено, что у курильщиков без нарушений ФВД концентрация изучаемых ферментов находится в диапазоне нормативов контрольной группы некурящих лиц. Достоверное повышение активности АЛТ в слюне зарегистрировано у пациентов 1-й группы (в 2,4 раза; р 0,05). При тяжелой степени тяжести ХОБЛ имело место двукратное увеличение саливарного уровня АЛТ по сравнению со здоровыми некурящими добровольцами. Избыточное накопление ACT в секрете ротовой полости в 1,5 раза (р 0,05) выше, чем у здоровых некурящих лиц зафиксировано только в группе больных ХОБЛ с тяжелыми бронхообструктивными нарушениями.
Итак, сравнительное изучение некоторых биохимических параметров слюны у курящих лиц без нарушений ФВД и больных с клинико-функциональными проявлениями ХОБЛ выявило отчетливые сдвиги содержания магния, свободного железа, ЛДГ и ACT в секрете слюнных желез. Установлено, что характер и степень выраженности выявленных нарушений метаболизма изученных веществ зависят от активности и стадии хронического воспаления.
В таблице 3.4.3. представлены результаты чувствительности изменений биохимических компонентов слюны у «здоровых» курильщиков и больных с обострением ХОБЛ различной степени тяжести. Из таблицы видно, что определение содержания магния, свободного железа, ЛДГ и АЛТ в секрете ротовой полости следует отности к высокочувствительным диагностическим критериям системных воспалительных реакций у курильщиков без нарушений ФВД и маркерам прогрессировать системного воспаления у больных с обострением ХОБЛ. Следует отметить, что повышение чувствительности представленных показателей у больных с обострением ХОБЛ линейно возрастает в зависимости от тяжести заболевания и достигает максимальных значений у пациентов с тяжелыми бронхообструктивными нарушениями (например, чувствительность 94,4% для магния).
Для подтверждения патогенетической роли свободного железа в инициации и регуляции реакций СРО у курильщиков без нарушений ФВД и больных с обострением ХОБЛ проведен корреляционный анализ между содержанием данного микроэлемента в секрете ротовой полости и показателями ХЛ и АОА (табл. 3.4.4.). В ходе изучения корреляционных связей в группе «здоровых» курильщиков мы не обнаружили существенного влияния свободного железа слюны на процессы СРО и антиоксидантную активность. Легкое течение болезни в стадии активного воспаления характеризовалось умеренными положительными связями содержания свободного железа в слюне и спонтанного свечения нейтрофилов крови (г=+0,41, р 0,01).
Похожие диссертации на Иммуно-биохимические механизмы системного воспаления в патогенезе хронической обструктивной болезни легких
