Введение к работе
Актуальность проблемы. В последнее десятилетие одновременно с ростом средней продолжительности жизни населения и сосудистых заболеваний мозга, отмечается значительное увеличение числа больных дрожательным параличей и синдромом Пар-кинсона (Маньковскнй и др., 1988; Каменецкнй, 1995). Эти заболевания встречаются у 1% населения до 60 лет и до 5% у лиц старшего возраста, что соответствует 60-180 случаям на 100000 населения {Marttila, 1987; Stern, Roller, 1992). Рост заболеваемости и наблюдаемое "омоложение" паркинсонизма (Ходос, Кондакова, 1982) выдвигают данную патологию в ряд актуальных медико-социальных проблем.
Основным подходом в лечении паркинсонизма остаётся заместительная терапия сравнительно легко проникающим в мозг предшественником дофамина (ДА) - L-3,4-дигидроксифенилаланином (L-DOPA) (Woiiers et al., 1994). Однако клиническая нестабильность по типу "wearing-оГГ и "on-of феноменов, периферические и центральные побочные эффекты, обусловленные колебаниями концентрации L-DOPA в крови и мозге, интенсивным периферическим декарбоксилированием препарата и развитием денер-вационной гиперчувствительности ДА-рецептороа стриатума, значительно затрудняют корректировку дозы и ритма введения L-DOPA (Quinn, 1990; Wooten, 1990; Obeso, Linazasoro, 1994). Для решения этих проблем предпринимались различные методические подходы к заместительной терапии паркинсонизма: применение L-DOPA с ингибитором периферических декарбоксилаз - карбидопой (Nutt, 1987); заключение L-DOPA в полимерные матрицы, обеспечивающие контролируемое его высвобождение (LeWitt, 1993); внутривенные (Quinn, 1990) и интрацеребровентрикулярные инфузии L-DOPA (Hood et al., 1988); применение гидрофобных предшественников ДА (Murata et al., 1990) и, наконец, трансплантация эмбриональных ниграпьных клеток в мозг (Backlund, 1985). Однако, несмотря на достигнутые успехи, разработка новых подходов к заместительной терапии паркинсонизма, направленных на увеличение ее эффективности, сохраняет свою актуальность.
Одним из способов защиты лекарственных веществ от периферической биотрансформации, увеличения времени циркуляции в кровотоке и снижения дозы, является их заключение в липосомы (Gregoriadis, 1995). Липосомы лишены ограничений по химическому и структурному диапазону переносимых веществ (Fendler, 1980), а их ли-пидные компоненты подвержены полной биодеградации (Poste, 1980). Липосомы способны улучшать доступ лекарственного вещества в области, нуждающиеся в лечении (Марголис, 1987). Успешное применение липосом было продемонстрировано ранее для ряда противосудорожных препаратов, которые не способны самостоятельно преодолевать гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) (Loeb et al., 1982; Yokoyama et al., 1992; Mori et al., 1992). Показана возможность длительной коррекции двигательных нарушений
при экспериментальном гемипаркинсонизме у крыс на фоне интрастриатной имплантации липосом с ДА (During et al., 1992). Однако попыток к системному применению ли-посомалькых форм L-DOPA и ДА для терапии экспериментального паркинсонического синдрома (ПС) до настоящего времени не предпринималось. Изучение влияния "пустых" липосом на развитие ПС имеет самостоятельную ценность, так как известно, что липосомы восстанавливали нарушения метаболизма липидов и оказывали ан-тиоксидантное и общее терапевтическое действие при различных патологических состояниях у животных (Skinner et al., 1989; Стефанов и др.,1990; Лескова, Удовиченко, 1991), стимулировали секрецию ДА в мозге мышей (Bigon et al., 1979) и увеличивали афинность ацетилхолиновых (Gelbmann, Muller, 1991) и NMDA-рецепторов (Cohen, Muller, 1992) в мозге старых крыс.
В связи с вышеизложенным, идеи, предполагающие системное использование липосом с L-DOPA и ДА для заместительной терапии паркинсонизма и изучение влияния "пустых" липосом на развитие ПС, не лишены оснований. Экспериментальной проверке этих предположений и посвящена данная диссертация.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в выяснении эффективности системного применения L-DOPA и ДА, заключённых в липосомы, для терапии экспериментального 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин (МФТП) -индуцированного паркинсонического синдрома (ПС).
В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:
1. Осуществить подбор оптимального липидного состава и технологических
условий для приготовления дисперсии липосом с L-DOPA и ДА. Охарактеризовать фи
зико-химические свойства липосом с L-DOPA и ДА (размеры, процент включения мо
ноаминов, стабильность липосом, кинетику окисления моноаминов в липосомах, влия
ние моноаминов на пространственную упаковку липидов в липосомах и на кинетику
перекисного окисления липосомальных липидов).
-
Подобрать схему и способ введения липосомальных лекарственных форм и изучить их влияние на параметры двигательной активности животных как в условиях нормы, так и при экспериметальном ПС.
-
Исследовать влияние липосомальных лекарственных форм на нейрохимические параметры обмена катехоламинов в стриатуме животных с экспериментальным ПС и в норме.
-
Изучить влияние липосомальных лекарственных форм на уровень конечных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в стриатуме и плазме крови, а также исследовать их влияние на фосфолипидньїіі состав стриатума при экспериментальном ПС и в норме.
5. Оценить количественые и кинетические параметры проникновения липосо-мальных форм катехоламинов в стриатум.
Научная новизна работы. Впервые предпринято системное применение малых одноламеллярных липосом (МОЛ) из яичного фосфатидилхолина (яФХ) и холестерина (Хол), нагруженных L-DOPA и ДА для проведения экспериментальной заместительной терапии МФТП-индуиированного ПС у мышей C57BL/6. Установлено, что степень включения L-DOPA и ДА в 5% дисперсию липосом с размерами 60 нм крайне мала, ограничена внутренним объемом везикул и не превышает 12-15%, а регресс паркинсо-нической симптоматики у животных, наступает только на фоне длительного внутри-брюшинного (в/б) введения L-DOPA и ДА, заключённых в МОЛ. Впервые обнаружено, что заключение L-DOPA и ДА в МОЛ позволяет пролонгировать антипаркинсониче-ский эффект до 5 ч, в отличие от 10-кратно больших доз свободного L-DOPA, действующего в течение і ч, и полностью неэффективного ДА. Показано, что антипаркин-соническая эффективность липосомальных форм L-DOPA и ДА коррелирует с частичной компенсацией дефицита уровня ДА и его метаболитов в стриатуме. В связи с этим, полученные результаты, являются доказательством способности липосом эффективно транспортировать малые дозы моноаминов в мозг и принимать непосредственное участие в проникновении L-DOPA и ДА через ГЭБ. Впервые проведенная количественная оценка проникновения липосомальных форм катехоламинов в стриатум показала, что МОЛ ускоряют этот процесс в 100 раз.
Выявлено умеренное антипаркинсоническое действие самих МОЛ при их длительном в/б введении животным, сопровождающееся модуляцией обмена фосфолипидов, снижением содержания конечных продуктов ПОЛ и увеличением уровня показателя секреции ДА - гомованилиновой кислоты (ГВК) в стриатуме. Свойство МОЛ модулировать обмен фосфолипидов и ДА в стриатуме проявляется не только при ПС, но и в норме.
Показано, что L-DOPA и ДА, инкапсулированные в липосомы, окисляются медленнее, чем их свободные формы и ингибируют ПОЛ в липосомах.
Теоретическая значимость. Полученные результаты углубляют представления об альтернативных путях преодоления ГЭБ для нейромедиаторов и их предшественников. Обнаружение у "пустых" липосом умеренных антииммобилизационных свойств, ан-тиоксидантной активности и способности стимулировать обмен фосфолипидов и ДА в стриатуме представляет интерес для изучения роли обмена липидов в механизмах компенсации дофаминергической передачи при ПС.
Практическая ценность. Обнаруженное антипаркинсоническое действие заключённых в МОЛ L-DOPA и ДА может быть полезно как для дальнейшего совершенствования принципов заместительной липосомо-L-DOPA- или ДА- терапии в эксперименте,
так и для изучения возможностей применения дунного методического подхода к заместительной терапии болезни Паркинсона у человека. Умеренная актипаркинсоническая эффективность самих МОЛ увеличивает терапевтическую ценность липосомальных форм L-DOPA и ДА и позволяет рассматривать "пустые" МОЛ как дополнительное средство в комплексной патогенетической терапии болезни Паркинсона. Положения, выносимые на защиту.
-
В 5% дисперсию МОЛ из яФХ и Хол включается около 12-15% L-DOPA и ДА, которые не нарушая ламеллярной упаковки липидов МОЛ, эффективно удерживаются внутри везикул и более устойчивы к окислению, чем их свободные формы. Инкапсулированные в МОЛ L-DOPA и ДА ингибируют перекисное окисление липидов МОЛ.
-
Малые дозы L-DOPA и ДА, заключённые в МОЛ, при их системном (в/б) введении оказывают выраженное и пролонгированное подавление характерных паркинсо-нических симптомов у мышей C57BL/6, которое коррелирует с частичной компенсацией дефицита уровня ДА и его метаболитов: ГВК и диоксифенилуксуснои кислоты (ДОФУК) и усилением интенсивности обмена ДА в сгриатуме.
-
Липосомы обеспечивают эффективную транспортировку малых количеств L-DOPA и ДА в стриатум и облегчают их проникновение через ГЭБ. Скорость проникновения липосомальной формы катехоламинов в стриатум (на примере их абиогенного аналога - диоксибензиламшіа) в 100 раз превышает таковую для свободной.
-
Липосомальный носитель потенцирует анткпаркинсоническое действие заключённых в него L-DOPA и ДА, оказывая модулирующее влияние на обмен фосфоли-пидов в стриатуме, которое сопровождается снижением уровня конечных продуктов ПОЛ и увеличением концентрации ГВК - показателя секреции ДА. В условиях нормы "пустые" МОЛ не вызывают отклонений в двигательной активности мышей и не провоцируют токсических реакций и гибели животных, но как и при ПС оказывают модулирующее влияние на обмен фосфолипидов и вызывают увеличение ГВК в стриатуме.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на VI-м Российско-СНГ симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 1994), IV-м Всемирном IBRO-конгрессе по нейронаукам (Киото, Япония, 1995), 1-м Европейском конгрессе по фармакологии (Милан, Италия, 1995), Ш-ем международном симпозиуме "Восстановительная неврология" (Иркутск, 1995), IV-ой международной конференции "Liposome Research Days Conference" (Фрайбург, ФРГ, 1995), Ш-м Всероссийском Национальном конгрессе 'Человек и лекарство" (Москва, 1996), VI-м международном EBPS-симпозиуме по поведенческой фармакологии (Кальяри, Италия, 1996), 1-м Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 1996), V-ой международной конференции "Liposome Research Days Conference" (Шизока, Япония, 1996) и Ш-ей между народ-
ной конференции "Liposome Advances: Progress in Drug and Vaccine Delivery" (Лондон, Великобритания, 1996).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования и 5 глав, посвященных изложению результатов экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 167 страницах, содержит 39 рисунков и 14 таблиц. Список литературы включает 245 источников, из которых 51 опубликован в отечественных и 194 в зарубежных изданиях.
