Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 16
1.1. Роль регуляторних пептидов в функциональной деятельности различных систем организма 16
1.2. Регуляторные пептиды центральных органов иммунитета 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 45
2.1. Методы выделения, изучения структуры и синтеза пептидов 45
2.2. Модели иммунодефицита и воспаления 48
2.3. Исследование иммунитета 51
2.4. Методы исследования гемостаза 60
2.5. Изучение пролиферативной активности фибробластов 60
2.6. Статистическая обработка материала 61
Глава 3. Выделение, скрининг биологической активности и синтез регуляторных пептидов 62
3.1. Выделение пептидов из костного мозга, изучение их биологической активности и синтез 62
3.2. Выделение пептидных препаратов из бурсы Фабрициуса и изучение их состава 70
3.3. Влияние пептидных препаратов бурсы Фабрициуса на иммунитет .75
3.4. Фракционирование, скрининг биологической активности, изучение структуры и синтез индивидуальных пептидов бурсы Фабрициуса 80
Глава 4. Изучение активности регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы фабрициуса при иммунодефицитных состояниях различной этиологии 93
4.1. Эмбриональная бурсэктомия 93
4.2. Тимэктомия 101
4.3. Иммунодефицит, вызванный циклофосфамидом 108
Глава 5. Клеточные механизмы действия регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы фабрициуса 113
5.1. Влияние регуляторных пептидов на функциональную активность лимфоцитов 113
5.1.1. Экспрессия дифференцировочных антигенов лимфоцитов .113
5.1.2. Индуцированная интерлейкином-2 экспрессия дифференцировочных антигенов лимфоцитов 119
5.1.3. Экспрессия иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов 124
5.1.4. Экспрессия Е-рецепторов тимоцитов 128
5.1.5. Антителообразование 132
5.2. Специфическое связывание пептидов бурсы Фабрициуса и костного мозга с мембраной лимфоцитов 137
5.3. Влияние регуляторных пептидов на функциональную активность макрофагов 142
5.4. Клеточно-опосредованные механизмы действия регуляторных пептидов на свертывание крови 147
Глава 6. Механизмы действия регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы фабрициуса при воспалении 152
6.1. Влияние регуляторных пептидов на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления 153
6.2. Влияние регуляторных пептидов на продукцию провоспалительных цитокинов 157
6.3. Действие регуляторных пептидов на пролиферативную активность фибробластов 162
Глава 7. Механизмы действия регуляторных пептидов при патологических состояниях, сопровождающихся иммунодефицитом и воспалением 169
7.1. Влияние пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на иммунитет и гемостаз у крыс с термическими ожогами 169
7.2. Изменения состава и активности пептидов вилочковои железы при ожоговой болезни и их коррекция пептидным препаратом эпифиза -эпиталамином 181
7.3. Влияние эпиталамина на показатели иммунитета и содержание белков острой фазы воспаления у больных с ожогами 190
7.4. Влияние пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на иммунитет и гемостаз при экспериментальном перитоните 200
7.5. Действие вилона на показатели иммунитета и содержание провоспалительных цитокинов у больных с разлитым гнойным перитонитом 210
7.6. Состояние гемостаза у больных с разлитым гнойным перитонитом, получавших вилон 216
Глава 8. Обсуждение полученных данных 221
Выводы 257
Практические рекомендации 259
Список литературы 260
Приложения 299
- Роль регуляторних пептидов в функциональной деятельности различных систем организма
- Выделение пептидов из костного мозга, изучение их биологической активности и синтез
- Экспрессия дифференцировочных антигенов лимфоцитов
- Влияние регуляторных пептидов на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления
Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение механизмов поддержания гомеостаза занимает особое место в современной медицине. Достижения в этой области позволяют успешно решать вопросы диагностики, лечения и профилактики многих заболеваний. Регуляция всех физиологических функций организма осуществляется при непосредственном участии центральной нервной системы и гуморальных факторов. Последние включают в себя гормоны, вырабатываемые железами внутренней секреции, а также биологически активные соединения, продуцируемые органами, тканями и клетками. Среди них особое место отводится регуляторным пептидам, способным вмешиваться в реализацию самых различных функций организма [13, 59, 104,119,166,213,264].
Иммунная система занимает первое место по числу известных медиаторов [69, 82, 86, 292]. Значительная дифференциация функций иммунокомпетентных клеток, большое число их субпопуляций, клонов и возможных способов взаимодействия требуют высокоразвитых и селективных механизмов передачи информации, обеспечивающих слаженную работу системы в целом [252, 253]. Основную часть медиаторов иммунной системы составляют вещества пептидной природы. К ним относятся регуляторные пептиды, факторы роста, эмбриональные индукторы, кейлоны и цитокины [79, 247, 255]. В настоящее время в экспериментальной и клинической иммунологии все большую значимость приобретают исследования, направленные на поиск средств избирательного воздействия на отдельные этапы развития иммунного ответа, а также на отдельные популяции клеток иммунной системы [39, 49, 76, 138, 161]. Наиболее перспективный подход к решению данной проблемы - создание иммуномодуляторов на основе эндогенных регуляторных пептидов [79, 97]. Важную роль в качестве продуцентов последних играют центральне органы иммунной системы. Пептидные препараты тимуса и костного мозга, такие как тималин, Т-активин и миелопид, с успехом применяются в клинике для лечения многих заболеваний, сопровождающихся иммунодефицитными состояниями и воспалением [10, 152, 170]. Значительно меньше данных, касающихся пептидных регуляторов бурсы Фабрициуса - центрального органа гуморального иммунитета птиц, аналог которого у человека не известен [204, 325]. До настоящего времени не достаточно изучен вопрос о химической структуре и механизмах действия индивидуальных пептидов, входящих в состав экстрактов, выделенных из центральных иммунных органов. Решение данной проблемы необходимо для разработки и эффективного отбора иммуномодуляторов нового поколения, обладающих направленным действием на отдельные популяции лимфоидных клеток при иммунодефицитных состояниях и воспалении. В связи с этим разработка новых синтетических иммунорегуляторных пептидов и изучение механизмов их действия представляется актуальной теоретической и практической задачей.
Цель и задачи исследования
Целью наших исследований явилось изучение механизмов действия регуляторных пептидов, выделенных из тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса, при иммунодефицитных состояниях и воспалении.
В связи с этим решались следующие задачи:
1. Разработать способы выделения из костного мозга и бурсы Фабрициуса пептидных препаратов, обладающих иммуностимулирующей активностью; произвести скрининг биологической активности, изучить структуру и осуществить синтез индивидуальных пептидов, входящих в их состав.
2. Исследовать влияние регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на иммунитет при иммунодефицитных состояниях различной этиологии (эмбриональная бурсэктомия; тимэктомия; иммунодефицит, вызванный циклофосфамидом).
3. Изучить влияние регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на функциональную активность лимфоцитов и макрофагов.
4. Провести сравнительное исследование влияния иммунорегуляторных пептидов на антителообразование в процессе иммунного ответа.
5. Изучить возможность специфического связывания пептидов бурсы Фабрициуса и костного мозга с мембраной лимфоцитов.
6. Изучить механизмы действия регуляторных пептидов при воспалении.
7. Исследовать клеточно-опосредованные механизмы действия иммунорегуляторных пептидов на свертывание крови.
8. Изучить механизмы действия пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса при патологических состояниях, сопровождающихся иммунодефицитом и воспалением (перитонит, ожоги).
9. Изучить изменения активности эндогенных пептидов тимуса при иммунодефиците, вызванном термической травмой, и возможность коррекции данных нарушений пептидным препаратом эпифиза -эпиталамином.
Научная новизна
Из костного мозга выделен ранее неизвестный пептид, имеющий структурную формулу Ser-Ala-Glu-Glu-Lys-Glu-Ala (SAEEKEA) и получивший название - «гемопептид».
Впервые выделены из бурсы Фабрициуса индивидуальные биологически активные пептиды, установлена их структура и осуществлен химический синтез. Выделенные пептиды названы «бурсопептидами»: БП-1 - Tyr-Glu-Gly (YEG), БП-2 - Trphr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu (WTAEEKQL), БП-3 - Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu (KEELNE) и БП-4 - Glu-Arg-Asp-Pro (ERDP).
Проведена сравнительная оценка биологической активности синтетических аналогов пептидов вилочковой железы, костного мозга и бурсы Фабрициуса при иммунодефицитных состояниях и воспалении.
Установлено, что синтетический аналог пептида тимуса - вилон (Lys-Glu) и бурсопептид-3 оказывают влияние преимущественно на Т-систему иммунитета: увеличивают экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов, потенцируют стимулирующее действие IL-2 на экспрессию маркеров Т-клеток, увеличивают экспрессию Е-рецепторов тимоцитов, восстанавливают иммунный ответ у тимэктомированных животных.
Впервые изучена биологическая активность регуляторного пептида костного мозга - SAEEKEA и бурсопептида-2. Установлено, что гемопептид и бурсопептид-2 обладают широким спектром действия: повышают экспрессию маркеров Т-, В-лимфоцитов и NK-клеток; стимулируют антителопродукцию на пике вторичного иммунного ответа в популяции зрелых антителопродуцентов, увеличивая количество АОК. Регуляторный пептид костного мозга увеличивает стимулирующее действие IL-2 на экспрессию маркеров CD4, CD21 и CD22.
Впервые установлено, что БП-1, БП-2, гемопептид и вилон повышают экспрессию рецепторов к интерлейкину-2 на мембране лимфоцитов.
Впервые обнаружено специфическое связывание БП-2 и гемопептида с мембраной лимфоцитов. Показано, что БП-2 и гемопептид действуют на лимфоидные клетки через одни и те же рецепторные структуры.
Впервые установлено, что бурсопептид-1 (Tyr-Glu-Gly) действует преимущественно на гуморальное звено иммунитета: увеличивает экспрессию дифференцировочных антигенов и иммуноглобулиновых рецепторов В-лимфоцитов, стимулирует антителопродукцию, восстанавливает иммунный ответ при эмбриональной бурсэктомии.
Впервые установлено, что бурсопептид-4 (Glu-Arg-Asp-Pro) и, в меньшей степени, БП-3 стимулируют фагоцитарную активность и кислородзависимый метаболизм макрофагов.
Выявлены клеточно-опосредованные механизмы действия регуляторных пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на свертывание крови. Установлено, что иммунорегуляторные пептиды в присутствии мононуклеаров периферической крови проявляют антикоагулянтное действие.
Установлено, что регуляторные пептиды тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса влияют на течение воспалительной реакции: гемопептид, бурсопептид-2 и бурсопептид-3 снижают явления экссудации за счет уменьшения секреции мононуклеарами провоспалительных цитокинов (IL-ip, IL-8 и TNFa); вилон и бурсопептид-3 стимулируют репаративную фазу воспаления за счет увеличения пролиферативной активности фибробластов.
Показано, что у животных с экспериментальной термической травмой и перитонитом регуляторные пептиды, выделенные из центральных органов иммунитета, стимулируют иммунный ответ как в индуктивную, так и в продуктивную фазы, уменьшают гиперкоагуляцию и активируют фибринолиз.
Установлено, что одним из механизмов ожоговой иммуносупрессии является снижение биологической активности тимических пептидов, относящихся к классу цитомединов. Пептидный препарат эпифиза -эпиталамин восстанавливает состав и активность пептидов тимуса, оказывающих позитивное влияние на дифференцировку и функциональную зрелость Т- и В-лимфоцитов.
Подтверждено, что в организме существует единая клеточно-гуморальная система защиты, включающая иммунитет, неспецифическую резистентность и гемостаз.
Теоретическая и практическая значимость работы
Диссертационное исследование выполнено в соответствии с планом научных работ Читинской государственной медицинской академии.
Научно-практическая значимость полученных данных заключается в создании неизвестных ранее иммунорегуляторных пептидов и расшифровке механизмов их действия. Полученные данные вносят вклад в понимание роли веществ, выделенных из тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса, в регуляции иммунного ответа. Выделенные и синтезированные пептиды являются основой для создания лекарственных препаратов, направленных на восстановление нарушений в системе иммунитета и гемостаза, регулирующих течение воспалительного процесса.
В ходе исследований были разработаны: 1) способ получения вещества, стимулирующего антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов (патент РФ на изобретение № 2155068 от 27.08.2000, приоритет от 27.05.1999); 2) способ получения вещества, обладающего иммуностимулирующей активностью (патент РФ на изобретение № 2177325 от 27.12.2001, приоритет от 19.09.2000); 3) средство, стимулирующее антигеннезависимую дифференцировку В-лимфоцитов (патент РФ на изобретение № 2166956 от 20.05.2001, приоритет от 13.04.2000); 4) средство, обладающее иммуностимулирующей активностью (патент РФ на изобретение № 2177803 от 10.01.2002, приоритет от 30.10.2000); 5) средство, стимулирующее дифференцировку Т-лимфоцитов (патент РФ на изобретение № 2188032 от 27.08.02, приоритет от 07.02.2001); 6) средство, стимулирующее пролиферацию фибробластов (патент РФ на изобретение № 2211046 от 27.08.2003, приоритет от 8.01.2002); 7) способ лечения гнойных ран (заявка на изобретение № 2003116066/14, приоритет от 29.05.2003).
Патогенетически обосновано применение пептидного препарата эпифиза (эпиталамина) в комплексном лечении больных с тяжелыми ожогами с целью направленной коррекции иммунных и эндокринных нарушений. Разработанный нами способ лечения больных с ожоговой болезнью внедрен в областном центре термической травмы г. Читы. Это позволило улучшить результаты и уменьшить сроки лечения больных в стационаре.
Обнаружена высокая клиническая эффективность иммуномодулятора нового поколения - вилона. Способ лечения больных с разлитым гнойным перитонитом с применением вилона внедрен в областной клинической больнице г. Читы.
Материалы диссертационной работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах: патологической физиологии, госпитальной хирургии, травматологии и ортопедии Читинской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту
1. Выделены и синтезированы регуляторные пептиды: из костного мозга - гемопептид (Ser-Ala-Glu-Glu-Lys-Glu-Ala); из бурсы Фабрициуса - бурсопептид-1 (Tyr-Glu-Gly), бурсопептид-2 (Trphr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln- Leu), бурсопептид-3 (Lys-Glu-Glu-Leu-Asn-Glu) и бурсопептид-4 (Glu-Arg- Asp-Pro). Обнаружено специфическое связывание бурсопептида-2 и гемопептида с мембраной лимфоцитов.
2. При иммунодефицитных состояниях регуляторные пептиды обладают различным спектром иммунотропной активности. Вилон (Lys- Glu) и бурсопептид-3 оказывают преимущественное влияние на Т-систему иммунитета. Бурсопептид-1 стимулирует гуморальное звено иммунной системы. Гемопептид и бурсопептид-2 обладают широким диапазоном действия, повышая функциональную активность Т-, В-лимфоцитов и NK клеток. Бурсопептид-4 оказывает стимулирующее действие на клетки моноцитарно-макрофагальной системы.
3. Регуляторные пептиды центральных органов иммунитета оказывают влияние на течение воспалительного процесса. Гемопептид, бурсопептид-2 и бурсопептид-3 снижают явления экссудации за счет уменьшения секреции мононуклеарами провоспалительных цитокинов. Вилон и бурсопептид-3 стимулируют репаративную фазу воспаления, увеличивая пролиферативную активность фибробластов.
4. При патологических состояниях, сопровождающихся вторичным иммунодефицитом и воспалением, иммунорегуляторные пептиды уменьшают гиперкоагуляцию и активируют фибринолиз.
Апробация основных положений работы
Материалы исследований были представлены на IV Всесоюзном съезде патофизиологов (Москва, 1989); Международной научно-практической конференции «Поиск новых лекарственных средств и их использование в клинике» (Чита, 1990); I Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы лимфологии» (Волгоград, 1991); VII Всесоюзной конференции «Физиология и патология перекисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза» (Полтава, 1991); Международной конференции «Экологическая патология и ее фармакокоррекция» (Чита, 1991); Всесоюзной конференции «Физиология и патология гемостаза» (Полтава, 1991); Международной конференции «Интенсивное лечение тяжелообожженных» (Москва, 1992); на III Всероссийском съезде гематологов и трансфузиологов (Москва, 1996); на VI съезде травматологов и ортопедов России (Нижний Новгород, 1997);
Всероссийской конференции «Экологозависимая патология (клиника, биохимия, фармакология)» (Чита, 1999); научно-практической конференции «Актуальные вопросы прикладной медицины» (Чита, 2000, 2001); научно-практической конференции «Актуальные вопросы иммунореабилитации больных» (Тюмень, 2000); VI Международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация» (Эйлат, Израиль, 2000); VIII Российско-японском международном медицинском симпозиуме «Амур 2000» (Благовещенск, 2000); III Съезде иммунологов и аллергологов СНГ (Сочи, 2000); VII Международном конгрессе «Реабилитация в медицине и иммунореабилитация» (Нью-Йорк, США, 2001); а также на заседаниях Читинского отделения общества патофизиологов (2002, 2003).
По теме диссертации опубликованы 55 печатных работ, в том числе монография "Пептидные регуляторы гуморального иммунитета", в которых нашли отражение основные результаты исследования. Получено 6 патентов на изобретения.
Объем и структура работы
Диссертация изложена на 298 страницах машинописного текста, иллюстрирована 59 таблицами и 19 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных данных, выводов и списка литературы, включающего 257 отечественных и 152 иностранных источников.
Роль регуляторних пептидов в функциональной деятельности различных систем организма
Последние годы характеризуются ростом числа работ, посвященных исследованию эндогенных биорегуляторов, значительная часть которых представлена пептидами небольшой молекулярной массы, отличающимися разнообразием происхождения и характером биологических эффектов [13, 213, 219, 341]. Пептиды контролируют многие системы организма, выполняющие жизненно важные функции. Известны пептиды, регулирующие кровообращение [58, 120, 167], кроветворение [17, 150], деятельность желудочно-кишечного тракта [180, 209], центральной нервной системы [23, 57, 63, 66, 264, 343, 344], систем иммунитета [27, 28, 125, 136, 200, 207], гемостаза [14, 40, 132, 237]. Регуляторные пептиды представляют собой гормоны, нейрогормоны, нейромодуляторы, иммуномодуляторы, рилизинг-факторы, монокины, факторы роста [213]. Регуляторные пептиды, подобно классическим медиаторам, имеют сродство к специфическим рецепторам и передают через них заложенную информацию. Активный центр пептидов образуют, независимо от величины молекулы лиганда, в среднем 6-8 аминокислотных остатков, структура которых более или менее жестко фиксирована в виде квазицикла, р-изгиба или петли, и по профилю соответствует форме "кармана" рецептивной молекулы [162, 238].
Общепринятым является разделение регуляторных пептидов на два класса - секреторные пептиды или гормоны, образующиеся в какой либо из желез внутренней секреции, и несекреторные, "вырезанные" с помощью пептидаз различного типа в кровеносном русле или тканях из пептидно-белковых предшественников [219, 340, 342]. Пептиды, образуемые при функционировании белковых молекул, возможна, необходимы для поддержания отрицательной обратной связи с клетками, синтезирующими данные белки-предшественники, а также для выполнения роли межсистемных регуляторов [79, 80].
Регуляторные пептиды относятся к древнейшим элементам системы поддержания межклеточных взаимодействий и широко представлены в системах высших позвоночных. Среди них АКТГ, вазопрессин, окситоцин, опиоидные пептиды, субстанция Р. Из колонии E.coli выделены пептидные регуляторы, подобные инсулину, нейротензину, соматостатину [57]. Не исключено, что эти вещества, всасываясь из кишечника в кровь, несут информацию, обеспечивающую существование E.coli. У примитивных хордовых, появившихся на эволюционной лестнице более 600 млн. лет назад, в мозговой ткани представлено более десятка пептидов, идентичных нейропептидам мозга человека [23]. Целый ряд гастроинтестинальных пептидов обнаружен в ЦНС высших млекопитающих и в коже некоторых амфибий. Их строение идентично или очень близко к нейропептидам животных [57].
Основные пути эволюции регуляторных пептидов шли в направлении совершенствования их первичной структуры, рецепторов к ним, а также инактивирующих ферментных систем, обеспечивающих контроль за биологической активностью пептидов [219]. Генетические потенции клетки представляют возможность синтеза любых блокированных в онтогенезе генов, кодирующих регуляторные пептиды или рецепторы к ним. Поэтому, на всех ступенях филогенеза остаются эволюционно древние регуляторные пептиды, которые приобретают потенциально новые сферы действия соответственно изменениям в топографии рецепторов и мест синтеза регуляторов [13].
На основании имеющихся данных о природе и функциях пептидных регуляторов, некоторые авторы относят их к аутокоидам - веществам, осуществляющим регуляцию непосредственно там, где они вырабатываются, или к кибернинам - веществам, осуществляющим регуляцию функций поблизости от места образования [12, 90]. Сегодня сформировалось представление о существовании в организме функционально-непрерывной совокупности регуляторных пептидов, способных обеспечить стимуляцию или подавление любых проявлений жизнедеятельности [13, 219]. Многие авторы считают, что короткие пептиды, полученные из высокомолекулярных соединений, - это новый путь регуляции и координирования физиологических функций и состояния организма. Можно предположить, что в будущем начнется широкое применение лекарственных веществ пептидной природы [42,80,119, 123].
Вопрос о биологической полифункциональности пептидов довольно сложен и мог бы явиться темой специального обзора, точно также, как и вопросы их биосинтеза, деградации, эволюции. Однако, не претендуя на обобщение темы регуляторных пептидов в целом, мы сосредоточили внимание лишь на одной группе, играющей важную роль в межклеточной регуляции - пептидах выделенных из разных органов и тканей, и получивших название - цитомедины.
По мнению В.Г.Морозова, В.Х. Хавинсона (2001), соединения этого класса переносят биологическую информацию между клетками различных популяций и поэтому, получили свое название от слов «cytos» - клетка и «medio» - посредник. Цитомедины представляют собой функционально непрерывную совокупность регуляторных пептидов малой молекулярной массы, обеспечивающих согласованную деятельность клеточных популяций организма [119, 154,218].
Выделение пептидов из костного мозга, изучение их биологической активности и синтез
Костный мозг играет важную роль в иммуно- и гемопоэзе, продуцируя стволовые клетки, которые дают начало всем росткам кроветворения, включая лимфопоэз. В костном мозге образуются пре-Т- и пре-В-лимфоциты, дальнейшее созревание которых обеспечивает становление Т- и В-систем иммунитета млекопитающих. Несмотря на многочисленные усилия, до1 сих пор не удалось обнаружить у млекопитающих центрального органа гуморального иммунитета (эквивалента бурсы Фабрициуса птиц). В эмбриональной фазе предшественники лимфоцитов обнаруживаются в печени [297, 234], а позднее в костном мозге [350], в кишечнике и селезенке [319]. Некоторые исследователи считают, что роль сумки Фабрициуса у млекопитающих и человека выполняют пейеровы бляшки тонкого кишечника, миндалины, аппендикс [295, 314, 347]. Однако большинство ученых придерживаются точки зрения, что у млекопитающих и человека вообще отсутствует аналог бурсы птиц, а В-лимфоциты развиваются из стволовой клетки непосредственно в костном мозге [184, 273, 346, 349, 382, 364]. Стволовая клетка может дифференцироваться в сторону общего предшественника лимфоцитов, который может дать начало предшественникам В-, Т-лимфоцитов, а также естественных киллеров. Один из продуктов стромальных клеток костного мозга - интерлейкин-7 преимущественно стимулирует процесс созревания В-лимфоцитов из костно-мозговых предшественников. Созреванию В-лимфоцитов способствуют также интерлейкины 3, 4, 6, а ингибирует их созревание трансформирующий ростовый фактор - TGFp\ Незрелые В-лимфоциты имеют поверхностные IgD и FcR, несут маркер CD 10 и рецепторы для цитокинов (IL-3R и IL-7R). По мере пролиферации и дифференцировки В-лимфоциты приобретают поверхностные антигены гистосовместимости 2-го класса, рецепторы для комплемента и поверхностные IgM. Созревание В-лимфоцитов, в отличие от Т-лимфоцитов, завершается в костном мозге и в кровь выходят малые лимфоциты, несущие на своей мембране все структуры, необходимые для участия в специфическом иммунном ответе [215]. В последние годы появились сообщения об участии регуляторных пептидов костного мозга в дифференцировке и регуляции функциональной активности не только В-, но и Т-лимфоцитов [170]. Учитывая сказанное, мы решили сосредоточить свои усилия на поиске биологически активных пептидов костного мозга, принимающих участие в дифференцировке иммунокомпетентных клеток, и более детальном изучении их биологической активности.
Пептиды из костного мозга свиньи выделяли по методике, разработанной в нашей лаборатории. Способ получения пептидов костного мозга включал: трехкратную заморозку сырья при температуре -40С, гомогенизацию, экстракцию 1н уксусной кислотой в течение 30-60 минут в присутствии ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфторида в концентрации ОД мМ, фильтрацию, осаждение ацетоном при температуре -5(-8) С в течение 6-12 часов, растворение препарата и лиофилизацию. Полученный препарат состоит из комплекса пептидов с различной молекулярной массой и биологическими свойствами.
Выделение индивидуальных пептидов из экстракта костного мозга осуществляли по принципу "от функции к структуре", т.е. путем направленного получения только иммунологически активных фракций и изучения их структуры. Фракционирование пептидов костного мозга проводили поэтапно. Сначала осуществляли гель-фильтрационное разделение комплекса пептидов. Вторым этапом являлась ОФ-ВЭЖХ. Если по данным масс-спектрометрии ВЭЖХ-фракций, а также на основе анализа спектра УФ-поглощения, выявлялась неоднородность фракции, то она подвергалась повторной хроматографии необходимое число раз до полной гомогенности. На каждом этапе полученные фракции тестировались на наличие иммуностимулирующей активности, о присутствии которой судили по степени восстановления экспрессии кластеров дифференцировки иммунодефектных лимфоцитов. Дальнейшая работа велась только с наиболее активными фракциями. Завершающим этапом явилось секвенирование и синтез индивидуальных пептидов.
В результате гель-фильтрационного разделения экстракта костного моза на поливиниловом геле Tyoperal HW40 было получено 10 фракций (рис. 3.1.1). При скрининг-тестировании установлено, что максимальной способностью стимулировать экспресссию маркеров Т- и В-лимфоцитов обладает 8-й пик (табл. 3.1.1). Данная фракция была подвергнута дальнейшему разделению методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac 218 ТР54 5 мкр С18 (4,6 х 250 мм). Было получено 47 фракций (рис.3.1.2). Для оптимизации тестирования полученные фракции были разделены на группы. Группа А объединяла фракции, выходящие с 10 по 20 минуту включительно; группа В - фракции, выходящие с 20 по 30 минуту; группа С - фракции, выходящие с 30 по 40 минуту; группа D - с 40 по 50 минуту. В дальнейшем фракции каждой группы были пулированы и изучена их биологическая активность (табл. 3.1.2).
Полученные фракции подвергали скрининг-тестированию на наличие иммуностимулирующей активности, о присутствии которой судили по степени восстановления экспрессии молекулы CD3 (маркер Т-лимфоцитов) и CD22 (маркер В-лимфоцитов) на поверхности лимфоцитов больных с ожогами. Известно, что лимфоциты несут на своей мембране маркеры CD, способные выполнять функцию рецепторов, сигнальных или адгезивных молекул. Способность веществ усиливать или ослаблять экспрессию кластеров дифференцировки иммуноцитов и, тем самым, модулировать их функцию отражает иммунотропную активность препаратов. Для тестирования биологической активности полученные фракции вносили в культуру лимфоцитов больных с ожогами в концентрации 0,05 мкг/мл культуральной среды.
Экспрессия дифференцировочных антигенов лимфоцитов
Известно, что лимфоциты несут на своей мембране маркеры, способные выполнять функцию рецепторов, сигнальных или адгезивных молекул и получившие наименование CD (от англ. cluster differentiation). На различных стадиях дифференцировки лимфоцитов экспрессируется определенный набор кластеров, что определяет функциональную активность клеток [214, 289, 301, 365]. Способность веществ усиливать или ослаблять экспрессию кластеров дифференцировки иммуноцитов и, тем самым, модулировать их функцию, отражает иммунотропную активность препаратов [2, 135,171,173, 231].
В предыдущих экспериментах нами было установлено, что после 2-х часовой инкубации лимфоцитов здоровых доноров с исследуемыми пептидами, лишь под влиянием бурсопептида-1 происходит увеличение экспрессии маркеров CD21 и CD22 на 24,3 и 36,6% соответственно, а также под действием бурсопептида-2 на 7,3% возрастает экспрессия антигенов CD3 и на 22,4% молекул CD38. В остальных случаях никаких достоверных изменений не происходит.
Полученные результаты могут быть объяснены, с нашей точки зрения, тем, что на мембране лимфоцитов здоровых людей имеет место максимальная экспрессия изучаемых кластеров дифференцировки, поэтому под действием иммунотропных пептидов не может быть зарегистрировано значительного усиления их экспрессии. В этой связи представляется более интересным изучить действие пептидов, выделенных из центральных органов иммуногенеза, на иммунодефектные лимфоциты с исходно низким уровнем экспрессии дифференцировочных антигенов.
При ожоговой болезни, как и при ряде других иммунодефицитных состояний, наблюдается не только угнетение лимфопоэза, но и изменение мембраны лимфоидных клеток, в том числе и CD молекул, что обусловлено репрессией кластеров дифференцировки [29, 75, 111]. Очевидно, что при этом лимфоциты имеют высокий потенциал к экспрессии маркеров CD, которая может проявиться под действием иммуностимуляторов.
Учитывая это, мы изучали влияние синтетических аналогов пептидов тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса на кластеры дифференцировки лимфоцитов в 2-х часовой культуре клеток, полученных от 16-и больных с ожоговой болезнью (ожоги Шб-IV степени 15-30% поверхности тела). Лимфоциты выделяли на градиенте плотности фиколл-верографин (р= 1,077 г/см3). Интерфазное кольцо, содержащее лимфоциты, забирали пастеровской пипеткой. Полученную клеточную взвесь трижды отмывали средой 199 и использовали в концентрации 2,5 млн. клеток/мл. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 в плоскодонных планшетах в объеме 0,2 мл при 37С, в атмосфере 5% С02 и влажности 80-90%. В культуральную среду добавляли 10% фетальной сыворотки теленка, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола, 2 мМ глутамина, 10 мМ Hepes-буфера и 50 мкг/мл гентамицина. В опыте в культуру лимфоцитов вносили изучаемые пептиды в концентрации 5 пмоль/мл. В качестве контроля использовали физиологический раствор в соответствующем объеме. Экспрессию дифференцировочных антигенов определяли методом непрямой мембранной иммунофлюоресценции.
Установлено, что при ожоговой травме резко снижается количество лимфоцитов, несущих на своей поверхности все изучаемые кластеры дифференцировки, особенно антигены CD3 и CD4 (табл. 5.1.1; 5.1.2). Инкубация же лимфоцитов с пептидами тимуса, костного мозга и бурсы Фабрициуса сопровождается увеличением числа таких клеток. Однако изучаемые регуляторные пептиды оказывают неодинаковое действие на экспрессию дифференцировочных маркеров. Бурсопептид-1 влияет преимущественно на В-лимфоциты, усиливая экспрессию кластеров CD 19 на 59,2%, CD21 на 67,8%, CD22 на 69,1%, CD23 на 77%, CD38 на 119,3%, CD72 на 79,3%, а также незначительно CD25 по сравнению с лимфоцитами больных с ожогами. В противоположность этому, бурсопептид-3 стимулирует экспрессию маркеров Т-лимфоцитов, увеличивая число клеток, несущих маркер CD2 на 26,1%, CD3 на 30,9%, CD4 на 120,2%. Бурсопептид-2 обладает широким спектром действия, стимулируя экспрессию маркеров Т-, В-лимфоцитов и NK клеток. Так, под действием БП-2 увеличивается экспрессия CD2 на 36,7%, CD3 на 49,3%, CD4 на 151,8%, CD 16 на 31,2%, CD25 на 156,9%, CD21 на 82,7%, CD22 на 42,2% и CD23 на 95,9% (табл. 5.1.1; 5.1.2).
Синтетический аналог пептида тимуса - вилон стимулирует экспрессию дифференцировочных антигенов Т-лимфоцитов (CD2, CD3, CD4), а также CD25 (табл. 5.1.1). Необходимо отметить, что вилон, по сравнению с пептидами бурсы Фабрициуса, проявляет максимальную активность в отношении Т-клеток. Сходным действием, но выраженным в меньшей степени обладает БП-3. Этот факт подтверждает то, что в бурсе Фабрициуса происходит дифференцировка некоторых субпопуляций Т-лимфоцитов. Об этом также свидетельствует обнаружение до 4-6% Т-лимфоцитов в бурсе Фабрициуса [381, 399]. Нами зарегистрировано незначительное достоверное усиление экспрессии антигена CD38 под действием вилона. На другие дифференцировочные антигены В-лимфоцитов вилон не оказывает действия.
Гемопептид стимулирует экспрессию маркеров В-, и в меньшей степени, Т-лимфоцитов. Так, под действием гемопептида зарегистрировано усиление экспрессии CD21 на 41,2%, CD22 - на 36,5%, CD38 - на 53,4%, CD72 - на 35,4% . Также, под влиянием гемопептида на 44,5%) возрастает экспрессия CD4 и на 34% - CD 16 (маркера NK-клеток). В отличие от бурсопептида-2, имеющего сходное строение, гемопептид не оказывает достоверного влияния на экспрессию маркеров CD2 и CD3 (табл. 5.1.1; 5.1.2).
Влияние регуляторных пептидов на экссудативную и пролиферативную фазы воспаления
Известно, что центральные органы иммунной системы: тимус, костный мозг и бурса Фабрициуса посредством продуцируемых ими гуморальных факторов стимулируют не только на процессы лимфопоэза, но и влияют на интенсивность иммунного ответа. Кроме того, ряд иммунотропных лекарственных средств способны стимулировать антителопродукцию. Учитывая это, мы решили изучить действие пептидов вилочковой железы, костного мозга и бурсы Фабрициуса на антителогенез. В данной серии экспериментов мы исследовали изменение количества антителообразующих клеток в лимфатических узлах, поскольку последние являются местом встречи антигенов с иммунокомпетентными клетками, распознавания антигена и синтеза иммуноглобулинов. Первичные фолликулы лимфатического узла содержат зрелые, покоящиеся В-лимфоциты. Зародышевые центры формируются в процессе специфического ответа на антиген и содержат В-лимфоциты с признаками активации. Активированная В-клетка дифференцируется вначале до стадии бласта, увеличиваясь в размерах в 2 раза и приобретая способность к быстрому делению. Этим объясняется клональная экспансия В-лимфоцитов в ответ на антигенный стимул. В зародышевых центрах фоллликулов В-лимфоциты проходят антиген-зависимую пролиферацию и дифференцируются в антителопродуцирующие плазматические клетки, формируются В-клетки памяти. Плазматические клетки крупных размеров секретируют иммуноглобулины, но отличаются сниженной экспрессией поверхностных маркеров. В мозговом слое встречаются как Т-лимфоциты, так и В-лимфоциты, имеется множество макрофагов и дендритных клеток. При развитии специфического иммунного ответа в мозговом слое лимфоузла скапливаются образовавшиеся из В-лимфоцитов плазматические клетки, продуцирующие и секретирующие антитела -иммуноглобулины разных классов. Переключение В-лимфоцитов на синтез другого изотипа иммуноглобулинов в процессе иммунного ответа контролируется цитокинами: IL-4, гамма-интерфероном (IFNy), трансформирующим ростовым фактором (TGF(3), которые продуцируются Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами [215,253].
Крыс иммунизировали введением подкожно в подушечки передних и задних конечностей 0,1 мл 5% суспензией ЭБ. Через 2 недели проводили повторную иммунизацию тем же антигеном и в той же дозе. На пике вторичного иммунного ответа (4-е сутки после повторной иммунизации) крыс забивали, клетки подколенных и паховых лимфатических узлов в концентрации 2x106 клеток/мл инкубировали с изучаемыми пептидами в течение 12-14-и часов при 37С в полной питательной среде. Пептиды использовали в диапазоне концентраций 5x10"4 - 5x102 пмоль/мл. В контрольную культуру лимфоидных клеток вносили соответствующее количество физиологического раствора. По окончании инкубации в каждой культуре определяли количество антителообразующих клеток.
Нами установлено, что гемопептид увеличивает количество антителообразующих клеток в культуре лимфоцитов, выделенных из лимфатических узлов иммунизированных крыс на пике вторичного иммунного ответа. Данный эффект гемопептида зарегистрирован в концентрации от 0,05 до 50 пмоль/мл.
БП-1 и БП-2 обладают дозозависимым свойством стимуляции антителообразования in vitro в популяции зрелых антителопродуцентов. Максимальный антителостимулирующий эффект БП-1 наблюдается в концентрациях 0,5-50 пмоль/мл и достигает 147%, а БП-2 - в концентрациях 0,05-0,5 пмоль/мл, достигая 175%. Вилон и БП-3 не оказывают влияния на уровень антителообразования в данной экспериментальной модели в диапазоне использованных концентраций (табл. 5.1.7; рис. 5.1.3).
В данной экспериментальной модели вилон оказался неэффективен. Вероятно, пептидный препарат тимуса не оказывает действие на продуктивную фазу иммунного ответа, в частности не влияет на популяцию зрелых антителопродуцентов. Между тем, в экспериментах, проведенных in vivo нами отмечено усиление иммунного ответа на Т-зависимый антиген, что вероятно обусловлено действием вилона на более ранние этапы иммунного ответа.
Таким образом, одним из иммунорегуляторных свойств пептидов костного мозга и бурсы Фабрициуса является их способность увеличивать число АОК на пике иммунного ответа. Наблюдаемый эффект, по-видимому, связан с тем, что в продуктивную фазу иммунного ответа в популяции зрелых антителопродуцентов присутствуют резервные или «молчащие» клетки, которые и включаются в работу.
![Состояние системы провоспалительных цитокинов и неспецифических маркеров воспаления у больных ХОБЛ и динамика их на фоне лечения бронхолитическими средствами [Электронный ресурс]](/i/i/4397/201981.png "Состояние системы провоспалительных цитокинов и неспецифических маркеров воспаления у больных ХОБЛ и динамика их на фоне лечения бронхолитическими средствами [Электронный ресурс] Воронкова Ольга Олеговна")