Содержание к диссертации
Стр.
Введение 5
Обзор литературы 13
Глава .1. Роль свободнорадикальных процессов в организме 13
1.1. Активные формы кислорода 13
1. 2. Источники активных форм кислорода в организме 17
Роль свободнорадикального окисления в клетке 23
Роль активных форм кислорода в редокс-сигнализации 27
Глава 2. Современные представления о стратегии защиты клеток от неблагопри
ятных факторов 33
Роль гипоксией индуцируемого фактора - HIF-1 в синтезе защитных систем в клетке 34
Система антиоксидантной защиты клетки 40
Гем-оксигеназа: функция, регуляция, биологическая роль 49
Глава 3. Современные представления о механизмах адаптации к различным фак
торам среды 70
3.1. Адаптация к интервальной нормобарической гипоксии 72
Глава 4. Материалы и методы исследования 78
4.1. Биохимические методы исследования 78
4.1.1. Подготовительные процедуры 78
4.2. Основные биохимические методы 79
Индукция свободнорадикального окисления in vitro и определение свободнорадикальных продуктов по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) 79
Определение скорости транспорта Са в саркоплазматический ретикулум (СР) миокарда 80
Метод Western-блот анализа 83
Определение активности ферментов антиоксидантной защиты 84
Определение концентрации белка 85
4.3. Физиологические модели 86
4.3.1. Острая нормобарическая гипоксия 86
Острое стрессорное воздействие 87
Модель ишемического и реперфузионного повреждения миокарда 88
Кратковременная остановка системного кровообращения и последующая реани- 88 мация
Адаптация к гипербарической оксигенации и нормобарическая
гипероксическая тренировка 89
4.3.6. Адаптация к пормобарической гипоксии (ИНГТ), а также к периодам гипоксии и
умеренной гипероксии 89
Результаты исследований и их обсуждение 91
Глава 5. Механизмы повреждения мембранных структур при острых воздействи
ях. Динамика и тканеенснифичность развития ответа 91
5.1. Тканеспецифические особенности включения компонентов клеточной редокс-
сигпализации - HIF-la, НОх-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты в дина- 91
мике после острой гипоксии
Влияние острой гипоксии на динамику уровня фактора транскрипции - HIF-la в разных органах крыс 92
Влияние острой гипоксии на уровень экспрессии НОх-1 и HSP70 в разных органах крыс 93
Влияние острой гипоксии на активность ферментов антиоксидантной защиты в разных органах крыс 97
Роль компонентов клеточной защиты в формировании резистентности мембранных структур разных органов в динамике после острой гипоксии j qq
5.1.5. Влияние острой гипоксии на резистентность Са-транспортирующей системы
саркоплазматического ретикулума (СР) миокарда к действию эндогенных повреждаю
щих факторов , ,4-2
5.2. Клеточные механизмы устойчивости сердца к стрессорным воздействиям у
крыс Вистар и Август jQy
Уровень защитных систем в миокарде у крыс Вистар и Август при стрессе 110
Устойчивость к свободнорадикалыюму окислению, действию протеаз и высокого уровня Са2+ мембранных структур миокарда крыс Вистар и Август при стрессор-
ных воздействиях ,«.,
5.2.3. Влияние иммобилизационного стресса на резистентность клеточных структур
миокарда крыс Вистар и Август в изолированных сердцах 118
Антиоксидантная защита и чувствительность миокарда к свободнорадикаль-ному окислению у крыс Вистар и Август при ишемии и рспсрфузии } 23
Уровень защитных белков и резистентность мембранных структур Разных органов при реанимации после временной остановки системного кровообращения у крыс с генетически детерминированным разным типом поведения ,^д
Глава 6. Изменение соотношения про- и антиоксидантных факторов в клетке с
помощью экзогенных добавок: ткансснсцифичность и эффективность 150
6.1. Перфторан и проксанол как модуляторы антиоксидантного статуса организ
ма 150
6.2. Влияние кратковременного и длительного применения СОД на соотношение про-
и антиоксидантных факторов в коже 155
Глава 7. Адаптационная защита организма от повреждающих воздействий 162
Периодическая гипероксическая гипербарическая и нормобарическая тренировка: тканеспецифичность действия j 53
Адаптация к периодам пониженного и относительно повышенного уровня кислорода от нормоксического 178
7.2.1. Тканеспецифичность влияния кратковременной интервальной нормобарической
гипоксической тренировки на уровень про- и антиоксидантных систем в сердце, мозге
и печени | -уд
7.2.2. Сравнение эффективности достижения адаптационного защитного эффекта на
мембранные структуры различных органов крыс при нормобарической гипоксической
тренировке в разных режимах , «д
Заключение 191
Выоды 199
Список литературы 202
Введение к работе
Актуальность исследования. Гипоксические и ишемические повреждения являются основой или сопутствующими факторами патогенеза многих заболеваний. Поэтому изучение механизмов этих повреждений на всех уровнях организма и разработка методов их профилактики и коррекции составляют важнейшую проблему медицины.
Одним из ключевых механизмов повреждения клеток при ишемии, стрессе, гипоксии и реоксигенации является чрезмерная активация свободнорадикального окисления, обусловленная повышенным уровнем образования активных форм кислорода (АФК). Однако известно, что повышение уровня АФК вызывает не только повреждение мембранных структур клеток, но и является стимулом для индукции защитных систем организма [Nanji А.А. et al., 1995; Suzuki Y.J. et al., 1997; Сазон-това Т.Г., 1998; Maulik N. et al., 1999; Kietzmann T. et al., 2000].
Из работ последних лет стало очевидным, что АФК играют важную роль на начальных этапах внутриклеточной сигнализации, которая является многокомпонентной системой передачи сигнала к клеточному ядру, и получила название ре-докс-сигнализации по начальному звену, чувствительному к изменению уровня свободнорадикального окисления [Semenza G.L., 1999; Chandel N.S., Schumacker Р.Т., 2000; Скулачев В.П., 2001]. Одним из важных следствий инициации редокс-сигнализации и АФК-опосредованной передачи сигнала является активация ядерных факторов транскрипции, принимающих непосредственное участие в активации генов, кодирующих различные защитные системы - антиоксидантную систему клеток, простагландины, а также систему белков срочного ответа, которые могут синтезироваться при гипоксии и реоксигенации, гипероксии, действии окислителей [Graven К.К. et al., 1993; Omar R., Pappolla M., 1993; Nanji A.A. et al., 1995; Nilanjana M. et al., 1999; Peng J. et al., 2000]. В настоящее время наибольшее значение придают следующим факторам транскрипции - NF-kB, АР-1, HIF (индуцированный гипоксией фактор). HIF-1 играет важную роль при развитии гипоксиче-ских состояний, поскольку через активацию генома приводит к увеличенному синтезу различных защитных белков.
Среди белков срочного ответа, которые синтезируются при гипоксии, особое внимание исследователей привлекает гем-оксигеназа, изменение экспрессии которой коррелирует с содержанием кислорода в тканях. Транскрипция гена гем-оксигеназы регулируется уровнем свободнорадикалыюго окисления [Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000] и индуцируется различными прооксидантными факторами [Clark J.E. et al., 2000; Ryter S.W., Tyrrell R.M., 2000; Hanselmann С et al., 2001]. Несмотря на то, что эти процессы имеют особое значение при гипоксических состояниях, данные о роли индукции факторов транскрипции и синтеза защитных белков, в том числе и гем-оксигеназы, при гипоксии разрозненны, а, кроме того, эти эксперименты проведены в основном на культуре клеток [Kuroki М. et al., 1998; Maines M.D., 2000; Motterlini R. et al., 2000].
В настоящее время накоплены многочисленные данные относительно роли АФК-индуцированных процессов в патогенезе гипоксических состояний. С другой стороны, помимо развития повреждений при гипоксических состояниях АФК участвуют в генерации редокс-зависимого ответа. Однако, мало изучен компонентный состав редокс-сигнальной системы, последовательность включения ее звеньев при физиологических условиях и переход физиологического сигнала в патологический. Таким образом, актуальным является разработка новых способов эффективной коррекции гипоксических состояний организма на основе комплексного изучения механизмов индукции защитных систем клетки и их участия в регуляции свободнорадикального окисления.
Важным аспектом этой проблемы является изучение активации компонентов редокс-сигнальной системы при гипоксических состояниях с учетом гено- и фенотипических особенностей животных. В связи с этим большое значение представляют исследования высоко- и низкоустойчивых организмов при острых и адаптационных гипоксических и стрессорных воздействиях. Показано, что у высокоустойчивых животных при острой гипоксической нагрузке нарушения сократительной функции сердца развиваются позже и выражены слабее, чем у низкоустойчивых. Вместе с тем, при длительной адаптации к гипоксии у низкоустойчивых животных резистентность к действию повреждающих факторов увеличивается, а у высокоустойчивых не меняется или даже уменьшается [Лукьянова Л.Д., 1997; 2004; Хачатурьян М.Л. и др., 1996; Пшенникова М.Г., 2003]. Однако, особенности
7 активации компонентов редокс-сигнализации на острое и адаптационное гипокси-ческое воздействие у таких животных практически не изучены.
В последние годы на основе многочисленных работ по оценке соотношения про- и антиоксидантов в клетке при острых и адаптационных воздействиях была сформулирована концепция о роли АФК в механизмах повышения резистентности организма при периодическом действии различных факторов [Сазонтова Т.Г., 1998; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997]. К ним относятся гипобарическая и нормоба-рическая гипоксия [Архипенко Ю.В. и др., 1992; Меерсон Ф.З. и др., 1992; Nakani-chi К. et al., 1995; Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], адаптация к стрессу [Сазонтова Т.Г. и др., 1987], физической нагрузке [Сазонтова Т.Г. и др., 1996; Powers S.K. et al., 1994], холоду [Шустанова Т.А. и др., 2004; Spasic М.В. et al., 1993]. Кроме того, появились данные о сходстве механизмов защитного действия не только адаптации к периодической гипоксии, но и использования гипероксии в адаптационном режиме [Киселев CO., Лобов М.А., 2002; Леонов А.Н., 2002]. Однако, до настоящего времени не проводилось сравнение молекулярных механизмов формирования защитных эффектов различных видов адаптации, связанных с периодическим изменением концентрации кислорода как ниже, так и выше нормоксического уровня.
На примере действия факторов различной природы показано, что формирование устойчивой адаптационной защиты требует длительного времени (3-5 недель). В связи с этим существует необходимость снижения сроков достижения стадии долговременной адаптации при сохранении ее эффективности на уровне разных органов. Это, по-видимому, может быть решено за счет увеличения интенсивности адаптационного сигнала, что в соответствии с концепцией о редокс-сигнализации должно быть связано с более интенсивной продукцией АФК. Увеличение интенсивности этого сигнала за счет большего снижения уровня кислорода в периоды действия гипоксии не принесли желаемого результата из-за появления отрицательных побочных эффектов. Так, повышение интенсивности как гипоба-рической гипоксии (увеличение «высоты» до 5000 и 6000 м в условиях барокамеры) [Arkhipenko Yu.V. et al., 1997], так и интервальной нормобарической гипокси-ческой тренировки (увеличение длительности каждого цикла) [Sazontova T.G. et al., 1994] приводило к снижению резистентности мембранных структур сердца и
8 печени. Поэтому, в настоящее время актуальной задачей является разработка новых способов адаптации организма к гипоксии, повышающих интенсивность адаптационного сигнала без углубления гипоксической компоненты.
Цель исследования: на основе комплексного изучения механизмов индукции компонентов клеточной редокс-сигнализации в разных органах повысить эффективность коррекции гипоксических состояний организма.
Задачи исследования:
Исследовать тканеспецифические особенности включения компонентов клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70, ферментов антиоксидантной защиты при острых воздействиях - гипоксии, остром стрессе, ишемии и реперфузии.
Оценить уровень компонентов клеточной защиты в формировании резистентности мембранных структур сердца, печени, мозга и легких к действию повреждающих факторов в динамике после острой гипоксии.
Изучить влияние острой гипоксии и адаптации к изменению уровня кислорода на устойчивость Са-насоса саркоплазматического ретикулума (СР) миокарда к повреждающему действию эндогенных факторов - активации свободно-радикального окисления, автолитическому повреждению и высокому уровню Са2+.
Выявить отличия в уровне компонентов клеточной защиты и резистентности мембранных структур миокарда у крыс с генетически детерминированной различной устойчивостью к стрессорным и ишемическим повреждениям.
Исследовать уровень защитных белков и особенности реакции мембранных структур разных органов на ишемию при временной остановке системного кровообращения в зависимости от генетически детерминированного типа поведения.
Изучить модулирующее действие антигипоксантов и антиоксидантов на процессы свободнорадикального окисления в разных органах при коррекции стрессорных и гипоксических состояний.
Экспериментально обосновать и разработать новый способ профилактики и коррекции гипоксических состояний с помощью адаптации организма к изменению уровня кислорода. Оценить эффективность защиты различных органов с по-
9 мощью предложенного в работе способа адаптации в сравнении с принятыми методами адаптации к гипоксии.
Научная новизна работы.
Проведено комплексное изучение активации компонентов редокс-сигнализации и выявлены тканеспецифические особенности их индукции при острой гипоксии, ишемии и стрессе. Впервые показано, что синтез фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты в сердце, мозге, печени и легких имеет нелинейный характер, проходит с различной скоростью, достигает максимума в разные временные интервалы и может иметь несколько пиков индукции.
Острая гипоксия, гипероксия и ишемия нарушают работу Са-транспортирующей системы СР миокарда, что выражается в снижении ее активности и устойчивости к действию повреждающих факторов - активации
'У і
свободнорадикального окисления, повышенному содержанию свободного Са , автолизу. При адаптации к периодическому изменению уровня кислорода значительно повышается резистентность Са-насоса СР миокарда к активации свободнорадикального окисления, действию высокого уровня Са2+ и автолиза, что может обеспечивать эффективную защиту от повреждающих факторов.
Впервые на уровне компонентов редокс-сигнализации выявлены механизмы различной устойчивости к стрессорным и ишемическим повреждениям миокарда у крыс разных генетических линий. Обнаружен сниженный врожденный уровень и высокая стабильность параметров антиоксидантной защиты при стрессе и ишемии у крыс Август по сравнению с Вистар, что приводит к большей резистентности миокарда крыс Август при этих воздействиях. При стрессорных воздействиях эффективность функционирования Са-транспортирующей системы СР миокарда у крыс Август выше, чем у крыс Вистар.
Впервые показаны выраженные тканеспецифические особенности изменения резистентности внутриклеточных структур сердца, мозга и печени в различные сроки постреанимационного периода после временной остановки системного кровообращения. Выявлена зависимость формирования защитного или повреждающего ответа в разных органах от генетически детерминированного типа поведения животных.
Проведено сравнение эффектов in vivo и in vitro веществ с антигипоксиче-скими свойствами. Впервые показано, что кровезаменитель с полифункциональными свойствами перфторан и его компонент проксанол обладают модулирующим действием на соотношение про- и антиоксидантных систем в разных органах.
Впервые обнаружены принципиальные отличия длительного и кратковременного применения препарата с антиоксидантными функциями, содержащего ре-комбинантную СОД, на активность эндогенных антиоксидантных систем клетки. Кратковременное применение препарата предотвращает чрезмерную активацию свободнорадикального окисления при ожоге кожи, а длительное обладает менее выраженным протекторным эффектом на фоне относительного снижения собственных антиоксидантных ферментов кожи.
Впервые показана принципиальная возможность достижения устойчивого защитного эффекта при применении адаптационного режима, сочетающего периоды гипоксии и умеренной гипероксии. Формирование адаптационной защиты происходит в более короткие сроки, чем при классической интервальной нормобари-ческой гипоксической тренировке и без побочных эффектов на чувствительные к свободнорадикальным процессам органы.
Теоретическое значение работы: определена роль активных форм кислорода в активации различных компонентов системы редокс-сигнализации при развитии гипоксических состояний. Выявлены тканеспецифические особенности изменения про- и антиоксидантных факторов и резистентности мембранных структур клеток разных органов к свободнорадикальному окислению при адаптации организма к изменению уровня кислорода.
Практическое значение работы: на основе изучения закономерностей индукции защитных систем в клетках различных органов экспериментально обоснован и предложен рациональный способ коррекции гипоксических состояний, основанный на адаптации к периодам гипоксии и умеренной гипероксии.
Положения, выносимые на защиту.
1. Активация свободнорадикального окисления при острой гипоксии, ишемии и стрессе приводит к изменению уровня различных компонентов клеточной редокс-сигнализации - фактора транскрипции HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и ферментов антиоксидантной защиты.
2. Тканеспецифические особенности индукции синтеза защитных систем -
HIF-la, гем-оксигеназы-1, HSP70 и антиоксидантных ферментов в сердце, мозге,
печени и легких в динамике после острой гипоксии выражаются в том, что этот
процесс является нелинейным, проходит с различной скоростью, достигает
максимума в разные временные интервалы и может иметь несколько пиков
индукции. Высокий уровень синтеза защитных белков не всегда приводит к
снижению свободнорадикального окисления в клетках разных органов.
3. Генетически детерминированная повышенная устойчивость сердца к
ишемическим и стрессорным повреждениям в значительной степени связана с бо
лее высокой стабильностью системы антиоксидантной защиты и резистентностью
мембранных структур кардиомиоцитов к свободнорадикалыюму окислению при
этих воздействиях.
Тканеспецифические особенности реакции мембранных структур сердца, мозга и печени на ишемию, вызванную временной остановкой системного кровообращения, коррелируют с генетически детерминированным разным типом поведения.
Защита от острых воздействий, опосредованных повышением уровня активных форм кислорода, наиболее эффективна при кратковременном, но не длительном применение экзогенных антиоксидантов. Это позволяет максимально сохранить собственную эндогенную антиоксидантную защиту.
Новый способ адаптации, сочетающий периоды гипоксии и умеренной гипероксии, обладает значительным защитным действием на мембранные системы миокарда, мозга и печени, повышая их резистентность к высокому уровню активных форм кислорода. Формирование защитного эффекта происходит при более коротком времени тренировки и без побочных эффектов на чувствительные к сво-боднорадикальным процессам органы.
Результаты работы внедрены в курс лекций на кафедре биохимии и патофизиологии в Оренбургском государственном медицинском университете, на кафедре биохимии в Московском государственном медицинском стоматологическом университете, на факультете фундаментальной медицины Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, в ГУ НИИ общей реаниматологии Российской АМН.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 34 печатные работы (17 статей и 16 тезисов) в отечественных и зарубежных изданиях, имеется патент на изобретение.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и обсуждены на Всероссийских научных конференциях «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002; 2005), на IV Международном конгрессе патофизиологов (Будапешт, Венгрия, 2002), на международной конференции "Hypoxia in Medicine" (Innsbruck, Austria, 2003), на конференции «Основные общепатологические и клинические закономерности развития критических, терминальных и постреанимационных состояний. Принципы их коррекции» (Москва, 2003), на IX конгрессе физиологов (Екатеренбург, 2004), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004).
Работа выполнена в лаборатории патофизиологии сердца Государственного учреждения Научно-исследовательского института общей патологии и патофизиологии РАМН, в лаборатории адаптационной медицины факультета фундаментальной медицины МГУ им. М.В. Ломоносова, в лаборатории общей патологии терминальных состояний Государственного учреждения Научно-исследовательского института общей реаниматологии РАМН.
