Введение к работе
Актуальность темы. Среди негемопоэтических клеток, используемых для клеточной терапии, наибольшее применение находят мультипотентные мезенхимальные стромапьные клетки, выделенные из костного мозга, или ММСК [М. Dominici, 2006]. В связи с развитием клеточных технологий начато применение ММСК в клинических целях [Е.М. Horwitz et al., 2002; O.N. Кос et al., 2002; H.A. Онищенко с соавт., 2004; О. Ringden et al., 2006]. Однако до настоящего времени многие вопросы, касающиеся получения, культивирования, фенотипирования, распределения и кинетики клеток in vivo, остаются нерешенными. Не разработан универсальный и воспроизводимый протокол культивирования и фенотипирования клеток, и не определены единые критерии оценки качества культуры клеток для трансплантации. В научной литературе отсутствуют указания на различия в поведении ММСК in vivo после инфузии их интактным животным и животным с моделями острого и хронического патологического процесса. Одним из основных остается вопрос: при каких патологических процессах применение ММСК оправданно и эффективно?
На данный момент разработано несколько методов культивирования ММСК. По одному из них - культивирование ММСК в высокой плотности (впММСК) считают оптимальным и выгодным способом подготовки клеток к трансплантации. Согласно другому - конфлюэнтные культуры частично коммитированы к дифференцировке или даже старению, поэтому впММСК теряют некоторые свойства, присущие ММСК, выращенным в низкой плотности (нпММСК).
Общепринятым считается метод выделения ММСК из костного мозга путем их агдезии к поверхности лабораторного пластика [А.Я. Фриденштейн с соавт., 1970; М. Owen et al., 1988; M.F. Pittenger et al., 1999]. Клетки были охарактеризованы главным образом по их способности образовывать колонии в культуре и дифференцироваться в адипоциты, остеобласты и хондроциты. В дальнейшем с целью получения более стандартизованных и точных процедур изоляции и идентификации ММСК стали применять антитела к поверхностным белкам клеток. Первыми были открыты моноклональные антитела (IgM) к белку STRO-1, который экспрессировался конфлюэнтными культурами человеческих ММСК [P.J. Simmons et al., 1991]. Затем была выявлена дополнительная серия антител к ММСК, причем для фенотипирования ММСК стали использовать антитела, первоначально полученные для других типов клеток [F. Anjos-Afonso et al., 2007; V.L. Battula et al., 2007; H.J. Buhring et al., 2007; С Martinez et al., 2007]. Однако ни одно из этих антител не позволяет выделить культуру клеток, наиболее насыщенную ранними предшественниками и обладающую максимальным терапевтическим эффектом.
В последние годы появились сообщения о том, что нпММСК содержат суб-популяцию быстро само-реплицирующихся клеток [Т. Mets et al., 1981; СМ. DiGirolamo et al., 1999; D.C. Colter et al., 2001], проявляющих характерные паттерны экспрессии генов, отличные от паттернов клеток конфлюэнтных культур [С.A. Gregory et al., 2005], имеют гораздо больший потенциал к образованию моноклональных культур [D.C. Colter et al., 2001; J.R. Smith et al., 2004] и характеризуются лучшей эффективностью при трансплантации [R.H. Lee et al., 2006].
Преимущество использования культур нпММСК для клеточной терапии требует дальнейшего изучения. Важное значение имеет и определение (выбор) наиболее эффективных
путей доставки ММСК в органы/ткани-мишени. Имеются сообщения об успешнои приживлении клеток при внутривенном или локальном введении в ишемизированные облученные или другим образом поврежденные органы/ткани [J.S. Wang et al., 2001; А.А. Mang et al., 2003; L.A. Ortiz et al., 2003; M. Bensidhoum et al., 2004]. В то же время практически н изучена способность ММСК к миграции из системного кровотока через неповрежденный неактивированный эндотелий, то есть в условиях, приближенных к тем, которые наблюдаюто при большинстве заболеваний, потенциально пригодных для клеточной терапии.
Во всех публикациях, посвященных применению ММСК в клеточной терапии количественную оценку приживления клеток в тканях и органах осуществляют преимущественно в отдаленные сроки, не раньше чем через несколько суток поел трансплантации [S. Francois et al., 2006; Т.Е. Meyerrose et al., 2007]. Имеются лишь единичны сообщения о качественной оценке распределения меченых клеток в ранние сроки поел введения [S. Schrepfer et al, 2007]. Количественная оценка распределения клеток не проводится.
Целью настоящего исследования являлась разработка оптимального и воспроизводимог протокола получения клеточного трансплантата на основе ММСК костного мозга человека критериев экспресс-оценки качества трансплантата, опредение возможности и эффективност его использования в эксперименте у животных в норме и при различных патологически состояниях.
Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:
Получить культуру ММСК с высоким содержанием стволовых/прогениторных клеток.
Разработать критерии экспресс-оценки культуры ММСК для трансплантации.
Подобрать условия культивирования ММСК, при которых минимизируется риск агрегащн клеток в суспензии in vitro и образования тромбоэмболов при трансплантации in vivo.
Изучить распределение клеток полученных культур по органам и их кинетику поел введения в организм мыши в норме и при патологии.
Изучить терапевтическую активность полученных ММСК у мышей на модел стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета.
Научная новизна. Работа является первым экспериментальным исследованием, котором при сравнении существующих протоколов культивирования ММСК выбран оптимальный, направленный на получение максимально возможного количества клеток и одного биоптата костного мозга человека с сохранением качества культуры.
В ходе исследования впервые идентифицированы антитела к поверхностным клеточным маркерам, позволяющим охарактеризовать ранние клетки-предшественники в культурах ММС человека. Показана возможность быстрой оценки культур на наличие ранних клеток предшественников путем обнаружения маркерных поверхностных эпитопов PODXL интегрина-аб, интегрина-а4, HGFR методом проточной цитометрии ММСК после снятия их пластика трипсином/ЭДТА. Определены качественные и количественные характеристики культуры ММСК на этапах подготовки клеток к трансплантации.
Впервые изучена кинетика и распределение нпММСК в ранние сроки после системног введения мышам - циркуляция в крови и распределение по органам и тканям. Впервы
проводится количественная оценка распределениия нпММСК по органам в зависимости от метода введения.
В ходе работы предложены экспериментальные модели острого и хронического заболеваний для оценки распределения и кинетики после трансплантации отобранной культуры нпММСК. На модели стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета у мышей впервые изучен терапевтический эффект введения нпММСК: показано восстановление структуры островкового аппарата поджелудочной железы и активация ее эндокринной функции, а также репарация структуры гломерулярного аппарата почек.
Теоретическая и практическая значимость. Разработан метод, позволяющий получить трансплантат на основе ММСК человека с максимальным числом клеток из единственного образца костного мозга. Этот метод позволяет сохранить максимальное количество клеток-предшественников в культуре и одновременно минимизировать риск агрегации ММСК и образования тромбоэмболов в сосудах микроциркуляторного русла после трансплантации. Предложен эффективный подход к оценке качества ММСК, подготовленных для трансплантации, методом проточной цитофлюориметрии. Выявлен кластер поверхностных маркеров ранних клеток-предшественников. При сопоставлении внутривенного и внутриартериального способов введения определен оптимальный метод доставки клеток в пораженный орган/ткань. Показана структурная и функциональная репарация пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы у мышей со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом после внутриартериальной трансплантации культуры нпММСК человека. Установлено, что секреторной активностью обладали и некоторые из мигрировавших в поджелудочную железу нпММСК человека, причем при двойном иммуноцитохимическом окрашивании показана экспрессия этими клетками мышиного инсулина.
Основные положения, выносимые на защиту:
Культуры ММСК могут быть быстро оценены на наличие ранних клеток-предшественников, клоногенность и способность к дифференцировке, риск агрегации их в суспензии и образования летальных тромбоэмболов методом проточной цитометрии по уровню экспрессии спектра поверхностных маркеров. Наиболее информативными являются PODXL, интегрин-аб, интегрин-а4, HGFR.
Особенности кинетики и распределения нпММСК по органам и тканям в ранние сроки после трансплантации зависят как от способа системного введения, так и от наличия и характера патологического процесса.
Системное введение нпММСК человека мышам со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом стимулирует репарацию пораженных островков Лангерганса в ткани поджелудочной железы преимущественно за счет паракринных эффектов, при этом частично восстанавливается нормальная структура островков Лангерганса, снижается уровень глюкозы, повышается уровень инсулина крови этих животных. После трансплантации нпММСК человека у животных с сахарным диабетом также наблюдается восстановление структуры и функции гломерул почек.
Апробация работы. Основные результаты работы доложены на: 7th Annual Rachmic Levine Diabetes and Obesity Symposium, Advances in Diabetes Research: From Cell Biology to Ccl Therapy (2006r, Long Beach, CA, USA); 18th Annual Research Days of Tulane University Healtl Sciences Center (2007r, New Orleans, LA, USA); American Society of Gene Therapy's 10th Annua Meeting (2007r, Seattle, WA, USA); Adult Mesenchymal Stem Cells in Regenerative Medicine (2007i Cleveland, OH, USA); V конференция молодых ученых России с международным участиен (2008г, Москва).
Внедрение полученных результатов. Результаты диссертационного исследовани используются для выделения, культивирования и подготовки клеток к трансплантации лаборатории клеточной биологии и патологии развития ГУ НИИОПП РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 2 центральной печати. Еще две работы готовятся к публикации.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 156 страницах машинописног текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования трех глав изложения собственных результатов, их обсуждения, выводов, приложения и СПИСКс литературы. Литературный указатель включает 174 источника. Работа иллюстрирована 33 рисунками, 45 таблицами.
