Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы и
1.1. Ренин-ангиотензивная системаи полиморфизм генаАПФ 11
1.2. Полиморфизм генаАПФ и компоненты 16
1.2.1. АПФ I/D полиморфизм и ИР/ГИ 16
1.2.2. АПФ I/D полиморфизм и артериальная гипертензия 19
1.2.3. АПФ I/D полиморфизм и дислипидемия 266
1.2.4. АПФ I/D полиморфизм и ожирение 28
1.2.5. АПФ I/D полиморфизм и ИБС 30
ГЛАВА 2. Материал и методы исследований 33
3.1. Клинико-лабораторные методы исследований 33
3.1.1. Клинические методы исследования 33
3.1.2. Определение показателей углеводного обмена 34
3.1.3. Определение показателей липидного обмена 36
3.2. Инструментальные методы исследований 37
3.2.1. Высокоразрешающая ультрасонография 37
3.2.2. Цветовое дуплексное сканирование внечерепных отделов каротидных артерий с целью измерения толщины комплекса интима-медиа общих сонных артерий 38
3.3. Молекулярно-генетическое исследование 40
3.3.1. Выделение ДНК из цельной венозной крови 41
3.3.2. Амплификация, рестрикция и анализ полученных результатов
3.4. Характеристика исследуемых больных 43
3.5. Статистические методы исследования 47
ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований 48
3.1. Углеводный обмен 48
3.1.1. Анализ показателей углеводного обмена у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ при включении в исследование
3.1.2. Анализ показателей углеводного обмена у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ через 5 лет наблюдения... 50
3.1.3. Анализ динамики показателей углеводного обмена в группах пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ через 5 лет наблюдения 52
3.1.4. Динамика показателей инсулинорезистентности в группах пациентов с
различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ через 5 лет
наблюдения 54
3.2. Липидный профиль 59
3.2.1. Анализ показателей липидного профиля у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ при включении в исследование 59
3.2.2. Анализ показателей липидного профиля у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ через 5 лет наблюдения... 60
3.2.3. Анализ динамики показателей липидного профиля в группах пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ 61
3.3. Клинические показатели 67
3.3.1. Анализ клинических показателей МС у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ при включении в исследование 67
3.3.2. Анализ клинических показателей МС у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ через 5 лет наблюдения... 68
3.3.3. Анализ динамики клинических показателей МС в группах пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ 69
3.4. Клинические исходы 71
3.4.1. Формирование метаболического синдрома 71
3.4.2. Оценка риска развития атеросклероза 76
ГЛАВА 4. Обсуждение полученных результатов 80
Выводы 89
Список использованных литературных источников
- Полиморфизм генаАПФ и компоненты
- Определение показателей углеводного обмена
- Анализ показателей углеводного обмена у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ при включении в исследование
- Анализ динамики клинических показателей МС в группах пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ
Введение к работе
Актуальность проблемы. Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) в настоящее время неотделима от коррекции факторов риска. Их изучение позволило объединить большинство факторов риска в одно понятие – метаболический синдром (МС) [Диденко В.А., 1999; Бутрова С.А., 2001; Reaven G.M., 1988]. Основным патогенетическим звеном МС являются инсулинорезистентность (ИР) и/или гиперинсулинемия (ГИ). Повышение уровня инсулина способствует активации симпатической нервной системы и запускает ренин-ангиотензивную систему (РАС) [Makimattila, S. et al., 1996].
Главным эффектором РАС является ангиотензин II (АТ II), образование которого невозможно без ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) [Kannel W.B., 1990]. Количество АПФ в сыворотке крови человека генетически обусловлено [Диденко В.А., 1999; Kaplan N.M., 1989; Reaven G.M., 1988]. В ряде экспериментальных и клинических исследований показано, что наличие D-аллеля гена АПФ ассоциировано с повышением уровня АПФ [Зимин Ю.В., 1996; Чистяков Д.А. и др., 1998; Malik F.S. et al., 1997; Rigat B. et al., 1992].
Наиболее изученной представляется проблема взаимосвязи между полиморфизмом гена АПФ и повышением артериального давления (АД), хотя результаты исследований для различных популяций неоднозначны [Апарина Т.В. и др., 2001; Мамедов М.Н. и др., 1997; Минушкина Л.О. и др., 2000; Чистяков Д.А. и др., 1998; Nakai K. et al., 1994; Rigat B. et al., 1992; Rutledge D.R. et al., 1994].
Несмотря на то, что в большинстве работ выявлена ассоциация DD- генотипа с нарушениями углеводного обмена и ИР, существуют и противоречивые мнения [Зимин Ю.В., 1996; 1998; Haffner S.M. et al., 1992]. В отечественной литературе встречаются работы по изучению ассоциации различных аллелей и генотипов гена АПФ и проявлений метаболического синдрома. Однако эти сведения остаются не достаточно полными [Апарина Т.В. и др., 2001; Зимин Ю.В., 1998; Мамедов М.Н. и др., 1997; 1999; Минушкина Л.О. и др., 2000; Перова Н.В. и др., 2001; 2012,]. В связи с этим представляется актуальным продолжение российских исследований связи полиморфизма гена АПФ с риском развития клинически значимых нарушений углеводного и липидного обменов, ожирения и ССЗ. Изучение этого вопроса представляет большой научно-практический интерес, связанный с необходимостью выявления лиц с повышенным генетическим риском развития МС и сопутствующих с ним осложнений.
Цель исследования:
Определение роли полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента в формировании клинико-лабораторных проявлений метаболического синдрома и развитии сердечно-сосудистых заболеваний.
Задачи исследования:
-
Проанализировать 5-летнюю динамику клинических проявлений метаболического синдрома и оценить вероятность развития артериальной гипертонии с учетом полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента у пациентов изучаемой группы.
-
Оценить динамику показателей липидного обмена у мужчин и женщин без клинических проявлений метаболического синдрома с различными генотипами гена ангиотензинпревращающего фермента за 5 лет наблюдения.
-
Охарактеризовать прогностическую значимость полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента и относительный риск развития клинически значимых нарушений углеводного обмена у пациентов изучаемой группы.
-
Сравнить частоту встречаемости компонентов метаболического синдрома и их сочетаний у пациентов изучаемой группы с различными аллелями гена ангиотензинпревращающего фермента.
-
Оценить риск развития атеросклероза у пациентов, не имеющих клинических проявлений метаболического синдрома, в зависимости от полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента по толщине комплекса интима-медиа каротидных артерий.
Новизна исследования:
Впервые на основании пяти лет наблюдения изучены характер и степень выраженности клинических и лабораторных проявлений метаболического синдрома в динамике среди пациентов с различными генотипами гена ангиотензинпревращающего фермента. Показана ассоциация полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента с развитием метаболического синдрома и его компонентов.
Впервые в стране проведен анализ вероятности развития артериальной гипертензии у пациентов в зависимости от полиморфизма гена ангиотензин- превращающего фермента. Установлено достоверное повышение риска развития артериальной гипертензии, требующей медикаментозной коррекции, в группе мужчин носителей D-аллеля.
Впервые проведено проспективное исследование динамики показателей углеводного и липидного обмена у практически здоровых пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена ангиотензинпревращающего фермента. Через пять лет наблюдений обнаружены выраженные изменения показателей углеводного обмена у женщин и нарушения липидного обмена у мужчин при носительстве D-аллеля.
Практическая значимость исследования:
Определение генотипов гена ангиотензинпревращающего фермента может быть полезным в прогнозировании развития метаболического синдрома, артериальной гипертензии и раннего атеросклероза.
Выявление полиморфизма гена ангиотензинпревращающего фермента может найти применение при разработке индивидуальных профилактических программ с учетом прогнозируемых осложнений метаболического синдрома.
Положения, выносимые на защиту:
-
У лиц с полиморфным I/D вариантом гена ангиотензин-превращающего фермента повышается риск развития клинических проявлений метаболического синдрома, включая абдоминальное ожирение и артериальную гипертензию.
-
Большинство носителей аллеля D имеют латентную гиперинсулинемию. Пациенты с генотипом II обладают большей устойчивостью к развитию нарушений углеводного обмена, что обусловлено, вероятно, протективным действием аллеля I.
-
У мужчин D-аллель предрасполагает к развитию атеросклероза вследствие дислипидемии.
Апробация работы:
Основные положения и результаты диссертационной работы доложены на Европейской региональной конференции семейных врачей во Флоренции (2006 г). Апробация диссертации проведена 17 января 2013 г. на совместной научно-практической конференции коллектива сотрудников кафедры терапии и семейной медицины ФУВ, кафедры госпитальной терапии РНИМУ им. Н.И.Пирогова Минздрава РФ и сотрудников отделений клиники ОАО «Медицина».
Личный вклад. Автору принадлежит ведущая роль в выборе направления исследования, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, проведен анализ основных параметров, аналитическая и статистическая обработка результатов исследования, научное обоснование и обобщение полученных результатов. В ходе выполнения работы автором осуществлен подбор больных, их ведение и наблюдение в течение 5 лет, заполнение амбулаторных карт, анализ результатов клинико-лабораторных исследований в динамике. Вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах, их внедрения в практику.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научных работы, в том числе 3 статьи в рецензируемых ВАК научных журналах.
Практическое внедрение полученных результатов. Результаты исследования внедрены в клиническую практику отделений клиники ОАО «Медицина»,терапевтического отделения ФГБУЗ 72 ЦП МЧС России. Материалы работы используются в учебном процессе для практических занятий и лекций со слушателями семинаров, аспирантами и клиническими ординаторами.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы «Материал и методы исследования», 4 подглав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованных источников. Диссертация изложена на 113 на страницах машинописного текста, иллюстрирована 24 таблицами и 22 рисунками. Список литературы включает 188 источников, из которых 49 отечественных и 139 зарубежных авторов.
Полиморфизм генаАПФ и компоненты
Проведенные в последнее время исследования указывают на наличие дополнительного механизма влияния полиморфизма гена АПФ на углеводное равновесие: предполагается, что при наличии D-аллеля инфузия АТИ уменьшает первую фазу секреции инсулина, что во многом может предсказать развитие СД 2 типа [4, 12, 81, 127]. Molnar G. А. и соавторы изучали влияние I/D полиморфизма гена АПФ на метаболизм углеводов. В результате обследования 145 пациентов с СД 2 типа было установлено, что у носителей D-аллеля уровни фруктозамина и у-глутамилтрансферазы были значительно выше, чем у носителей 1-аллеля. При этом, ИР, обусловленная D-аллелем, была связана с ухудшением метаболического статуса, увеличением гликозилированных продуктов, что может являться причиной оксидативного стресса и повреждения эндотелия [138].
Большинство исследований, посвященных данной тематике проведено на пациентах с артериальной гипертонией и выраженной ИР [12, 21, 41, 84, 137, 176]. Предполагалось, что подобное построение научной работы позволило бы более четко определить взаимосвязь активности РАС и метаболизма глюкозы. Однако до настоящего времени однозначного результата не получено. 1.2.2. АПФ I/D полиморфизм и артериальная гипертснзия.
Представленные в литературе данные о взаимосвязи между полиморфизмом гена АПФ и повышением артериального давления также являются неоднозначными [6, 14, 19, 20, 23, 27, 28, 31, 33, 37, 39, 40, 43, 44, 49, 75]. В многоцентровом исследовании (Linkage study) не выявлено взаимосвязи между полиморфизмом гена АПФ и гипертонией. Эти результаты нашли подтверждение в работах отечественных и зарубежных авторов [32, 33, 58, 85].
В работах Ослопова В.Н. с соавторами показано отсутствие ассоциации I/D полиморфизма гена АПФ с риском развития гипертонической болезни у лиц русско-татарской популяции в целом, однако отмечается тенденция к увеличению частоты встречаемости гомозиготного генотипа DD в группе больных [32, 33]. Исследователи из Словении изучали вклад различных генов, возможно, принимающих участие в регуляции РАС, на предрасположенность к АГ у 57 детей в возрасте 8-19 лет с эссенциальной гипертензией (ЭГ) и не нашли связи I/D полиморфизма гена АПФ с развитием ЭГ у детей [150]. В исследовании генетически гомогенной, компактно проживающей группе японцев (п=2092) также не выявлено связи I/D полиморфизма гена АПФ с уровнем АД [175]. В работе Matsubara М. с соавторами при исследовании общей японской популяции (п=2048) также не обнаружено связи I/D полиморфизма гена АПФ с уровнем АД или сердечно-сосудистыми заболеваниями. Частота выявления генотипов II, ID и DD составляла соответственно 0,45; 0,45; 0,10, что свидетельствует о более редкой частоте выявления аллеля D в обследованной популяции японцев по сравнению с таковой у европейцев [131].
Финские ученые обследовали 455 человек (из них 288 женщин) из двух регионов Финляндии [90]. Они не обнаружили связи I/D полиморфизма гена АПФ с уровнем АД и развитием семейной гипертонической болезни. На уровень АД влияли мужской пол, возраст, индекс массы тела, а также курение и употребление алкоголя.
В испанской популяции (п=1322) было исследовано влияние полиморфизмов РАС, в том числе I/D полиморфизма гена АПФ в результате которого, авторы не нашли связи полиморфизмов гена АПФ и М235Т гена ангиотензиногена с повышенным АД. Только большая частота аллеля Т174 ангиотензиногена достоверно ассоциировалась с высокими значениями АД [130].
Несмотря на достаточно большое количество исследований, не подтверждающих связь I/D полиморфизма гена АПФ с развитием АГ, ряд авторов напротив, обнаружили взаимосвязь D-аллеля и повышенного артериального давления [4, 14, 25]. В 1990 г. был обнаружен полиморфизм гена АПФ, связанный с инсерцией (I) или делецией (D) в 16-м интроне 287 пар нуклеотидов [159]. Этот полиморфизм был ассоциирован с уровнем АПФ в плазме крови, более высоким он оказался у гомозигот по аллелю D. Так, в исследовании [157] у 80 здоровых лиц показано, что уровень АПФ в крови у носителей генотипов П, ID и DD существенно различался и составлял соответственно 299, 393 и 494 мкг/л. Аналогичные данные получены в работе [62]: у больных с АГ с генотипом DD концентрация АПФ была в 2 раза больше, чем у больных с генотипом IT/ID.
Голландские ученые [96] показали связь I/D полиморфизма гена АПФ с уровнем АД у здоровых лиц (п=198). Более высокое АД было связано с генотипом DD гена АПФ. Аллель D связан как с уровнем систолического (Р=0,005), так и диастолического (Р=0,001) АД.
Первый мета-анализ на представленную тему включал 23 работы с октября 1996 и состоял из 28 контролируемых групп из 6 923 пациентов. Объединенные коэффициенты показали 10%-ное увеличение риска заболевания гипертонией у носителей DD генотипа в сравнении с II генотипом. Однако в исследовании, проведенном у жителей Кавказского региона, не показано влияния генотипа на уровень артериального давления. Объединенные результаты исследований, выполненных при участии более чем 15 942 пациентов, также показали, что генотип не влияет на уровень артериального давления [14]. В 2005 году, в обзоре 26 проведенных исследований, посвященных изучению генетических составляющих артериальной гипертензии у человека, были получены противоречивые результаты: в 12 работах была найдена взаимосвязь генетических особенностей, том числе гена АПФ, и развития артериальной гипертензии, а в 14 - эти данные были опровергнуты [14].
Схожие данные получены in vitro: в результате создания линии мышей с одной, двумя или тремя функционально активными копиями гена АПФ установлено, что активность АПФ в плазме крови возрастает пропорционально числу копий гена, тогда как уровень АД существенно не меняется [112].
Известны работы, в которых авторы пытаются установить связь эффективности гипотензивной терапии ингибиторами АПФ с генотипом гена АПФ [2, 6, 19, 29, 42]. В частности проводится сравнение терапии ингибиторами АПФ и агонистами имидазолиновых рецепторов [2]. Показано, что у пациентов с DD генотипом (уровень АПФ в крови повышен) более эффективными в лечении оказываются ингибиторы АПФ; а у пациентов с II и ID генотипами (уровень АПФ в крови не повышен) - более эффективно снижают уровень АД агонисты имидазолиновых рецепторов. Исследование SILVHIA (Swedish Irbesartan Left Ventricular Hypertrophy Investigation versus Atenolol) [21] показало, что ответ на терапию ингибитором рецепторов к АТП (ирбесартаном) меняется в зависимости от генотипов I/D полиморфизма гена АПФ [103, 104]. В исследованиях L. Kurland и соавторами отмечено, что у лиц, гомозиготных по I-алллелю I/D полиморфизма гена АПФ, частота ответа на ирбесартан была 89% (снижение ДАД 10 мм рт.ст.), тогда как у лиц с D-аллелем - 42%. Различия в ответе ДАД были статистически достоверным (р=0,0096) [116]. В исследовании, проведенном J. Ortlepp и соавторами приводятся иные результаты: у 116 больных с АГ, принимавших кандесартан в течение 4-х недель, лица, гомозиготные по D-аллелю, имели тенденцию к повышению ответа (достижение ДАД 85 мм рт.ст.): DD-45%, ID-33%, Ц-16% (р=0,113) [147].
Определение показателей углеводного обмена
В настоящее время существует несколько методов получения изображения сосудов и оценки их функционального состояния. К ним относятся рентгенологический, ультразвуковой, ядерно-магнитный, радионуклидный, термографический и другие (Haffner S.M., 1992). Высокоинформативный метод оценки состояния сосудистой стенки является ультразвуковое исследование сосудистой системы (дуплексное сканирование сосудов).
Дуплексное сканирование сосудов объединяет серошкальное (черно-белое) исследование (обеспечивает визуализацию внутреннего просвета сосуда, измерение его диаметра и оценку состояния сосудистой стенки), допплерографию в импульсном режиме (позволяет измерять спектральные показатели потока крови), цветовое картирование допплеровского сигнала. Такая обширная характеристика состояния сосудистого русла, ультразвуковым методом позволяют достоверно диагностировать сосудистые поражения на ранних стадиях развития (McFarlane S.I. et al., 2001).
При ультразвуковом исследовании у здорового человека комплекс интима-медиа представляет собой двухслойную структуру с прилежащим к просвету гиперэхогенным слоем и подлежащим гипоэхогенным. Измерение отдельно слоев интимы и медии с помощью современных инструментальных технологий невозможно. При утолщении комплекса интима-медиа (ТКїНУІ) в его изображении исчезает дифференциация слоев, появляется гетерогенность, шероховатость поверхности (Диагностика и коррекция нарушений липидного обмена с целью профилактики и лечения атеросклероза, 2009). Ультразвуковая картина у пациентов с нестенозирующим атеросклерозом характеризуется изолированным изменением состояния комплекса интима-медиа артерий: утолщением, сопровождающимся изменением его эхоструктуры и эхогенности.
Для получения изображения сонной артерии и проведения измерений ее диаметра использовали систему VOLUSON 730 EXPERT 2006 г., оснащенную линейным датчиком с фазированной решеткой с частотой 7,5 МГц. Глубина (depth), усиление (gain), а также параметры логарифмической компенсации, препроцессинга и пост-процессинга были индивидуально подобраны для каждого пациента, и сохранялись неизменными в ходе исследования.
При продольном ультрасонографическом сканировании сонной артерии, детально изучался отрезок длиной 1 см, примыкающий непосредственно к началу бифуркации. Измерение ТКИМ общих сонных артерий проводили в В-режиме по методике [151]. Исследование проводили утром (до 10 часов) натощак в положении больного на спине после 10 минутного отдыха в горизонтальном положении, голова несколько повернута в противоположную сторону с приподнятым подбородком. Исследовались правая и левая общие сонные артерии на протяжении дистальной части ОСА, области бифуркации, проксимального участка ВСА в продольном и поперечном сечении. Стандартизованное измерение ТКИМ в общих сонных артериях проводилось в 3 точках на 1 см проксимальнее ее бифуркации по задней (по отношению к датчику) стенки артерии. При каждом исследовании использовались разные углы сканирования (передний и латерально-нижний), чтобы определить наибольшую ТКИМ, определяемую, как расстояние между границей просвет/интима и границей средний слой/адвентиция. Эти измерения ТКИМ проводились как на правой, так и на левой сонной артерии, затем вычислялась средняя величина для правой стороны, для левой стороны и для двух сторон вместе с учетом максимальной величины по 6 точкам справа и слева(Рисунок5) ВДчцххм-Сл , «Ц ТКИМ ТКИМ ОСА (среднее) = ТКИМ ПСА+ТКИМ ЛСА 0& » С Щ 4 І№ ТКИМ ОСА (максимальное) - максимальная величина по 6 точкам справа и слева НСА ВСА
Стенка артерии, расположенная ближе к датчику, называется ближней, дальше от датчика - дальней. В изображении ближней стенки слой адвентиции, как более плотной структуры, перекрывает изображение линии раздела адвентиция-медиа и достоверно локализовать ее невозможно. Верхний край второй эхо-линии соответствует поверхности раздела интима-просвет артерии, но абсолютная величина этой структуры не соответствует анатомическим аналогам по ранее изложенной причине. В изображении дальней стенки, соответственно, изображение поверхности раздела просвет артерии-интима будет соответствовать верхнему краю первого слоя, величина которого не имеет анатомического аналога. Поверхность раздела медиа-адвентиция соответствует верхнему краю второго слоя и, таким образом, толщина комплекса интима-медиа может быть адекватно измерена как расстояние между верхними границами первого и второго слоев изображения. Невозможность адекватно оценить состояние ближней стенки, обуславливает необходимость исследовать артерии в нескольких сечениях: 3 продольных (передне-заднем, латеральном, задне-латеральном) и поперечном. Так достигается наиболее полный объем информации о состоянии артериальной стенки.
Диаметр сосуда определяли как расстояние между проксимальным и дистальным по отношению к датчику доплеровскими сигналами. Объемные показатели кровотока с помощью соответствующих формул рассчитывали исходя из диаметра артерий (площади сечения артерии - S=3D2p /4) и скорости кровотока. В течение всего исследования датчик не смещали. Диаметр сосуда оценивали строго в одном и том же месте.
В В-режиме и в режиме цветной доплеровской визуализации имеющиеся ограничения прибора в точности установки измерительных маркеров приводят к ошибке в оценке расстояний, равной около 0,25% от длины полномасштабного дисплея или зоны обзора. Ранние признаки атеросклероза диагностировали при наличии локального утолщения ТКИМ более 1,0 мм.
Для ДНК диагностики точковых мутаций и полиморфизмов использовали метод аллель специфичного лигирования с последующей амплификацией, к основным преимуществам которого относится высокая чувствительность, возможность работы с небольшим количеством исследуемого материала, специфичность и простота исполнения.
В коммерческом наборе реагентов для ПЦР-анализа предусмотрен один или несколько образцов ДНК для обязательного положительного контроля прохождения реакции. В случае отсутствия фрагментов амплификации в исследуемых образцах и наличия их в положительном контроле, выделение ДНК из проб проводили заново.
ДНК выделяли по стандартной неэнзиматической методике с использованием коммерческого набора реагентов DiatomTM DNA Prep 100 (ООО «Центр молекулярной генетики», Россия) из лимфоцитов периферической крови, взятой из локтевой вены. Выделенную ДНК хранили при -20С. Изучение полиморфных вариантов исследуемых генов проводили с помощью амплификации соответствующих участков генома методом полимеразной цепной реакции,используя набор праймеров.
Геномную ДНК выделяли из лимфоцитов периферической крови. Для этого однородный образец крови (50 мкл) помещали в пробирку «Эппендорф» с 1000 мкл деинизированной воды и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем центрифугировали в течение 2 мин и ресуспендировали, оставляя осадок и около 30 мкл надосадочной жидкости. К осадку добавляли до 200 мкл 5% раствора смолы (Chelex-100 BioRad) и в течение нескольких секунд перемешивали на микроцентрифуге Vortex. Полученный материал инкубировали при t=56C в течение 30 минут. Повторно перемешивали на микроцентрифуге Vortex и инкубировали при t=100C в течение 8 минут. После чего производили интенсивное встряхивание на микроцентрифуге Vortex и центрифугировали 3 минуты. Для проведения ПЦР исследовали надосадочную жидкость.
Анализ показателей углеводного обмена у пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ при включении в исследование
Учитывая тот факт, что в прогрессировании метаболического синдрома решающее значение имеет совокупность определяющих его компонентов, нами была проанализирована частота совместной встречаемости повышения ИМТ, увеличения ОТ и развития АГ.
Оценка индивидуального кардиоваскулярного риска может быть крайне полезна при проведении скрининговых программ. С этой целью была изучена частота различных комбинаций компонентов синдрома ИР в зависимости от генотипов и аллельных вариантов гена АПФ. Пациенты с множественными комбинациями компонентов синдрома ИР имеют более высокий риск развития ССЗ. Проведен анализ распределения количества компонентов синдрома ИР в зависимости от различных аллельных вариантов и генотипов гена АПФ.
В группе пациентов носителей D-аллеля по сравнению с носителями I-аллеля наблюдалась выраженная тенденция к уменьшению встречаемости изолированной ИР на 13% (13 и 26% соответственно, р=0,142) за счет увеличения на 12% доли пациентов с полным синдромом ИР (5 и 17% соответственно, р=0,081) (Рисунок 18).
Анализ распределения количества компонентов синдрома ИР у гомозиготных пациентов по D и I аллелям показал достоверные различия между изучаемые группами (Рисунок 19). Так, изолированная ИР при DD генотипе встречалась в 9% случаев, при II генотипе - в 32% случаев (р=0,006). Встречаемость 4 компонентов совместно с ИР наблюдалась только у гомозигот по Оаллелю(р 0,001).
Конкретные сочетания компонентов на фоне ИР представляют фенотипы пациентов, которые имеют различные прогностические характеристики. Учитывая, что нарушение регуляции глюкозы крови сочетается с ИР, были изучены следующие фенотипы пациентов (Таблица 16). Е = АГ D = ДЛ+f ОТ о = дл F = ДЛ+АГ При наличии D-аллеля ДЛ и АГ встречались на фоне ИР достоверно чаще, чем при I аллеле 64,2 против 39,0% (р=0,013) и 60,4 против 37,3% (р=0,024) соответственно. Частота встречаемости фенотипа С также была достоверно выше при носительстве D аллеля и составила 28,3 против 11,8% (р=0,050). По остальным изучаемым фенотипам достоверных различий получено не было (Рисунок 20).
Полученные результаты носят еще более выраженный характер при исследовании частоты встречаемости различных фенотипов в зависимости от носительства гомозиготных генотипов по гену АПФ. В группе пациентов с генотипом DD по сравнению с генотипом II также достоверно чаще встречались ДЛ и АГ на фоне ИР, что составило 68,8 против 31,6% (р=0,05) и 81,3 против 42,1% (р=0,04) соответственно. Частота встречаемости фенотипа С была в 7 раз выше при носительстве DD генотипа и также достоверно отличалась от гомозигот по 1-аллелю, что составило 37,5 против 5,3% (р=0,050). По остальным изучаемым фенотипам достоверных различий получено не было (Рисунок 21).
Был проведен анализ риска в соответствии с показателем отношения шансов для различных фенотипов. Представлены данные об отношении к развитию синдрома ИР полиморфизма гена АПФ. Изучены связи с отдельными компонентами синдрома ИР (ДЛ, АГ или ОТ) и сочетаниями двух либо трех этих факторов при наличии ИР.
Варианты сочетания компонентов синдрома ИР в зависимости от генотипов гена АПФ. Об ассоциации генотипов с предрасположенностью к формированию синдрома ИР и его компонентов судили по величине отношения шансов (ОШ) -показателю, показывающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе "случай" (высокий риск) отличается от вероятности оказаться в группе "контроль" (здоровые) для носителя изучаемого генотипа. Взаимосвязь генотипов или аллельных вариантов гена АПФ с указанными фенотипами оценивали с помощью расчета ОШ и их 95% доверительных интервалов (95% ДИ). Группу пациентов носителей D аллеля с конкретным фенотипом (например, В) сравнивали с таким же фенотипом при наличии I аллеля.
Риск формирования полного синдрома ИР достоверно выше в 2,93 раза (р=0,033) с группе пациентов носителей аллеля D по сравнению с аллельным вариантом I (Таблица 17). Также в этой группе наблюдалась близкая к статистически значимой ассоциация риска развития сочетания АГ и ДЛ на фоне ИР с полиморфизмом гена АПФ при ОШ=3,2 (р=0,063).
Была выявлена еще более выраженная приверженность к проявлениям синдрома ИР с полным набором компонентов в генотипической группе DD. ОШ составило 10,8 (р=0,039), что подтверждает достоверную сильную ассоциацию между аллелем D и развитием полного синдрома ИР (Таблица 18). Таблица 18. Отношение шансов развития синдрома ИР при наличии DD генотипа гена АПФ
В нашем исследовании атерогенность дислипидемии в группе DD генотипа также дополнительно характеризовалась увеличением аполипопротеинового индекса атерогенности. Кроме того, при носительстве генотипа DD отмечены ранние признаки атеросклероза, характеризующиеся утолщением ТКИМ ОСА через 5 лет наблюдения.
При включении в исследование ТКИМ ОСА максимальная по 6-ти точкам измерения достоверно не различалась в группах пациентов с различными генотипами (р=0,436) и аллельными вариантами (р=0,286), составляя в среднем 0,76±0,01 мм. Через 5 лет наблюдения в группе пациентов - носителей DD генотипа данный показатель достоверно увеличился на 34,2% относительно исходного уровня и составил 1,06±0,04 мм против 0,82±0,04 мм у гомозиготных пациентов по аллелю I (р=0,001).
За 5-ти летний период наблюдения у части пациентов изучаемых групп были выявлены ранние признаки атеросклеротического поражения каротидных артерий в соответствии со значением ТКИМ ОСА, превышающей 1,1 мм (Рисунок 22). В группе пациентов с генотипом DD доля таких пациентов была в 2,7 раза выше, чем у пациентов с генотипом II (57,9% против 21,7%) (Р 0,001).
Анализ динамики клинических показателей МС в группах пациентов с различными генотипами и аллельными вариантами гена АПФ
Зная вышеописанные эффекты глюкозы и инсулина, можно с уверенностью сказать, что инсулинорезистентность и компенсаторная гиперинсулинемия сопровождаются воспалением и усилением свободнорадикального окисления, что повышает риск развития атероскероза. В нашем исследовании показано, что I/D полиморфизм гена АПФ ассоциирован с нарушениями углеводного обмена. Через 5 лет после первичного обследования при аллельном варианте D число пациентов с ИР увеличилось на 25%. Среди гомозиготных по аллелю D пациентов доля лиц с нарушениями углеводного обмена составила около 50%, частота НТГ в этой группе была в 1,4 раза выше, чем среди гомозиготных по I аллею. Расчет отношения шансов показал, что риск развития нарушений углеводного обмена при генотипе DD в 1,7 раз выше, чем при генотипе II. Таким образом, анализ различных показателей углеводного обмена показал, что лица с генотипом II обладают большей устойчивостью к развитию нарушений углеводного обмена, нежели носители генотипа DD, что, по всей видимости, связано с протективным действием аллеля I.
Существуют несколько определений МС. Одно из них предложено в рамках Третьей национальной образовательной программы по гиперхолестеринемии у взрослых (NCEP АТР III). Это определение отличается простыми и четкими критериями. Основные компоненты МС представляют донозологические состояния, предшествующие развитию болезни: дислипопротеидемия, артериальная гипертензия, абдоминальное ожирение, нарушение регуляции глюкозы. Все они являются отдельными факторами риска развития ССЗ. Отличительной чертой их сочетания при МС является тот факт, что ИР, объединяя компоненты синдрома, усиливает выраженность каждый из них. Множественные клинические и биохимические изменения, лежащие в основе развития МС, определяют переход этих состояний в сердечно-сосудистые заболевания и сахарный диабет 2 типа. В ряде предыдущих исследований было установлено, что риск развития ССЗ при МС напрямую связан с количеством определяющих его компонентов. В нашем исследовании показано, что риск развития полного МС в 2,9 раза выше в группе пациентов, носителей D-аллеля по сравнению с аллельным вариантом I. При изучении гомозиготных групп по изучаемым аллелям риск развития полного синдрома при DD -генотипе увеличивался до 10,8.
Инсулинорезистентность и избыток свободных жирных кислот при МС могут привести к нарушению функции сосудистого эндотелия, который играет важную роль в регуляции сосудистого тонуса, проницаемости сосудистой стенки и образования новых сосудов. При МС наблюдаются ранние признаки нарушения функции артерий. В первую очередь это утолщение комплекса интима-медиа сонных артерий. По его толщине можно диагностировать атеросклеротические изменения на ранних стадиях их развития и судить об изменение артерий других локализаций, например мозговых и коронарных. Надежный неинвазивный метод определения толщины интима-медиа это двумерное УЗИ.
В исследованиях многих авторов изучалась толщина комплекса интима-медиа различных артерий (сонной, бедренной) и выраженность атеросклероза сонных и коронарных артерий в зависимости от генотипа АПФ. При исследовании 80 больных с гиперлипдемиями и 80 здоровых пациентов Bonithon-Кор С. с соавторами [64] и 199 здоровых пациентов Castellano М. с соавт. [68] никаких различий в толщине ИМ сонных артерий выявлено не было. В исследовании ELSA при обследовании 320 больных артериальной гипертонии у больных с DD генотипом была выявлена достоверно большая толщина ИМ сонных артерий и большая распространенность атеросклероза сонных артерий, по сравнению с больными, имеющими II и ID генотип. В работе Hosoi М. [98] анализировалась толщина ИМ сонных и бедренных артерий у больных с инсулиннезависимым сахарным диабетом. ИМ сонных артерий оказалась достоверно выше у больных с DD генотипом. Для ИМ бедренных артерий такой зависимости не выявлено. В работе Benetos А. [63] анализировалась скорость распространения пульсовой волны и жесткость сонных и бедренных артерий и здоровых и гипертоников в зависимости от генотипа АПФ. Для здоровых лиц никаких достоверных различий не было обнаружено, для больных с артериальной гипертонией обнаруживалась слабая и зависящая от показателей АД связь между жесткостью бедренной артерии и наличием D-аллеля. Интересна также работа Amant С. и соавт. [56], проанализировавших риск развития рестеноза после стентирования у 146 больных ИБС в зависимости от генотипа. По данным полугодового наблюдения у больных с DD генотипом наблюдалась наибольшая степень уменьшения просвета коронарных сосудов по данным количественной коронарографии. Данные, полученные в нашем исследовании подтверждают раннее опубликованные результаты. Носительство D аллеля гена АПФ ассоциировалось с наличием ранних признаков атеросклеротического поражения сосудов, проявляющимся утолщением комплекса интима-медиа сонных артерий более 1,1 мм, либо образованием атеросклеротической бляшки в каротидных артериях. Данные изменения выявлены в группе носителей D-аллеля в 61,1% случаев. При этом относительный риск развития атеросклероза при наличии D аллеля составил 2,14 с 95% доверительным интервалом в диапазоне от 1,12 до 4,10.
Рост распространенности компонентов МС и увеличение количества им определенных нозологии - сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета 2 типа, представляют значительную угрозу здоровью населения развитых и развивающихся стран. Совершенствование методов диагностики и лечения требует разработки новых подходов к выявлению факторов, определяющих развитие компонентов МС. Одним из них является поиск генетической составляющей в развитии синдрома. В нашей работе мы показали наличие взаимосвязи между полиморфизмом гена АПФ с риском развития метаболического синдрома и сердечно-сосудистых заболеваний, что позволит в будущем разработать программы скрининга МС с учетом индивидуального генетического кода.
