Введение к работе
Актуальность темы
В настоящее время проблемы гемостаза продолжают привлекать внимание многих исследователей, так как имеют большое значение для клинической практики. Нарушения в этом процессе являются составным элементом хирургической и акушерской патологии, лежат в основе патогенеза многих сердечно-сосудистых, цереброваскулярных, инфекционных, иммунных заболеваний. Необходимость предупреждения и лечения тромбозов и геморрагических состояний, создание атромбогенных материалов, применяемых в хирургической практике, требуют более глубокого познания молекулярного механизма свертывания крови и его регуляции. В последние годы получены значительные результаты в исследованиях, проясняющих сосудисто-тромбоцитарный гемостаз и молекулярный механизм превращений факторов свертывания в плазменном гемостазе (Зубаиров Д.М., 2000; Шитикова А.С, 2000; Бутенас С. и Манн К.Г., 2002; Hansson К. и Stenflo J., 2005). Вместе с тем, несмотря на прогресс в понимании отдельных стадий, как и в начале изучения проблемы, остается неясным, какова физико-химическая природа исходного импульса, запускающего процесс гемостаза в целом. Разрешение этой проблемы в дальнейшем позволит предупреждать развитие нарушений в системе гемостаза, разрабатывать лекарственные препараты, способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови с целью его нормализации при различных патологических состояниях.
Свертывание крови представляет собой сложный биологический процесс, в котором участвуют сосудистая стенка, форменные элементы крови (в основном тромбоциты) и некоторые растворимые белки плазмы, участвующие в каскаде генерации ключевого фермента свертывания - тромбина. Клинические наблюдения показывают, что в этом процессе абсолютно необходимы только те реакции, в которых участвуют витамин К-зависимые факторы свертывания (факторы VII, IX, X и протромбин). Они последовательно активируются в нескольких ферментных комплексах при участии ионов Са2+. Комплексы имеют однотипную организацию, включающую, наряду с ферментом и субстратом, белок-кофактор и каталитическую фосфолипидную поверхность, представляемую мембранами клеток, соприкасающихся с кровью. При этом ферментные комплексы витамин К-зависимых факторов в 105-109 раз более эффективны в протеолизе их естественных субстратов, чем свободные ферменты (Бутенас С. и Манн К.Г., 2002) В норме мембраны клеток атромбогенны. Следовательно, приобретение клеточными мембранами тромбогенных свойств является одним из основных элементов инициирования свертывания крови.
До начала наших исследований было известно, что прокоагулянтное свойство клеточных мембран обусловлено присутствием в них фосфатидилсерина, а скорость активации витамин К-зависимых факторов зависит от их фосфолипидного состава. Было установлено, что при образовании ферментных комплексов витамин К-зависиМыХфакщиии ішиислдашт связывание
и\ с кислыми фосфолипидами мембран, главным образом, с фосфатидилсерином Гипотезы строения и функционирования коагуляционных ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов были разработаны в основном по данным, полученным в исследованиях по связыванию этих факторов с модельными фосфолипидными монослоями или везикулами (Mann К G. и др., 1990; Gerads I. и др., 1990; Pei G. и др., 1993). Однако природные клеточные мембраны имеют более сложную структурную организацию, присутствие на этой поверхности различных белков, углеводов может иметь значение для связывания с ней факторов свертывания и влиять на формирование и работу их ферментных комплексов. Следовательно, выяснение принципов формирования ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания на естественных клеточных мембранах является фундаментальной задачей всей проблемы свертывания крови.
Превращение протромбина в тромбин является ключевым звеном, на котором замыкаются внешний и внутренний биохимические механизмы свертывания. Поэтому мы в своих исследованиях в основном остановились на изучении взаимодействия протромбина с клеточными мембранами, подвері нутыми различным физико-химическим воздействиям. Выяснение молекулярного механизма взаимодействия этого фактора свертывания с поверхностью трансформированных клеточных мембран позволило прояснить структурную основу приобретения ими тромбогенных свойств. Из выше изложенного следует, что такое исследование является актуальным как в теоретическом, так и в практическом отношении.
Цель исследования
Целью работы являлось выяснение значения структуры поверхности естественных клеточных мембран в обеспечении их тромбогенных свойств.
Задачи исследования
Достижение цели работы требовало последовательного выполнения следующих исследований: изучения взаимодействия протромбина, продуктов его активации и другого витамин К-зависимого фактора свертывания - фактора X с тромбогенной поверхностью препарата тканевого тромбопластина; выяснения молекулярного механизма связывания протромбина с клеточными поверхностями после воздействия различных физико-химических факторов. В соответствии с этим в работе были поставлены следующие задачи:
-
Разработка и совершенствование методов получения витамин К-зависимых факторов свертывания - фактора X, протромбина и продуктов его активации: фрагмента 1, претромбина 1, а-тромбина; ,
-
Исследование молекулярного механизма и количественных закономерностей связывания протромбина, продуктов его активации и фактора X с тканевым тромбопластином;
3. Выяснение влияния различных факторов на взаимодействие протромбина с основными клетками крови и клеточными мембранами;
4 Разработка представлений о молекулярном механизме приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств и формирования ферментных комплексов витамин К-зависимых факторов свертывания крови.
Научная новизна
Разработаны новые методы очищения протромбина и фактора X, отличающиеся от существующих меньшей трудоемкостью при сравнимом выходе, чистоте и биологической активности препаратов. Впервые предложен способ получения меченного 1251 сс-тромбина, позволяющий полностью сохранять его ферментативную активность. В ходе проведенных исследований установлено, что связывание протромбина и фактора X, в отличие от модельных фосфолипидных везикул, на фрагментах мембран происходит по двум типам фосфолипидных центров. Получены доказательства Са2+-независимого связывания витамин К-зависимых факторов с клеточными мембранами. Обнаружена способность ионов Са2+ подавлять электростатическое связывание тромбина с фосфолипопротеиновыми частицами, что обеспечивает быстрое освобождение фермента из ферментативного комплекса и его участие в последующих этапах гемостаза. Установлено наличие в плазме крови здоровых людей нетромбиновых продуктов распада протромбина, что свидетельствует о фоновой активности системы свертывания крови. Впервые показано, что в основе развития гиперкоагуляции при радиационном воздействии лежит повышение способности клеточных мембран связывать витамин К-зависимые факторы свертывания, обусловленное изменением их фосфолипидной структуры. В исследованиях по взаимодействию протромбина с клетками обнаружили адсорбцию на их поверхности молекул протромбина, неспецифическое связывание которых позволяет ускорять процесс свертывания крови. При связывании протромбина с эритроцитами и альвеолярными макрофагами обнаружено, что гепарин снижает адсорбционную способность клеточной поверхности, а после повреждения эритроцитов осмотическим шоком, наоборот, способствует связыванию с ней протромбина. Растительные лектины Glycine max исключают участие протромбина в свертывании крови посредством связывания его с углеводами клеточной мембраны. Волчаночноподобные антитела обусловливают дополнительное связывание протромбина тромбоцитами, что, вероятно, и определяет их антикоагулянтный эффект.
Теоретическое значение результатов проведенных исследований определяется раскрытием молекулярного механизма приобретения клеточными мембранами тромбогенных свойств. Проведенный анализ обнаруженных закономерностей показывает значительную роль структурных изменений мембраны клеток для процесса свертывания крови и тем самым позволяет понять патогенез заболеваний, протекающих с нарушениями в системе гемостаза.
Практическая значимость
Разработанные способы получения протромбина, фактора X, меченного ,251 а-тромбина и определения продуктов распада протромбина (фрагмента 1, претромбина 1) могут использоваться в практике научно-исследовательских лабораторий с целью разрешения проблем гемостазиологии.
Определения содержания фрагмента 1 и претромбина 1 в плазме крови могут быть использованы для диагностики тромботических состояний в клинике.
Установление причины гиперкоагуляции при острой лучевой болезни позволяет проводить целенаправленный поиск новых подходов в проведении патогенетического лечения этого заболевания.
Полученные данные о влиянии гепарина, растительного лектина Glycine max на связывание протромбина с клеточными мембранами помогут разрабатывать лекарственные препараты, способные эффективно воздействовать на молекулярный механизм системы свертывания крови с целью его нормализации при различных патологических состояниях.
Положения, выносимые на защиту
1. Протромбин и фактор X взаимодействуют на поверхности фрагментов
клеточных мембран с двумя типами фосфолипидных центров связывания,
наличие которых обусловлено гетерофазной структурой этих фрагментов.
-
Са2+ опосредованная перестройка бислойной структуры нативных клеточных мембран в мезоморфную лежит в основе молекулярного механизма приобретения мембранами тромбогенных свойств, специфического связывания с ней витамин К-зависимых факторов и обеспечивает формирование их ферментных комплексов.
-
Патогенные воздействия на процесс взаимодействия протромбина с клеточными мембранами определяют эффективность его участия в свертывании крови.
Внедрение результатов исследования
Материалы диссертации включены в лекционный курс для студентов Казанского государственного медицинского университета на кафедре биологической химии. Методы получения протромбина, фактора X и способ сохранения биологической активности меченного 1251 а-тромбина используется в научно-практической работе ФГУН Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии Рос потреб надзора.
Апробация работы
Основные результаты работы доложены и обсуждены на Всесоюзном съезде врачей-лаборантов (Москва, 1985), Всесоюзной конференции «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987), Первом международном патофизиологическом конгрессе (Москва, 1991), Всесоюзной конференции «Физиология и патология гемостаза» (Полтава, 1991),
Российской конференции «Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии» (С.-Петербург, 1995), XIII Международном съезде гематологов (Стамбул, 1995), XIV Международном конгрессе (Монтпеллье, 1996), III Съезде биохимического общества (С-Петербург, 2002), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003)
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ (статей - 13, тезисов - 12), получено авторское свидетельство на изобретение.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследований, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов и библиографии. Работа содержит 15 таблиц и 33 рисунка. Список литературы включает 295 источника, из них 235 на иностранных языках.
