Введение к работе
Актуальность темы. Важным направлением современной биотехнологии является осуществление электрохимической регенерации пиридиннуклеотидов (НАД(Ф)+/НАД(Ф)Н). Реакция их окисления (восстановления) сопряжена с восстановлением (окислением) специфического субстрата, в активных центрах ферментов дегидрогеназ. На сегодняшний день известно более 500 дегидрогеназ. Субстраты этих ферментов представлены широким кругом химических соединений. Поэтому путем сопряжения дегидрогеназных и электрохимических реакций представляется возможным разрабатывать биосенсоры на большое число жизненно важных метаболитов, создавать биотопливные элементы, утилизирующие энергию окисления дешевого природного сырья, такого как, например, формиат, этанол. Еще одним направлением использования дегидрогеназных электродов можно считать осуществление специфического электросинтеза.
Регенерация пиридиннуклеотидов на платиновых и углеродных электродах требует больших дополнительных энергетических затрат. Перенапряжения (отклонения потенциала от его равновесного значения) превышают один вольт, что с учетом участия в реакции двух электронов соответствует энергии два электрон-вольта (!). Жесткие условия проведения электрохимической реакции приводят к ряду побочных явлений, что сопряжено с деградацией пиридиннуклеотида. Более того, проведение регенерации при таких перенапряжениях для биотехнологических целей неприемлемо. Так электроанализ при сверх- высоких (низких) потенциалах невозможен ввиду окисления (восстановления) огромного числа соединений, присутствующих в реальных образцах. С другой стороны, топливные элементы с учетом подобных перенапряжений будут функционировать с крайне низкой эффективностью, вплоть до нулевого КПД.
В течение последних 30-и лет были предложены различные медиаторпые системы для регенерации пиридиннуклуотидов. Однако они недостаточно стабильны, а также, в большинстве случаев, недостаточно эффективны. Кроме того, к моменту постановки задачи не существовало электрокаталитической системы, активной как в реакции окисления НАДН, так и восстановления НАД+, что делало невозможным достижение равновесного потенциала НАД7НАДН.
Электрохимическая полимеризация - перспективный метод синтеза полимерных пленок, з том числе и электроактивных, на поверхности электрода. Кроме широко известных преимуществ (адресность нанесения покрытия, тонкий электрохимический контроль свойств и количества нанесенного полимера), электрополимеризация, как было показано на примере
9В еНеМНМе
ЛЬНАЯ( КА |
полимерных азинов, может рассматриваться в качество одного нэ подходав бномнметики.
РОС НАЦИОНАЛЬНАЯf
БИБЛИОТЕКА СПетсі
Флавины являются простетическими группами ряда окислительно-восстановительньж
ферментов (оксидоредуктаз), катализирующих самые различные реакции. В частности, с
участием флавинадениндинуклуотида (ФДЦ) осуществляется регенерация
пиридиннуклуотидов в активньж центрах некоторьж дегидрогеназ. Несмотря на то, что собственно флавины обладают крайне низкой каталитической активностью, методом электрохимической полимеризации (по аналогии с полиазинами) представляется возможным синтезировать на основе флавинов, а также других соединений, обладающих сходной структурой, эффективные электрокатализаторы регенерации НАД+/НАДН.
Цель и задачи работы. Целью работы являлся синтез эффективных электрокатализаторов регенерации НАДУНДЦН.
Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи: осуществить электрохимическую полимеризацию флавинов;
изучить влияние электрохимических свойств полимерных флавинов на эффективность реакции окисления НДЦН;
определить оптимальные условия полимеризации Нейтрального Красного (НК) для достижения его максимальной активности как катализатора в реакции регенерации НАД+/НАДН;
разработать ферментные электроды на основе полимерного Нейтрального Красного для доказательства ферментативной активности продукта реакции восстановления НАД+;
изучить возможность прямого электрохимического наблюдения равновесного потенциала НАД+/НАД Н.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые осуществлена электрохимическая полимеризация флавинов. Показано, что полимерные флавины обладают высокой электронной проводимостью. Путем оптимизации электрополимеризации ФДЦ получен наиболее эффективный электрокатализатор окисления НАДН, характеризующийся электрохимической константой 1.8x10" см/с, которая обусловливает протекание реакции при наиболее низком потенциале (0.0 В, ХСЭ рН 6.0) практически в диффузионно-контролируемом режиме. Операционная стабильность полимерного ФДЦ намного превосходит известные системы окисления НДЦН. Таким образом, на основе полимерного ФДЦ удалось синтезировать наилучший электрокатализатор окисления НДЦН с точки зрения его активности и стабильности.
На электрополимеризованном НК осуществлено безмедиаторное восстановление НДЦ*-Показано, что продуктом электрокаталитического восстановления НАД* является ферментативно активный НАДН.
На электродах, модифицированных поли(НК), впервые наблюдался равновесный потенциал НАДТНАДН. Осуществление обратимой электрохимической регенерации пиридиннуклуотида позволяет определить более точно стандартный потенциал НАД+/НАДН (Е„' = -0.59 В, ото. НКЭ, рН 6.0).
Апробация работы. Основные результаты работы представлены на конференциях: Joint International Meeting, 200th Meeting oflhe Electrochemical Society, Inc. and the 52nd Meeting of the International Society of Electrochemistry (San-Francisco, USA, 2001); Международная конференция «Биокатализ-2002» (Москва, Россия, 2002); I Международный конгресс «Биотехнология» (Москва, Россия, 2002); The Bioelectrochemical Society XVII-th International Symposium on Bioelectrochemistry and Bioenergetics (Florence, Italy, 2003); II Международный конгресс «Биотехнология» (Москва, Россия, 2003)
Публикации. По материалам исследований опубликовано 8 работ, в том числе 3 статьи в международных журналах и 5 тезисов научных конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, а также изложения результатов и их обсуждения^глав), выводов и списка цитируемой литературы, содержащего /#5~ссылок. Работа изложена на 432. страницах, содержит ~& рисунков и в таблиц.
