Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1 Литературный обзор. Холинэстеразы 10
1.1 Физиологическая функция ацетилхолинэстеразы 10
Классическая каталитическая функция АХЭ 10
Неклассические функции АХЭ 11
АХЭ — эритроцитарный антиген 12
Молекулярный полиморфизм АХЭ 13
1.2 Заболевания, связанные с АХЭ 14
Болезнь Альцгеймера 14
Миастенический синдром 15
1.3 Структура и каталитический механизм действия АХЭ 16
Структура АХЭ 16
Механизм гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ 24
1.4 Компьютерное моделирование реакций АХЭ 27
Молекулярно-динамическое моделирование 27
Молекулярный докинг 32
Моделирование реакции гидролиза 33
1.5 Бутирилхолинэстераза 37
Функция БХЭ 37
Сравнение строения БХЭ и АХЭ 37
Особенности катализа БХЭ 40
Роль БХЭ в терапии болезни Альцгеймера 40
Взаимодействие с фосфорорганическими соединениями 41
Молекулярный полиморфизм БХЭ 43
Атипичная БХЭ, роль Asp70 43
Гидролиз кокаина 47
1.6 Заключение 48
ГЛАВА 2 Моделирование реакций гидролиза сложных эфиров холинэстеразами 50
2.1 Выбор кристаллографической структуры 50
Ацетилхолинэстераза 50
Бутирилхолинэстераза 52
2.2 Добавление атомов водорода 54
2.3 Положение молекулы субстрата 55
Молекулярный докинг 55
Положение ацетилхолина в АХЭ 57
Положение сукцинилихолина в БХЭ 58
Молекулярно-динамическое моделирование 61
2.4 Добавление молекул воды 62
2.5 Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики 63
2.6 Выделение квантовой подсистемы 64
Система АХЭ-ацетилхолин 64
Система БХЭ-сукцинилхолин 66
2.7 Локализация минимумов на ППЭ системы 68
Система АХЭ-ацетилхолин 68
Система БХЭ-сукцинилхолин 69
Расчет энергетических барьеров реакции 69
Колебательный анализ в стационарных точках 70
2.8 Заключение 71
ГЛАВА 3 Реакция гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ 72
3.1 Геометрические конфигурации стационарных точек 73
Фермент-субстратный комплекс 73
Первое переходное состояние 74
Тетраэдрический интермедиат стадии ацилирования 75
Сравнение с аналогами тетраэдрического интермедиата 76
Ацилферментный комплекс 79
Второе переходное состояние 80
Тетраэдрический интермедиат стадии деацилирования 81
Продукты реакции 82
3.2 Энергетический профиль реакции ацетилхолина и АХЭ 83
3.3 Обсуждение механизма реакции гидролиза ацетилхолина, катализируемого АХЭ 85
Стадия ацилирования 85
Стадия деацилирования 86
Возможность двухпротонного механизма 88
Роль Glu202 в реакции гидролиза ацетилхолина АХЭ 89
3.4 Влияние выбора квантовой подсистемы на точность расчетов 90
3.5 Заключение 95
ГЛАВА 4 Корреляции между скоростью гидролиза незаряженных субстратов, катализируемого ахэ, и их структурой 96
4.1 Экспериментальные данные 96
4.2 Расчет с использованием малой квантовой подсистемы 98
4.3 Расчет с использованием большой квантовой подсистемы 101
4.4 Соответствие экспериментальных и расчетных данных 104
4.5 Изучение взаимодействия незаряженных субстратов с гидрофобным сайтом АХЭ : 106
4.6 Заключение 111
ГЛАВА 5 Влияния полиморфной модификации БХЭ asp70gly на механизм реакции гидролиза сукцинилхолина 112
5.1 Анализ фермент-субстратного комплекса БХЭ-сукцинилхолин 112'
Молекулярный докинг 113
Молекулярно-динамическое моделирование 114
5.2 Геометрические конфигурации стационарных точек 115
Фермент-субстратный комплекс 115
Тетраэдрический интермедиат стадии ацилирования 117
Ацилфермент 117
5.3 Энергетический профиль и оценка влияния полиморфной модификации БХЭ на механизм реакции гидролиза сукцинилхолина 118
5.4 Заключение 121
Основные результаты и выводы 122
Список сокращений 123
Список литературы 124
- Механизм гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ
- Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики
- Сравнение с аналогами тетраэдрического интермедиата
- Изучение взаимодействия незаряженных субстратов с гидрофобным сайтом АХЭ
Введение к работе
Актуальность темы
Для решения задач медицины, фармацевтики и биотехнологии необходимы представления о механизмах реакций ферментативного катализа, что предполагает знание элементарных стадий химических превращений в активных центрах белков. Экспериментальные приемы включают исследования структуры белков и их комплексов с аналогами субстратов с использованием методов рентгеноструктурного анализа и ядерно-магнитного резонанса. Закономерности протекания ферментативных реакций изучаются методами химической кинетики. Существенную поддержку этим исследованиям оказывают методы генной инженерии.
В настоящее время становится возможным проводить анализ элементарных стадий ферментативных реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые в экспериментальных исследованиях, с привлечением методов молекулярного моделирования. На данный момент наиболее перспективной группой методов можно считать комбинированные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), которые позволяют детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения и молекул растворителя. Основной принцип приближения КМ/ММ заключается в описании центральной части системы с использованием квантовомеханических методов, а окружающей части — с использованием методов молекулярной механики.
Диссертация посвящена изучению механизмов реакций гидролиза в активном центре ферментов, относящихся к семейству холинэстераз: ацетилхолинэстеразы — одного из ключевых ферментов центральной нервной системы, и фермента, выполняющего в организме защитные функции — бутирилхолинэстеразы. Детальное исследование механизмов холинэстеразного гидролиза является актуальной задачей, поскольку эта информация позволяет не только предсказать активность нативных ферментов в отношении различных субстратов, но и предложить модификации природных белков для получения более эффективных с точки зрения медицинских приложений ферментов.
Цель работы
Целью работы являлось изучение механизмов реакций гидролиза сложных эфиров в активном сайте холинэстераз с использованием метода КМ/ММ. В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:
Построить энергетический профиль реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы.
Оценить скорости гидролиза ряда незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты в активном сайте ацетилхолинэстеразы.
Исследовать влияние выбора квантовой подсистемы на результаты моделирования механизма реакции гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ.
Построить энергетический профиль реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинэстеразы.
Изучить влияние полиморфной модификации Asp70Gly на механизм реакции гидролиза сукцинилхолина в активном сайте бутирилхолинэстеразы.
Научная новизна результатов.
Впервые проведено компьютерное моделирование методом КМ/ММ и построен энергетический профиль полного цикла гидролиза ацетилхолина в активном сайте ацетилхолинэстеразы. Локализованы стационарные точки на поверхности потенциальной энергии и определены энергетические барьеры обеих стадий реакции (ацилирования и деацилирования), составляющие, соответственно, 7.2 и 8.4 ккал/моль.
На основании полученных методом КМ/ММ структур фермент-субстратных комплексов оценены скорости гидролиза незаряженных сложноэфирных субстратов в активном сайте ацетилхолинэстеразы.
Для серии незаряженных сложных эфиров уксусной кислоты показано, что наиболее благоприятное положение субстрата в активном центре, обеспечивающее наименьший активационный барьер, достигается для
соединений, наиболее близких по структуре к природному субстрату ацетилхолинэстеразы — ацетилхолину.
Показано, что для корректного моделирования реакций гидролиза в активном сайте ацетилхолинэстеразы методом КМ/ММ в квантовую подсистему необходимо включать не только аминокислотные фрагменты, непосредственно участвующие в реакции (His447, Ser203), но другие ключевые аминокислотные остатки активного центра (Glu202, Glu334, Glyl21,Glyl22,Ala204).
Показано, что полиморфная модификация Asp70Gly не оказывает существенного влияния на энергетический профиль первой стадии реакции гидролиза сукцинилхолина бутирилхолинэстеразой; активационные барьеры для нативного фермента и его полиморфной модификации близки, но тетраэдрический интермедиат для модифицированного фермента отличается большей стабильностью.
По результатам расчетов во всех рассмотренных примерах ферментативные реакции холинэстераз проходят по однопротонному механизму.
Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза в активном сайте холинэстераз позволяет предсказывать активность полиморфных модификаций этого фермента, встречающихся у человека, и облегчает создание модифицированных ферментов, способных расщеплять опасные для организма соединения.
Апробация работы и публикации автора по теме диссертации.
Материалы диссертации были представлены на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2007» (Москва, 2007), Международной конференции студентов и аспирантов по
фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), 2-ой международной конференции «Biocatalysis in Non-Conventional Media» (Москва, 2008), VIII Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2008), 6-ой Всероссийской конференции «Молекулярное моделирование» (Москва, 2009), Международной конференции «Biocatalysis-2009» (Архангельск, 2009), Международной конференции «10th International Meeting on Cholinesterases» (Шибеник, Хорватия, 2009), XIX Международной молодежной конференции "Биохимическая физика", ИБХФ РАН-ВУЗы (Москва, 2009).
Результаты работы опубликованы в 13 печатных работах, в том числе в 4 статьях в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации
Механизм гидролиза ацетилхолина в активном центре АХЭ
Роль каталитической триады (аминокислотные остатки помечены сиреневым цветом) сводится к непосредственному участию в гидролизе ацетилхолина в активном центре белка. Каталитическая триада АХЭ типична для сериновых протеаз (серин-гистидин-кислотный остаток), однако имеется и характерное отличие: в качестве кислотного остатка выступает Glu вместо более распространенного в случае сериновых протеаз Asp, боковая цепь которого короче на одно -СН2— звено, чем у Glu. Серии и гистидин принимают участие в реакции в качестве нуклеофильной атакующей группы и элемента кислотно-основного катализа, соответственно. Предполагаются 3 возможных варианта механизма участия Glu 334 в катализе: ? стабилизация переходного состояния и тетраэдрического интермедиата посредством электростатического взаимодействия глютамата с образующимся в процессе катализа имидазольным катионом [46]; ? перенос протона с положительно заряженного His437 на Glu324, выступающего в роли основания [47]; ? образование короткой водородной связи между карбоксилатом Glu 324 и имидазольным катионом His 437, понижающую энергетический барьер реакции [48]. Роль оксианионного центра и анионного кармана в процессе катализа сводится к фиксации субстрата в активном центре фермента посредством взаимодействия с карбонильным кислородом и четвертичной триметиламмониевой группой субстрата соответственно, что вносит вклад в стабилизацию интермедиатов и переходных состояний. Пептидные группы остатков Glull7, Glull8, А1а200 (оксианионный центр) образуют водородные связи с карбонильным кислородом ацетилхолина, тем самым удерживая ацетильную группу субстрата при нуклеофильной атаке кислорода Serl99 на первой стадии гидролиза. Фиксация положительно заряженной 1Ч(СНз)з+ группы ацетилхолина осуществляется посредством ее электростатического взаимодействия с Glu202, а таюке я-взаимодействия катиона с ароматическими кольцами Тгр86 и Туг337. Кроме того, важную роль в катализе играют молекулы воды и их ориентация в активном сайте, которая обеспечивается водородными связями с другими аминокислотными остатками, например с Asp440 [49]. Большое значение в изучении принципов устройства и действия АХЭ сыграли экспериментальные исследования в области рентгеноструктурного анализа, ЯМР и сайт-специфического мутагенеза. Вследствие невозможности получения сн3 рентгеновских данных для короткоживущего 4N фермент-субстратного комплекса ацетилхолин-АХЭ, было исследовано множество комплексов-аналогов интермедиата. Эти данные явились ключом к пониманию механизма связывания субстрата и стабилизации переходного состояния в активном центре АХЭ. Например, в работе [50, 51] методом рентгеноструктурного анализа был исследован комплекс АХЭ из Torpedo californica с ингибитором, TMTFA л/-(7Ч,М,г Г-триметиламмоний)-2,2,2-три фторацетофеноном — аналогом интермедиата (TMTFA-ТсАХЭ), связывающегося в 10ю раз сильнее, чем природный субстрат благодаря ковалентной связи карбонильного атома трифторкетоновой группы с серином. Структура была получена с разрешением 2.8А. В строении этого комплекса можно выделить несколько ключевых особенностей, подтверждающих обобщенные принципы строения активного центра, сформулированные выше: Кристаллическая структура комплекса TMTFA-ТсАХЭ указывает на наличие ковалентной связи между Оу Serl99 и карбонильным углеродом ингибитора, что свидетельствует об образовании тетраэдрического интермедиата на стадии ацилирования реакции гидролиза. При этом карбонильный кислород TMTFA образует 3 водородных связи с пептидными группами остатков Glyll7, Glyll8, А1а200 (оксианионный центр) с расстояниями между карбонильным кислородом субстрата и атомами азота пептидных групп остатков оксианионного центра равными 2.9, 2.9 и 3.2 А, соответственно. Вклад в стабилизацию переходного состояния составляет примерно 5-7 ккал/моль (приблизительная оценка с использованием кинетических данных из экспериментов по сайт-направленному мутагенезу) [52-55]. Расстояние между 0YSer 199 nNe2His437 составляет всего 2.7 А, что свидетельствует в пользу механизма переноса протона между серином и гистидином при образовании тетраэдрического интермедиата на стадии ацилирования, что способствует активации нуклеофила. Минимальные расстояния между четвертичной аммониевой группой TMTFA и неводородными атомами остатков Trp82, Glul98, Туг327, образующими анионный карман, составляют 3.7, 3.5, и 4.0 А соответственно. Общий вклад в стабилизацию переходного состояния каталитической триады и анионного кармана составляет приблизительно 11—13 ккал/моль (приблизительная оценка с использованием кинетических данных из экспериментов по сайт-направленному мутагенезу).
Комбинированный метод квантовой и молекулярной механики
Благодаря своему особому строению — наличию длинного узкого канала, ведущего к активному сайту, АХЭ является интересным объектом для молекулярно-динамического моделирования. Одним из основных вопросов, исследуемых с использованием метода молекулярной динамики, является конформационная подвижность белковой молекулы АХЭ -— изменение радиуса канала, ведущего к активном сайту, а также существование альтернативного канала, т.н. «задней двери». Особенный интерес представляет прохождение субстрата по узкому каналу к активному центру, поскольку АХЭ отличается очень высоким числом оборотов, что подразумевает необходимость высокой скорости доставки субстрата к активному сайту. Предполагают, что прохождению субстрата внутрь фермента способствуют его электростатические взаимодействия с заряженными остатками, а также 7Г-взаимодействия положительно заряженной четвертичной аммониевой группы ацетилхолина с 14-ю ароматическими остатками, которыми буквально выстлана поверхность канала. Кроме того, молекула фермента имеет большой общий отрицательный заряд (-11) что дает возможность предположить, что пространственное распределение заряда остатков может быть одним из ключевых факторов, определяющих эффективность прохождения субстрата в активный центр АХЭ [77].
На ранних этапах, когда возможности вычислительной техники были ограничены, для моделирования использовался метод конечных разностей DELPHI для решения уравнения Пуассона—Больцмана на решетке 65x65x65 точек, включающей в себя белок и учитывающей растворитель в неявном виде [78]. Параметры атомов были заданы с использованием силового поля Amber. Был получен вид электростатического потенциала вдоль канала, ведущего к активному сайту фермента, имеющий вид отрицательно заряженной области около входа в канал. Отрицательный потенциал, ориентированный вдоль оси, проходящей через центр канала, увеличивается по направлению к активному сайту. Такой вид электростатического поля обуславливает быстрый процесс доставки катионного субстрата к активному сайту по механизму электростатического поглощения или захвата. При этом большинство кислотных остатков находятся на расстоянии 5А от оси канала, а-непосредственно канал выстилают его ароматические группы, которые таким образом представляют из себя серию связывающих сайтов с низкой аффинностью к четвертичной положительно заряженной аммонийной группой ацетилхолина. Невысокое сродство аминокислот канала к субстрату может играть существенную роль в ускорении диффузии катионного субстрата к активному сайту, в то время как отрицательно заряженные аминокислоты могли бы слишком сильно связывать субстрат и препятствовать его продвижению вдоль канала [79].
Роль электростатического поля канала также подробно исследовалось в работах [80-86], выводы которых во многом схожи — электростатическое поле канала играет существенную роль в доставке положительно заряженных субстратов, но при этом не является единственным фактором. Молекулярно-динамическое моделирование комплекса АХЭ с такрином, с использованием силового поля GROMOS, 500 пс траектория, представлено в работе [87]. Моделирование белка в растворителе было проведено равновесно, при этом наблюдалось периодичное изменение радиуса входа в канал от 1 А (канал может считаться практически закрытым), до 2.6 А, достаточного для входа субстрата в канал. Флуктуации размера канала были достаточно быстрые, время между экстремальными положениями меньше 50 пс, и не должно препятствовать катализу. Кроме того, были обнаружены альтернативные области проникновения молекул растворителя в канал, предполагавшиеся и ранее [88], образующиеся при смещении Glu82, Рго76 и Gly77 и соседствующих с ними аминокислот и образовании молекулами воды водородных связей с ними. Предполагается, что это вода, участвующая в катализе на стадии деацилирования. Более детальное изучение свойств молекул воды в канале было проведено в работе [89]. Была получена 10 не траектория с использованием силового поля Amber94: белок был помещен в коробку из молекул воды с добавлением ионов натрия для сохранения нейтрального заряда системы, но без использования периодических граничных условий. В этой работе кроме основного входа в канал, указывается целый ряд дополнительных входов, открывающихся в ходе молекулярно-динамической траектории. Было показано, что количество молекул воды в канале варьируется во времени от 16 до 22, при том, что объем, занимаемый лигандом примерно сравним с объемом, занимаемым 6 молекулами воды. При этом переход молекул воды осуществляется при максимальном радиусе канала, в среднем каждые 200 пс. Таким образом, было показано, что частота и величина флуктуации радиуса канала влияют на скорость и размер лиганда, проникающего в белок.
Молекулярно-динамическое моделирование непосредственно прохождения лиганда к активному сайту по каналу было осуществлено в работе [90]. Траектория 10 не была получена с использованием силового поля Amber95, лиганд был помещен у входа в канал. Прохождение лиганда по каналу заняло 50—200 пс. Рассчитанный профиль свободной энергии показал, что максимум потенциального барьера соответствует наиболее узкому участку канала. Величина энергетического барьера, который необходимо преодолеть молекуле лиганда, чтобы достичь активного центра АХЭ, составила 2—2.5 ккал/моль. В момент, когда лиганд проходит через наиболее узкий участок, происходит "раскрытие" канала: расстояние между Phe338 и Туг120 увеличивается, достигая максимума, и убывая затем до начального значения. Механизм движения боковых цепей Phe338 и Тугі20 заключается в образовании и разрыве водородных связей с близко расположенными к ним остатками, в результате чего их пространственное положение меняется. При этом было установлено, что прохождение лиганда обеспечивает не только коррелированным смещением боковых цепей аминокислотных остатков, но и смещением основных цепей петли Cys67— Cys94, образующей стенку канала, расширяющее канал, после чего происходит релаксация к исходному состоянию. Общая картина движения белковой молекулы напоминает дыхание.
Сравнение с аналогами тетраэдрического интермедиата
Кроме того, было обнаружено, что мутация W82A [189] приводит к полной неспособности БХЭ расщеплять сукцинилхолин и снижает на 4 порядка kcat для субстратов с одним положительным зарядом и практически не влияет на способность расщеплять незаряженный субстрат. Таким образом, еще раз подтверждена существенная роль Тгр82 в удержании катионной части субстрата. Мутация W231A не приводит к заметным изменениям констант скорости гидролиза.
Т.к. БХЭ расщепляет большой спектр субстратов со сложноэфирной связью, было показано, что другие аминокислоты также существенны для гидролиза различных субстратов. Например, Glu441, Ие442, Glu443 играют роль в гидролизе производных хинолина. Также при помощи сайт-направленного мутагенеза было показано, что мутации TyrlHHis и Phe561Tyr восстанавливают каталитическую активность полиморфного варианта БХЭ, что можно интерпретировать как образование альтернативного сайта связывания положительно заряженного фрагмента субстрата [190].
Также были исследованы различные физико-химические свойства атипичной БХЭ. В работе [191] исследовалась активность атипичной и нормальной БХЭ (wildeype) в зависимости от давления и температуры, которые варьировались в интервале 0.001-2 кбар и 10—35С соответственно. Было установлено, что нормальная БХЭ гораздо более чувствительна к температуре, чем атипичная. Было высказано предположение, что в нормальной БХЭ происходят конформационные изменения, индуцируемые температурой, которые не происходят в атипичном ферменте. При изменении давления наблюдалась обратная картина — при давлении Ікбар наблюдалось переходное состояние нормальной БХЭ с повышенным сродством к лиганду. При дальнейшем повышении температуры она оставалось активной, в то время как атипичная форма оказалась более чувствительна к давлению и теряла активность при давлении 1.5 кбар. На основании полученных результатов были сделаны выводы, что Asp70 играет роль в конформационной пластичности активного сайта БХЭ и регулирует каталитическую активность при изменении температуры. Последующие исследования [192] изменения объема активного сайта и канала в процессе связывания белка с субстратом показали, что изменения объема происходят нелинейно и связаны с наличием лимитирующей стадии при связывании, при этом для бензоилхолина это деацилирование, а для бензоилтиохолина — ацилирование. Кроме того, было подтверждено предположение, высказанное в. [191], что Asp70 контролирует гидратацию канала активного сайта и динамику молекул воды во время катализа. Авторы отмечают, что для объяснения этих эффектов необходимо квантово-механическое исследование механизмов гидролиза и строения переходных состояний для реакций с различными субстратами.
Особый интерес представляет способность БХЭ расщеплять многочисленные экзогенные субстраты, содержащие сложноэфирную связь. Это могут быть как лекарственные препараты, так и наркотики, например, кокаин [193].
Употребление кокаина и быстро возникающая психологическая зависимость от него влекут за собой серьезные медицинские и социальные проблемы, общие для всех наркотиков: распад личности, нарушения здоровья, влекущие быструю смерть наркомана, рост преступности. Поэтому исследования механизмов расщепления кокаина и создание методов лечения передозировки кокаина и снижение его влияние на сознание человека представляют важнейшую задачу. Кокаин оказывает токсическое действие, блокируя обратный захват нейромедиаторов, и до сих пор не было обнаружено молекулы-антагониста. Предпринимались попытки блокировать доставку кокаина к рецепторам и ускорить его метаболизм в организме [194]. Доминирующий путь метаболизма кокаина у приматов — гидролиз, катализируемый БХЭ, продукты гидролиза биологически неактивны. Только 5% кокаина дезактивируется окислением микросомальным цитохромом Р450 в печени. Поэтому перспективной идеей представляется лечение передозировки кокаина при помощи введения БХЭ [195]. Сложности вызывает тот факт, что скорости расщепления стереоизомеров кокаина различаются в 1-2 тысячи раз, при этом скорость расщепление (-)—кокаина ниже, чем (+)-кокаина. Последний удаляется из плазмы крови за секунды, не успевая достичь центральной нервной системы, в то время как (-)-кокаии находится в крови 45-90 минут — время, достаточное для достижения ЦНС и нанесения вреда. Таким образом, стоит задача построения мутанта, способного быстро гидролизовать (-)—кокаин.
Существует целый ряд работ, посвященный моделированию возможных механизмов гидролиза кокаина: изучение различных возможных механизмов без участия БХЭ, ab initio вычисление энергетических барьеров при учете влиянии БХЭ на реакцию гидролиза [196-207]. В работе [206] при помощи молекулярной динамики рассматривалось связывание модификации БХЭ Alal99Ser, Ser287Gly, Ala328Trp, Tyr332Gly с (-)-кокаином. Последние три мутации обеспечивают лучшее расположение (-)-кокаина в активном сайте, a Serl99 создает дополнительную водородную связь, снижающую энергетический барьер гидролиза. Эффективность этой модификации, как сообщается в той же работе, находит экспериментальное подтверждение.
Изучение взаимодействия незаряженных субстратов с гидрофобным сайтом АХЭ
Для более корректного сравнения поведения субстрата в комплексе с полиморфной модификацией Asp70Gly, в этой же структуре была проведена замена Asp70 на глицин.
Моделирование проводилось с использованием периодических граничных условий в изотермическом-изобарическом ансамбле (NPT), шаг интегрирования 1фс. Вначале система постепенно разогревалась от 0 до 300 К в течении 300 пс (с увеличением температуры на 1 градус с шагом 1 пс), после чего проводилась запись траектории при температуре 300 К в течение 1 не.
Молекулы воды, находящиеся в активном центре АХЭ, являются непосредственными участниками моделируемого процесса каталитического гидролиза. Подготовленные модельные структуры содержат 52 и 61 молекулы воды для АХЭ и БХЭ соответственно, что является явно недостаточным. Это, скорее всего, связано с неточностями в определении положений подвижных молекул воды с помощью рентгеноструктурного анализа и особенностями процесса кристаллизации белка. В связи с этим возникла необходимость насытить структуру молекулами воды, для чего был проведен - поиск пустых полостей, образуемых боковыми цепями аминокислотных остатков фермента в районе активного центра и ведущего к нему канала, которые могут содержать молекулы воды. Для этого использовалась программа Tinker 1.7, которая позволяет осуществлять поиск и заполнение таких полостей, основываясь на геометрических принципах. Молекулы воды, оказавшиеся на внешней поверхности фермента, были удалены. В результате общее количество добавленных молекул воды составило 135 и 88 для АХЭ и БХЭ соответственно. После чего их положения были оптимизированы методом молекулярной динамики с использованием той же программы Tinker 1.7 [211] и силового поля AMBER99 [212] при изменении температуры от 0 до 300 К и обратно суммарной продолжительностью 200 пс.
В результате была получена начальная геометрическая конфигурация системы, использовавшаяся в последующих КМ/ММ расчетах. В систему комплекса АХЭ и ацетилхолина вошли 3287 атомов, а БХЭ и сукцинилхолина 2974.
Основным принципом комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) [218] является разделение рассматриваемой системы на две подсистемы — внутреннюю, рассматриваемую с использованием методов квантовой механики, и окружающую ее, моделируемую с использованием классических приближений, в основном, силовых полей. При этом крайне важным является аккуратный учет взаимодействий на границе квантовой и классической подсистем.
Выбор метода расчета в квантовой подсистеме определяется одновременно требованиями к точности и скорости расчета. Методы теории функционала электронной плотности [219] является в настоящее время наиболее распространенным благодаря благоприятному соотношению точности расчета и затрачиваемого на него времени [220]. В плане выбора силового поля, одним из лидеров является силовое поле AMBER99 [212]. Существует целый ряд методов для учета взаимодействий квантовой (КМ) и молекулярно-механической (ММ) подсистем и они продолжают активно развиваться. В настоящей работе было использовано два метода. Один из них — электронное, внедрение [221] — является широко распространенным методом [220, 222]. В этом методе точечные заряды ММ-подсистемы добавляются к КМ-подсистеме. При этом не происходит взаимодействия и поляризации двух систем, что обеспечивает высокие скорости расчета, но может сказаться на точности. Второй метод, использовавшийся в настоящей работе для системы БХЭ-сукцинилхолин — метод конформационно подвижных эффективных фрагментов [223, 224] — относится к группе быстро развивающихся методов потенциала эффективных фрагментов [225]. Принцип этого метода заключается в том, что ММ-часть разбивается на характерные группы атомов, конформационно подвижные. Параметры электростатического и отталкивательного потенциалов были аккуратно рассчитаны с использованием методов квантовой химии, а взаимодействия между фрагментами вычисляются при помощи силового поля.
После создания исходной структуры для КМ/ММ расчетов, необходимо разделить систему на квантово-механическую и молекулярно-мёханическую подсистемы и зафиксировать часть атомов. Критериями выбора квантовой подсистемы для расчетов были непосредственное участие молекулы или аминокислотного остатка в химическом превращении и участие в формировании сетки водородных связей в системе. Выбранная таким образом квантовая часть включала в себя следующие аминокислотные остатки/молекулы: ? молекулу ацетилхолина; ? 3 молекулы воды, расположенные в активном центре в позициях, наиболее подходящих для участия в реакции (все эти молекулы воды присутствовали в исходной кристаллографической структуре); ? боковые цепи остатков каталитической триады Ser203, His447, Glu334, непосредственно участвующих в катализе; ? остатки оксианионного центра Glyl21, Glyl22, А1а204, фиксирующего карбонильный кислород ацетилхолина в активном центре АХЭ.
