Содержание к диссертации
Введение
3. Обзор литературы 7
3.1. Стабильность ферментов в органических средах 8
3.1.1. Гомогенные растворы ферментов 10
3.1.2. Гетерогенные системы, содержащие фермент 13
3.2. Подходы к стабилизации ферментов в органических средах 21
3.3. Нековалентные комплексы полиэлектролитов 25
3.3.1. Интерполиэлектролитные комплексы 2 5
3.3.2. Белок - полиэлектролитные комплексы 30
3.3.3. Каталитические свойства и стабильность ферментов в комплексе с полиэлектролитом 32
3.4. Тирозиназа - полифенолоксидаза 35
3.4.1. Физиологическая роль тирозиназы, методы очистки и механизм катализа 35
3.4.2. Тирозиназа в органических средах 42
3.4.3. Некоторые аспекты применения тирозиназы в биосенсорах 44
4. Постановка задачи 46
5. Экспериментальная часть 47
5.1. Реагенты и приборы 47
5.2. Методы 48
5.2.1. Приготовление комплекса фермента с поликатионом 48
5.2.2. Определение каталитической активности тирозиназы в водных растворах 48
5.2.3. Определение каталитической активности тирозиназы в системе обращенных мицелл 48
5.2.4. Определение каталитической активности нативнои тирозиназы и в нековалентных комплексах с полиэлектролитами в водно-этанольной системе 49
5.2.5. Модификации элетродов и проведения электрохимических измерений 50
6. Результаты и обсуждение 52
6.1. Нековалентные комплексы тирозиназа с полибреном 52
6.1.1. Каталитическая активность комплексов в водных растворах: рН - зависимость 52
6.1.2. Каталитическая активность комплексов тирозиназа с полибреном в водно - этанольных смесях 57
6.2. Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл 65
6.3. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в водной среде: рН - зависимость 67
6.4. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе с полиэлектролитом в водных и водно-этанольных системах 73
6.5. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл в водной среде 79
6.6. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в ацетонитриле 87
6.7. Использование спрэй технологии для иммобилизации тирозиназы на твердом носителе (электроде) 91
7. Выводы 98
8. Список литературы
- Гетерогенные системы, содержащие фермент
- Каталитические свойства и стабильность ферментов в комплексе с полиэлектролитом
- Определение каталитической активности тирозиназы в системе обращенных мицелл
- Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл
Гетерогенные системы, содержащие фермент
Гетерогенные биокаталитические системы отличаются от гомогенных наличием поверхности раздела между фазой, содержащей биокатализатор и органическим растворителем, в объеме которого может локализоваться субстрат. Суспензии биокатализаторов в неполярных и полярных органических растворителях. Несмотря на то, что уровень каталитической активности суспендированных ферментов обычно на несколько порядков ниже активности в водном растворе, ферменты в практически безводных органических средах сохраняют высокую селективность, включая стерео- и энантиоспецифичность [3, 30, 31]. Эффективность биокатализа в данном случае определяется содержанием воды в системе, природой органического растворителя и способом получения системы.
В суспензионных системах присутствует вода, различающаяся прочностью связи с ферментом, так называемая «объемная» и «ледяная» вода [21], что лежит в основе сложного вида зависимости каталитической активности от содержания воды. В большинстве случаев эта зависимость имеет вид кривой с максимумом [32]. Когда вода в системе полностью отсутствует, биокатализатор практически не проявляет каталитической активности, поскольку вода играет ключевую роль в невалентных взаимодействиях, крайне важных для осуществления каталитического акта. Увеличение концентрации воды приводит к гидратации фермента, увеличению подвижности групп активного центра и, как следствие, проявлению относительно высокой ферментативной активности [33]. Дальнейшее повышение содержания воды в системе приводит к снижению каталитической активности, очевидно, из-за еще большего увеличения подвижности молекул биокатализатора, в результате чего у органического растворителя появляется возможность проникать во внутренние области белка и тем самым нарушать каталитически активную конформацию [34].
Концентрация воды в практически сухих органических растворителях является величиной относительной, определить ее точное абсолютное значение крайне трудно. В настоящее время большинство исследователей склоняется к тому, что для адекватного описания свойств суспендированных ферментов следует использовать термодинамическую активность воды. Преимущества данного подхода включают возможность точного экспериментального определения активности воды [35], относительную простоту ее контроля, например, при помощи кристаллогидратов [36]. Ограничение же подхода состоит в том, что, пользуясь активностью воды, не всегда удается точно описать закономерности катализа суспензиями ферментов в полярных растворителях [37]. Следует заметить, что роль воды в биокатализе в области существования суспензий ферментов крайне сложна и многопланова и в настоящее время прояснена не до конца.
Свойства суспензионных систем, безусловно, зависят от природы органического растворителя. В целом, исследователи склоняются к тому, что полярные растворители оказывают более сильное инактивирующее воздействие на суспедированные ферменты, а также в большей степени понижают их субстратную специфичность [38].
Способ приготовления системы также влияет на свойства биокатализатора. Чаще всего, предварительно лиофилизованный (из водного раствора) ферментный препарат суспендируют в органическом растворителе с последующим доведением концентрации (или активности) воды до требуемого значения. При этом дегидратация белка в процессе лиофилизации может приводить к частичной денатурации биокатализатора [39]. Для ослабления денатурирующего эффекта лиофилизации было предложено вводить в систему добавки углеводной природы (сахаров), что в ряде случаев позволило существенно снизить потери активного фермента [39].
Наряду с относительно низкой каталитической активностью, суспензии ферментов характеризуются исключительно высокой операционной термостабильностью, а также стабильностью при инкубации в практически безводных органических растворителях [39]. Это в значительной степени связано с большей "жесткостью" белковой молекулы в неводных средах [40]. Причиной ограниченной подвижности белков в практически безводных органических растворителях является усиление электростатических взаимодействий в белке, в частности, водородных связей, сопровождающееся компактизацией белковой глобулы [41].
Также исследователи уделяют большое внимание влиянию органических растворителей на вторичную структуру белков в фазовой области существования суспензий [42]. Установлено, что в органических растворителях вторичная структура белков либо сходна с таковой в водных растворах, либо доля а-спиралей и }-листов возрастает (что наблюдается чаще). Однако, несмотря на многочисленные экспериментальные данные, строгой корреляции между сохранением вторичных структур в суспендированном белке и его каталитической активностью установить не удалось [42].
Рассмотрение структуры ферментов, суспендированных в практически безводных органических растворителях, и исследование зависимости свойств биокатализатора от пути получения системы неразрывно связаны с вопросом, является стабильность белков в таких средах кинетически или термодинамически контролируемой. Однозначного ответа на поставленный вопрос в настоящее время дать невозможно: в литературе имеются данные, свидетельствующие в пользу обоих вариантов [10, 43].
Каталитические свойства и стабильность ферментов в комплексе с полиэлектролитом
Стабилизация ферментов в системах с органическими растворителями, как направление энзимологии, интересует исследователей, как с практической, так и с фундаментальной точек зрения, поскольку расширяет представления о взаимосвязи структуры биокатализаторов и их каталитических свойств. Методы стабилизации могут быть классифицированы следующим образом.
Введение добавок (аддитивов) в гомогенную реакционную среду. Данный метод можно отнести к наиболее мягким по воздействию на биокатализаторы. При этом добавки можно вносить как непосредственно в реакционную среду, так и в препараты ферментов при приготовлении систем. Наиболее существенные результаты данный подход позволил получить в случае суспензий биокатализаторов, например, при использовании ряда неорганических солей и краун-эфиров [71]. В целом, следует отметить, что данный подход не слишком удобен, поскольку сложно предсказать эффект той или иной добавки на конкретную биокаталитическую систему, т.к. это требует большого количества экспериментальных данных.
С рассмотренным выше подходом в значительной мере сходен метод стабилизации путем импринтинга. Этот метод заключается в целенаправленном поддержании активного центра ферментов в процессе перехода от водных растворов к практически безводным органическим средам. Для этого в водный раствор фермента перед стадией лиофилизации вводят субстрат или его близкий аналог, который удаляется из активного центра уже в реакционной среде. Данный подход позволяет не только получить биокатализаторы с повышенной каталитической активностью и стабильностью, но и регулировать конформацию активного центра фермента [72]. В настоящее время данный метод применяется, в основном, для повышения каталитической активности и стабильности суспензий ферментов. Однако он может оказаться эффективным и в случае других систем с органическими растворителями, в частности, в гомогенных водно-органических смесях.
Иммобилизация - традиционный метод стабилизации, на протяжении многих лет, успешно применяемый в химии белка и биотехнологии [6]. Данный подход направлен на фиксацию каталитически активной конформации всей белковой глобулы, ограничение ее подвижности за счет контактов с матрицей. В системах с органическими растворителями преимущественно используются препараты ферментов, иммобилизованные на нерастворимых носителях и подложках, или включенные в гели и пленки [73-75], т.е. методы физической иммобилизации.
Следует подчеркнуть, что иммобилизованные препараты ферментов могут применяться в органической среде любого состава. Однако при этом биокаталитические системы в большинстве случаев оказываются гетерогенными, что, безусловно, оказывает влияние на протекание реакций [8].
Химическая модификация позволяет целенаправленно менять свойства поверхности ферментов. Одними из наиболее распространенных реагентов для модификации ферментов с приданием им органорастворимости (в практически безводных органических растворителях) являются полиэтиленоксид и плюроники (сополимеры полиэтиленоксида и полипропиленоксида) [76].
В гомогенных водно-органических смесях для модификации ферментов с целью их стабилизации были успешно использованы полярные низкомолекулярные реагенты (ангидриды многоосновных кислот и глицериновый альдегид). Результатом такой модификации являются стабилизация и активация фермента [16].
В целом, с учетом многообразия реагентов и приемов, которые могут быть использованы для целей химической модификации белков, данный подход следует признать одним из перспективных.
Химическая модификация лежит в основе еще одного стабилизационного подхода, заключающегося в использовании поперечно сшитых кристаллов фермента (ПШКФ). В данном случае с бифункциональным сшивающим агентом взаимодействуют предварительно приготовленные кристаллы. Далее сшитые кристаллы суспендируют в практически безводных органических растворителях или помещают в водно-органические смеси. ПШКФ отличает повышенная каталитическая активность и термостабильность по сравнению с суспензиями аморфных лиофилизованных ферментов, кроме того, они используются для проведения структурных и термодинамических исследований [77, 78].
Подходы, основанные на использовании мутантних ферментов, наиболее сильно затрагивают структуру/природу биокатализатора. По существу в данном случае исследователь имеет дело с другим ферментом, отличающимся от исходного белка на уровне первичной структуры. В литературе описаны две различные стратегии получения мутантных ферментов с повышенной устойчивостью к инактивирующему действию органических растворителей. Первый заключается в осуществлении сайт-специфического мутагенеза на основе анализа трехмерной структуры белка и его аминокислотной последовательности. Данный подход, позволил, в частности, существенно стабилизировать гидролитические ферменты в смесях воды с диметилформамидом [79].
Другой подход заключается в моделировании условий направленной эволюции для нескольких "поколений" ферментов, подвергшихся статистическому мутагенезу. При этом на каждом этапе отбираются и подвергаются повторному мутирующему воздействию те линии ферментов, устойчивость которых в системах с органическими растворителями максимальна. При использовании данного подхода стало возможным получение мутантного субтилизина 4 поколения, каталитическая активность которого в 16 раз превосходила таковую для фермента дикого типа [80]. Метод направленной эволюции был успешно использован и в случае других ферментов [81]. Несмотря на исключительную теоретическую и практическую ценность методов, основанных на использовании мутантных ферментов, данный подход сложен, в основном, вследствие используемых методик.
Определение каталитической активности тирозиназы в системе обращенных мицелл
Поэтому можно ожидать увеличение каталитической активности тирозиназы в средах, где растворимость кислорода выше по сравнению с водой; катализ тирозиназой сопровождается полимеризацией продуктов реакции, которые, в свою очередь, являются ингибиторами тирозиназы. Реакция полимеризации хинонов является рН - зависимой, и можно предположить, что в органических средах эта реакция может быть подавлена или вообще исключена.
Наиболее полно исследования тирозиназы в органических средах описаны в обзоре [109]. Наиболее интересны исследования фермента, проведенные «напрямую» в органическом растворителе с малым содержанием воды. В работах Клибанова было продемонстрировано, что тирозиназа сохраняет свою каталитическую активность в практически «сухих» растворителях, таких как дихлорметан, хлороформ, бензол и бутилацетат [ПО, 111]. Только 0.5% воды необходимо для проявления ферментом каталитической активности. Из-за высокой растворимости кислорода в хлороформе каталитическая активность фермента в данной системе превышала активность в водных растворах. Также было показано, что в неполярных органических растворителях тирозиназа теряет свою активность вследствие ингибирования продуктами реакции. Фундаментальные исследования роли воды в органических биокаталитических тирозиназных системах описаны в работе [112]. Было обнаружено, что скорость реакции зависит от соотношения концентраций субстрата и продукта в органическом растворителе и в водной среде. Это позволило использовать параметр гидрофобности по Ганшу (log Р) - меру «пригодности» органической фазы для биокатализа. Исследования каталитической активности тирозиназы в дейтерированном хлороформе методом ЯМР-спектроскопии показали, что в хлороформе конформационная подвижность белка ограничена. Результатом этого ограничения является уменьшение субстратной специфичности фермента [109].
Интересные данные были получены при изучении термостабильности тирозиназы в неполярных органических средах. Оказалось, что тирозиназа сохраняет свою каталитическую активность в органическом растворителе при более высоких температурах, чем в воде. По-видимому, это связано с тем, что реакция денатурации фермента водно-зависимая и в отсутствие воды не протекает [113]. Исследования третичной структуры белка, проведенные методом ИК спектроскопии с дальнейшим Фурье-преобразованием, показали, что в хлороформе основными компонентами структуры являются Р-листы, тогда как в водной среде - а-спирали [114]. Это еще раз демонстрирует, при переходе из водных систем к органическим системам третичная структура фермента изменяется, что влияет на его каталитические свойства.
Тирозиназа является ферментом, катализирующим окисление большого числа фенолов - веществ, являющихся одним из опасных видов загрязнителей окружающей среды, и таким образом широко используется в биотехнологии для производства электрохимических биосенсоров, чувствительных к производным фенола.
Необходимость разработки ферментных электродов для работы в органических средах в первую очередь предопределена тем, что большинство фенолов, производимых в ряде отраслей лако-красочной и целлюлозно-бумажной промышленностей, и загрязняющих окружающую среду, плохо растворимы в водной среде, что уменьшает чувствительность «прямых» методов. Для решения этой проблемы тирозиназа, иммобилизованная на электроде, должна сохранять свою каталитическую активность в органических средах. Для этих целей используется ряд методов, одним из которых является использование для иммобилизации на электроде фермент - содержащих гидрогелей [115-119].
Однако биоэлектрохимическая активность фермента в таких системах не превышает 20%. Другой метод стабилизации фермента на поверхности электрода с сохранением его каталитической активности - использование смеси фермента с соединениями способными к электрополимеризации, для «прямой» иммобилизации на электроде. В качестве таких соединений может использоваться, например, биотин [120]. К сожалению, в литературе представлены только первичные данные, показывающие потенциальную воможность использования этого метода для создания биосенсоров, так как величина электрохимического сигнала в органических средах уменьшалась на 85%. Также, для сохранения активности фермента на поверхности электрода, используется метод «пространственного разделения» молекулы фермента и органического растворителя. Для этого фермент, иммобилизованный на поверхности электрода, отделяют от органической среды различными мембранами, например, из поливинилового спирта [121], карагинана или желатина [122-125]. Однако, нельзя считать, что данные методы являются идеальными, так как фермент сохраняет в таких системах около 25% активности и процедуры создания биосенсоров достаточно сложны.
Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных мицелл
Для нативной тирозиназы Кт резко уменьшается при переходе к этанол -содержащим средам (до 10% содержания этанола), что также может быть обусловлено изменением конформации белка.
При концентрациях этанола от 10% до 90% величина Кт увеличивается во всем диапазоне концентраций. Для тирозиназы в комплексе с полибреном, в молярном соотношении 1:50 и 1:100, в диапазоне концентраций этанола от 0% до 60%, значение Кт существенно ниже, чем для нативной формы и для других комплексов (рис. 6.8, кривые 3 и 4). Указанное снижение величины Кт обуславливает увеличение константы специфичности (соотношение между наблюдаемой константой скорости и константой Михаэлиса, k2IK в 10 раз (рис. 6.9, кривые 3 и 4). Отметим, что в водно-органических смесях параметр Кт не всегда можно однозначно интерпретировать, так как эффективность связывания субстрата зависит от распределения его между ближайшим к ферменту слоем растворителя и объемом раствора. В то же время, увеличение Кт при увеличении концентрации органических растворителей - характерное явление для ферментов в случае, когда образование фермент-субстратного комплекса определяется, главным образом, гидрофобными взаимодействиями.
Таким образом, анализируя полученные данные, можно сказать, что образование нековал ентных комплексов тирозиназы с катионным полиэлектролитом (полибреном) приводит к: - увеличению каталитической активности тирозиназы в водных растворах при кислых рН, т.е. наблюдается положительный активационный эффект комплексообразования; - сохранению каталитической активности фермента в полярном органическом растворителе (этаноле) вплоть до 70% его содержания, т.е. наблюдается положительный стабилизационный эффект комплексообразования.
Оба этих эффекта сопровождаются уменьшением кажущийся константы Михаэлиса и наиболее выражены для комплекса 100. Полученные результаты позволяют использовать нековалентные комплексы тирозиназы с полибреном для создания биосенсоров для определения фенолов и их производных как в водной среде так и в полярных органических средах.
Наряду с полярными водно-органическими средами, на различных этапах пробоподготовки при анализе фенолов используются и неполярные органические растворители, такие как октан. Поэтому разработка системы на основе октана, в которой фермент сохранил бы свою каталитическую активность, является актуальной биоаналитической задачей.
Одним из возможных решений этой задачи можно считать систему обращенных мицелл: ПАВ - вода - октан, используемую в качестве среды для ферментативной реакции. Из рис. 6.10 видно, что профиль каталитической активности тирозиназы, в зависимости от степени гидратации мицелл, имеет два максимума: при степенях гидратации w0 12 и 25. Пик каталитической активности при wo 25 более выражен и константа скорости ферментативной реакции соизмерима с водной системой. Следует отметить, что профиль Кт от степени гидратации при степени гидратации 25 имеет минимум, что может быть обусловлено повышением локальной концентрации субстрата и в координатах kcJKm специфичность несколько превышает водный уровень (рис. 6.10).
В основе работы тирозиназного электрода лежит реакция восстановления кислорода, катализируемая тирозиназой в присутствии фенолов: при этом хинон, образующийся в процессе ферментативного цикла, электрохимически восстанавливается/регенерируется на электроде, тем самым завершая биоэлектрокаталитический цикл, далее снова вступая в ферментативную реакцию (рис. 6.11).
Для определения оптимальных условий биоэлектрокатализа была исследована рН-зависимость реакции восстановления кислорода, катализируемая тирозиназой иммобилизованной на поверхности электрода. В качестве медиатора - переносчика электронов между электродом и активным центром фермента использовался пирокатехин. При сравнении рН зависимостей каталитической активности тирозиназы в гомогенной фазе и тирозиназы адсорбированной на золотом и графитовом электродах, в гетерогенной системе получен сдвиг оптимума каталитической активности на 0.5 единиц рН в более кислую область (рис. 6.12). «Кислый» сдвиг рН оптимума, наблюдаемый для иммобилизованного фермента, в некоторой степени позволяет ослабить негативное влияние неферментативной реакции полимеризации на эффективность определения фенолов. Полученные данные коррелируют с данными, представленными в литературе для графитовых электродов, на поверхности которых иммобилизована тирозиназа [138, 139]. Так как рН 6.0 представляет рН оптимум биоэлектрокатализа иммобилизованной тирозиназой, то все последующие электрохимические измерения были проведены при рН 6.0.
На рис. 6.13 приведены типичные циклические вольтамперограммы полученные для золотого и графитового электрода в водном буферном растворе в отсутствие и в присутствие пирокатехина и для электрода, модифицированного тирозиназой (физическая адсорбция). В отсутствие тирозиназы, электрохимическое окисление - восстановление пирокатехина наблюдается в диапазоне потенциалов +300 -5- -100 мВ (рис. 6.13, кривая 2).
![Сравнительное изучение процессов стабилизации атомов отдачи азота-13 в системах жидкость-газ, влияние параметров системы. Получение [13N]-аммония](/i/i/4321/49646.png "Сравнительное изучение процессов стабилизации атомов отдачи азота-13 в системах жидкость-газ, влияние параметров системы. Получение [13N]-аммония Федорова Ольга Сталлитовна")
