Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Механизмы иммуномодулирующего действия тиреоидных гормонов и изменения функций иммунной системы при тиреотоксикозе (обзор литературы) 12
Глава 2. Материалы и методы 30
Глава 3. Влияние агониста и антагониста бета-адренорецепторов на иммунный ответ при тиреотоксикозе
3.1. Оценка степени тяжести тиреотоксикоза и нейроэндокринных сдвигов, общая характеристика использованной экспериментальной модели 48
3.2. Изменение иммунного ответа при введении агониста и антагониста р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза, смоделированного введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг 69
3.3. Иммуномодулирующие эффекты агониста и антагониста р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза, смоделированного введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг 86
Глава 4. Влияние агониста и антагониста бета-адренорецепторов на функции фагоцитирующих клеток периферической крови при экспериментальном тиреотоксикозе
4.1. Влияние агониста и антагониста р-адренорецепторов на изменение показателей фагоцитарной активности и количественного состава лейкоцитов периферической крови крыс при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг 100
4.2. Влияние агониста и антагониста бета-адренорецепторов на изменение показателей фагоцитарной активности и количественного состава лейкоцитов периферической крови крыс при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг 115
Глава 5. Исследование влияния тироксина и агонистов адренорецепторов в системе in vitro на пролиферативный ответ лимфоцитов и геродукцию иммуноглобулинов
5.1. Влияние тироксина на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с конканавалином А 130
5.2. Влияние тироксина и агонистов адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с митогеиом лаконоса 131
5.3. Влияние тироксина и агонистов адренорецепторов на продукцию IgM и IgG в культурах с митогеном лаконоса 138
Обсуждение 145
Выводы 159
Список литературы 161
- Оценка степени тяжести тиреотоксикоза и нейроэндокринных сдвигов, общая характеристика использованной экспериментальной модели
- Иммуномодулирующие эффекты агониста и антагониста р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза, смоделированного введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг
- Влияние агониста и антагониста бета-адренорецепторов на изменение показателей фагоцитарной активности и количественного состава лейкоцитов периферической крови крыс при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг
- Влияние тироксина и агонистов адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с митогеиом лаконоса
Введение к работе
Актуальность проблемы. Тиреоидные гормоны и адренергические соединения играют важную роль в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы в норме и при различных патологических состояниях [Корнева Е.А. и др., 1978, 1988, 1998; Бахметьев Б.А., 1986; Абрамов В.В., 1988, 1991; Кеворков Н.Н., 1995; Sanders V.M., 2006; Hodkinson C.F. et al, 2009; Riether С et al., 2011]. Участие тиреоидных гормонов в формировании иммунной системы в онтогенезе продемонстрировано еще в 70-80-х гг. в условиях экспериментального гипотиреоза [Fabris N., 1973, 1980]. В последующем получены дополнительные данные о нарушении развития клеток иммунной системы у мышей с дефектами генов, кодирующих разные изоформы тиреоидных рецепторов [Arpin С. et al., 2000; Dorshkind К., Horseman N.D., 2000]. Достаточно детально изучены механизмы влияния тиреоидных гормонов на иммунный ответ, кооперацию Т- и В-лимфоцитов, формирование основных субпопуляций Т-лимфоцитов, процессы антигеннезависимого созревания Т- и В-клеток в условиях экспериментального тиреотоксикоза разной степени тяжести [Кеворков Н.Н., Бахметьев Б.А., 1984; Бахметьев Б.А., 1986; Кеворков Н.Н., 1995]. Введение трийодтиронина усиливает экспорт Т-лимфоцитов из тимуса в лимфатические узлы и способствует перераспределению ранних тимических эмигрантов между лимфатическими узлами и селезенкой [Ribeiro-Carvalho М.М. et al., 2007].
Известно, что тиреоидные гормоны повышают экспрессию Р" адренорецепторов и/или внутриклеточную трансдукцию с них сигнала в клетках-мишенях различных органов [Zwaveling J., 1996; Pappas М. et al., 2009]. Показано, что при экспериментальном тиреотоксикозе существенно модифицируется направленность действия адреналина на функции фагоцитирующих клеток, что указывает на вовлеченность адренергических механизмов в иммуномо-дулирующее действие тироксина [Ланин Д.В., Шилов Ю.И., 2006, 2009]. Однако участие адренергических механизмов в реализации иммуномодулирующих эффектов тиреоидных гормонов изучено недостаточно.
Цель работы - исследование механизмов адренергической регуляции функций иммунной системы при экспериментальном тиреотоксикозе и взаимодействия агонистов адренорецепторов с тироксином in vitro.
Задачи исследования
Изучить влияние агониста и антагониста Р-адренергических рецепторов на гуморальный и клеточноопосредованный иммунный ответ в системе in vivo у крыс при моделировании экспериментального тиреотоксикоза разной степени выраженности.
Исследовать эффекты агониста и антагониста Р-адренорецепторов при экспериментальном тиреотоксикозе на функции фагоцитирующих клеток пе-
риферической крови.
3. Оценить в системе in vitro влияние тироксина на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с конканавалином А и взаимосвязь иммуномоду-лирующего действия тироксина и агонистов Р-, аг, аг-адренорецепторов на пролиферацию лимфоцитов и продукцию иммуноглобулинов М и G в культурах клеток практически здоровых людей-добровольцев с митогеном лаконоса.
Научная новизна. На основании впервые проведенного комплексного исследования взаимодействия адренергических соединений и тироксина при экспериментальном тиреотоксикозе и в культурах мононуклеарных клеток обосновано участие адренергической регуляции в изменениях функций клеток иммунной системы тиреоидными гормонами.
Показано, что при экспериментальном тиреотоксикозе у крыс тироксин проявляет дозозависимое действие на антителообразование и реакцию гиперчувствительности замедленного типа при локальной форме иммунного ответа. При тиреотоксикозе, вызванном 14-дневным введением тироксина в дозах 4 и 40 мг/кг в сутки, развивается иммуносупрессия, а на фоне введения гормона в дозе 0,04 мг/кг в сутки - стимуляция гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа. Показано, что введение животным с тиреотоксикозом аго-ниста или антагониста Р-адренорецепторов существенно изменяет направленность изменения состояния иммунной системы при тиреотоксикозе. Введение агониста Р-адренорецепторов гексопреналина сульфата приводит к отмене иммуностимулирующего эффекта тироксина в дозе 0,04 мг/кг в сутки и усиливает проявления, вызываемые тироксином в дозе 4 мг/кг в сутки. Антагонист Р-адренорецепторов периферического действия соталола гидрохлорид усиливает влияние тироксина в дозе 0,04 мг/кг в сутки и отменяет супрессивное действие гормона в суточной дозе 4 мг/кг.
Установлено, что при более тяжелой форме экспериментального тиреотоксикоза (введение тироксина в дозе 4 мг/кг в сутки) повышаются показатели нейтрофильного и моноцитарного фагоцитоза. Агонист Р-адренорецепторов на этом фоне отменяет стимулирующий эффект тиреотоксикоза на нейтрофиль-ный фагоцитоз, а антагонист Р-адренорецепторов вызывает еще большую активацию фагоцитоза. При более легкой форме тиреотоксикоза (введение тироксина в дозе 0,04 мг/кг/сутки) повышаются только относительные показатели нейтрофильного фагоцитоза. Агонист Р-адренорецепторов отменяет этот эффект тиреотоксикоза, а использование антагониста Р-адренорецепторов приводит к повышению и относительных, и абсолютных показателей фагоцитоза.
Установлено, что тироксин стимулирует пролиферацию лимфоцитов в присутствии высокой концентрации Т-клеточного митогена и снижает пролиферативный ответ в культурах с тимусзависимым В-клеточным митогеном с одновременным повышением продукции иммуноглобулинов G. Адренергиче-
ские соединения меняют направленность изменения пролиферативного ответа лимфоцитов и продукции иммуноглобулина G при внесении в культуры тироксина.
Теоретическая и практическая значимость работы. В теоретическом плане исследования существенно расширяют представления о механизмах взаимодействия адренергических соединений и тиреоидных гормонов при модуляции реакций нео- и палеоиммунитета, позволяют обосновать их участие в изменениях функций иммунной системы при тиреотоксикозе.
В практическом плане научные результаты демонстрируют возможность использования антагонистов Р-адренорецепторов для регуляции функций иммунной системы и прогнозирования их иммуномодулирующих эффектов при тиреотоксикозе, позволяют оценить возможные последствия применения других лекарственных препаратов, обладающих адренергическим действием, при этой патологии в клинике.
Основные положения диссертации используются в лекционных курсах «Иммунология», «Экспериментальные модели в патологии», «Иммунопатология», «Нейроэндокринная регуляция иммуногенеза» кафедры микробиологии и иммунологии биологического факультета ФГБОУ ВПО «Пермский государственный национальный исследовательский университет» (614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15), при чтении лекций и на практических занятиях со студентами лечебного и педиатрического факультетов кафедры иммунологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера» Минздравсоцразвития РФ (614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26).
Положения, выносимые на защиту
При более тяжелой форме экспериментального тиреотоксикоза развивается супрессия антителогенеза и реакции гиперчувствительности замедленного типа при локальной форме иммунного ответа, а при более легкой - их стимуляция. Бета-адренергические соединения существенно модифицируют эти изменения. Агонист Р-адренорецепторов при более тяжелой форме тиреотоксикоза усиливает проявления иммуносупрессии, а при более легкой - отменяет стимуляцию иммунного ответа. Антагонист Р-адренорецепторов при более тяжелой форме тиреотоксикоза отменяет проявления иммунодепрессии, а при более легкой - потенцирует иммуностимуляцию.
При экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг, значительно повышается фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови. Агонист Р-адренорецепторов при введении тироксина в суточной дозе 4 мг/кг отменяет стимуляцию нейтро-фильного фагоцитоза, а антагонист Р-адренорецепторов вызывает усиление действия тиреотоксикоза на фагоцитарную активность нейтрофилов. При более легкой форме тиреотоксикоза повышаются только относительные показатели
нейтрофильного фагоцитоза. Агонист Р-адренорецепторов отменяет этот эффект, а введение антагониста Р-адренорецепторов приводит к повышению и относительных, и абсолютных показателей. Антагонист Р-адренорецепторов обладает самостоятельным активирующим действием на нейтрофильный, моно-цитарный и эозинофильный фагоцитоз.
3. Внесение тироксина в культуры с 20 мкг/мл конканавалина А приводит к усилению пролиферативного ответа лимфоцитов. В культурах с мито геном лаконоса тироксин in vitro снижает пролиферацию лимфоцитов, не влияет на уровень иммуноглобулина М и повышает концентрацию иммуноглобулина G. При совместном внесении тироксина с Р- и осі-адренергическими агонистами в культуры с митогеном лаконоса угнетение пролиферации сохраняется, в то время как агонист осг-адренорецепторов и адреналин отменяют его. Адреналин и агонисты Р" и осг-адренорецепторов отменяют стимулирующее действие ти-
роксина в концентрации 10" М на продукцию иммуноглобулина G. Внесение в культуры агониста осі-адренорецепторов совместно с тироксином значительно снижает уровень иммуноглобулина G.
Апробация работы и публикации. Основные положения работы были представлены на Всероссийской конференции молодых ученых, посвященной памяти профессора Н.Н. Кеворкова «Иммунитет и аллергия: от эксперимента к клинике», Пермь, 2006; VI конференции иммунологов Урала, Ижевск, 2007; Региональной конференции молодых ученых с международным участием «Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии», Пермь, 2007; Объединенном иммунологическом форуме (IV Съезд иммунологов России, IX Конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция по иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге»), Санкт-Петербург, 2008; Межрегиональной научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Сибири», Томск, 2008; VII Международной конференции «Загрязнение окружающей среды, адаптация, иммунитет ІСЕР 2008», Пермь - Н. Новгород - Пермь, 2008; VII Российской конференции иммунологов Урала «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической иммунологии и аллергологии», Архангельск, 2009; 14-м Международном Конгрессе по иммунологии «Иммунология в XXI веке» Япония, 2010 (14th International Congress of Immunology. August 22-27, 2010 Kobe, Japan).
По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 5 статей в научных журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Диссертационная работа апробирована на расширенном заседании научной проблемной комиссии по клинической иммунологии, аллергологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 2011).
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 190 стр. машинописного текста, содержит 50 таблиц и 6 рисунков. Диссертация состоит из вве-
дения, обзора литературы, материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 313 источников, из них 136 отечественных и 177 зарубежных.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований по теме «Исследование механизмов регуляции иммунитета, создание и усовершенствование методов его контроля» (номер госрегистрации 01200807513). Исследования поддержаны грантами РФФИ 08-04-00424-а, 08-04-00517-а и 10-04-96092-р-Урал-а, программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Оценка степени тяжести тиреотоксикоза и нейроэндокринных сдвигов, общая характеристика использованной экспериментальной модели
В качестве основного подхода к моделированию экспериментального тиреотоксикоза разной степени тяжести у крыс была выбрана модель с 14-дневным подкожным введением L-тироксина, ранее обоснованная в работе Б.А. Бахметьева [9-11] в эксперименте на мышах. На основании анализа регрессионных зависимостей кривых доза-эффект влияния выраженности тиреотоксикоза при введении разных доз тироксина на высоту системного иммунного ответа к эритроцитам барана у мышей автором выбраны две дозы тироксина - 0,04 и 40 мг/кг, вызывающие соответственно максимальную стимуляцию или угнетение антитело-генеза в селезенке [9-16]. Поскольку в настоящей работе тиреотоксикоз моделировали у крыс, представлялось необходимым оценить его степень тяжести и выраженность нейроэндокринных сдвигов.
Интегральным показателем оценки тяжести патологических процессов является летальность животных. В ходе проведенных исследований среди животных, получавших тироксин в суточной дозе 40 мг/кг, умерло 6 особей из 11, что составляет 54,54% (табл. 5). При введении агониста р-адренорецепторов гексо-преналина сульфата на фоне тиреотоксикоза, вызванного введением тироксина в суточной дозе 40 мг/кг, погибло 50% крыс. Установлено, что при введении одно го тироксина в суточной дозе 4 мг/кг умерло 4 крысы из 16, что составило 25%. При введении на этом фоне гексопреналина сульфата погибло 29% экспериментальных животных. В группе крыс с тиреотоксикозом, вызванном введением тироксина в суточной дозе 4 мг/кг, и получавших соталола гидрохлорида погибла 1 крыса из 13 (8%). При использовании тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг как отдельно, так и совместно с адренергическими соединениями смертности экспериментальных животных не было. При оценке различий летальности животных с помощью одностороннего варианта точного метода Фишера установлено, что летальность животных, получавших тироксин в суточной дозе 40 мг/кг, статистически значимо выше, чем у крыс, получавших тироксин в дозе 0,04 мг/кг (р=0,00458). При введении только соталола гидрохлорида, одного гексопренали-на сульфата или только растворителя препаратов смертность крыс не наблюдалась. Динамика смертности в экспериментальных группах отражена на рис. 2.
Примечание. Результаты однофакторного дисперсионного анализа: для крыс, получавших тироксин в суточной дозе 0,04 мг/кг: F(5,74)=0,82207 (р 0,05) для исходной массы и Д5,74)=9,6299 (р=0,0000001) для массы на 15-е сутки; для крыс, получавших тироксин в суточной дозе 4 мг/кг: F(5,72)= 1,8402 (р 0,05) для исходной массы и F(5,72)=34,950 (р=0,000001) для массы на 15-е сутки. рм,р2-4 и т.д. - показатели статистической значимости различий между соответствующими группами животных (номера сравниваемых групп указаны в виде подстрочного индекса) по критерию Дункана; -р 0,05 к уровню исходного фона по парному /-критерию Стьюдента; а - р 0,05 между группами, получавшими тироксин в суточной дозе 0,04 и 4 мг/кг по непарному /-критерию Стьюдента.
Масса тела животных на 15-е сутки эксперимента статистически значимо отличается при тиреотоксикозе разной степени выраженности. Снижение массы тела при тиреотоксикозе обусловлено тем, что тироксин активирует тканевое дыхание и сопряженные с ним реакции катаболизма липидов, углеводов и аминокислот [155, 171]. При совместном введении с тироксином в суточной дозе 0,04 мг/кг Р-адренергического агониста гексопреналина сульфата масса тела снижается на 14-й день эксперимента до 278+3 г (р 0,05 в сравнении с исходным уровнем по парному -критерию Стьюдента, /? 0,05 по критерию Дункана в сравнении с крысами, получавшим только тироксин, и с животными контрольной группы). Масса тела крыс, получавших только один гексопреналина сульфат, не только не снижается в сравнении с контрольной группой, но и статистически значимо увеличивается в сравнении с исходным фоном. Как известно, в жировой ткани через (3-адренорецепторы и аденилатциклазную систему активируется триацилглицерол-липаза которая обеспечивает мобилизацию жира из депо [171, 253]. Взаимное усиление эффекта тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг и гесопреналина сульфата может быть связано с повышением функциональной экспрессии [3-адренорецепторов за счет описанного в литературе [199] повышения тироксином как экспрессии указанных рецепторов, так транедукции с них регуляторного сигнала. При совместном введении гексопреналина сульфата и тироксина в суточной дозе 4 мг/кг эффект последнего не усиливается, но сохраняется и масса тела снижается до 215±13 г (р 0,05 по отношению к показателям животных, получавших только тироксин; р 0,05 по сравнению с исходным уровнем и крысами, получавшими растворитель гормона). Полученные результаты указывают на то, что при более тяжелой форме тиреотоксикоза агонист р-адренорецепторов не усиливает снижение массы тела, по-видимому, в связи с развивающимся полным истощением жировой ткани (на вскрытии при макроскопическом осмотре жировая ткань отсутствовала).
Сходные результаты получены и при совместном введении антагониста р-адренорецепторов соталола гидрохлорида и тироксина в дозе 4 мг/кг (масса тела 221 ±12 г; /? 0,05 по отношению к показателям животных, получавших только тироксин; р 0,05 по сравнению с исходным уровнем и крысами, получавшими растворитель гормона). Масса тела крыс, получавших один соталола гидрохлорид, статистически значимо увеличивается в сравнении с исходным фоном.
Неожиданным, на первый взгляд, оказалось снижение массы тела у животных, получавших антагонист В-адренорецепторов соталола гидрохлорид совместно с тироксином в суточной дозе 0,04 мг/кг (267±7 г; р 0,05 по сравнению с исходным уровнем по парному /-критерию Стыодента; р 0,05 по критерию Дункана в сравнении с контролем, а также с крысами, получавшими только тироксин или один соталола гидрохлорид). Следует учитывать, что жировая ткань, в отличие от других тканей, характеризуется высокой экспрессией В3-адренорецепторов, через которые антагонисты В-адренорецепторов действуют как агонисты [295].
В связи с тем, что в использованной схеме эксперимента на иммунную систему оказывают влияние два регулируемых или организованных в эксперименте независимых категорийных факторов: уровень тироксина и адренергиче-ское соединение, которые могут взаимодействовать, полученные данные проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа. При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в этой серии эксперимента использовали два типа дисперсионных комплексов. В первом выделили два фактора: 1-й - тироксин (градации: 0 - нет введения тироксина экспериментальным животным; 1 - введение тироксина в суточной дозе 0,04 или 4 мг/кг; 2-й - агонист В-адренорецепторов (градации: 0 - нет введения агониста В-адренорецепторов; 1 -введение гексопреналина сульфата). Во втором типе комплексов первый фактор и его градации остались без изменения, 2-й фактор был антагонист р-адренорецепторов (градации: 0 - нет введения антагониста В-адренорецепторов; 1 - введение соталола гидрохлорида).
Установлено, что на массу тела оказывает статистически значимое влияние фактор "тироксин". Однако статистически значимого взаимодействия факторов не выявлено при введении тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг и агониста В-адренорецепторов (i7(l,47)=14,049, /7=0,000480 для фактора "тироксин", F(l,47)=0,717,/? 0,05 для агониста Р-адренорецепторов и /г(1,47)=3,298, р 0,05 для взаимодействия факторов), при введении тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг и антагониста Р-адренорецепторов (F( 1,52)= 12,932, /7=0,000718 для фактора "тироксин", /7(1,52)=10,334, /?=0,002240 для антагониста Р-адренорецепторов и F( 1,52)= 1,432, /? 0,05 для взаимодействия факторов), при введении тироксина в суточной дозе 4 мг/кг и агониста р-адренорецепторов (F( 1,50)= 119,718, р=0,000000 для фактора "тироксин", /?(1,50)=2,235, /? 0,05 для агониста р адренорецепторов и./7(1,50)=0,309,/? 0,05 для взаимодействия факторов). Тем не менее, при введении тироксина в суточной дозе 4 мг/кг на фоне блокады р-адренорецепторов соталолом гидрохлоридом наблюдается статистически значимое взаимодействие факторов (F( 1,47)=146,543, р=0,000000 для фактора тироксин, i7(l,47)=0,389, /? 0,05 для антагониста Р-адренорецепторов и /?(1,47)=6,988, /7=0,011111 для взаимодействия факторов). По-видимому, этот эффект связан с частичной отменой соталолом гидрохлоридом катаболического эффекта тироксина, которая хотя и была статистически незначимой при анализе по апостериорному критерию Дункана (см. табл. 6), но выявляется при двухфакторном дисперсионном анализе.
Таким образом, при более тяжелой форме экспериментального тиреотоксикоза наблюдается более выраженное снижение массы тела; агонист и антагонист Р-адренорецепторов практически не влияют на снижение массы тела при более тяжелой форме тиреотоксикоза, но усиливают его при более легкой.
Иммуномодулирующие эффекты агониста и антагониста р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза, смоделированного введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг
При анализе изменения антителообразования на уровне регионарного лимфатического узла установлено, что введение тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг приводит к увеличению количества ЯСК и АОК (табл. 19). При введении агониста р-адренорецепторов гексопреналина сульфата клсточность и число АОК не отличается от показателей контроля. В условиях совместного введения тироксина и агониста Р-адренорецепторов наблюдается отмена стимулирующего эффекта тироксина на количество ЯСК и АОК в регионарном лимфатическом узле. При введении животным только антагониста Р-адренорецепторов соталола гидрохлорида изменение числа ЯСК и АОК в правом лимфатическом узле не происходит. При фармакологической блокаде Р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза изменения стимулирующего эффекта тироксина не наблюдается.
При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в 1-й, 2-й, 4-й и 6-й группах показано, что на относительное число АОК в регионарном лимфатическом узле оказывает влияние фактор "тироксин" и его взаимодействие с фактором "агонист р-адренорецепторов" (/7(1,47)=5,303; /?=0,025761 для тироксина, Я1,47)=1,837;/? 0,05 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=6,314;/7=0,015465 для взаимодействия двух факторов; рис. 5А). На абсолютное число АОК в регионарном лимфатическом узле статистически значимо оказывает влияние только взаимодействие эффектов тироксина и агониста Р-адренорецепторов (/г(1,47)=3,31; /? 0,05 для тироксина, F(l,47)=2,45; р 0,05 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=9,39;/?=0,003601 для взаимодействия двух факторов; см. рис. 5Б). Аналогичная ситуация наблюдается и при оценке изменения числа ЯСК (F(l,47)=0,8238;/? 0,05 для тироксина, F(l,47}=2,2255;/? 0,05 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=6,5513;/7=0,013756 для взаимодействия двух факторов).
Двухфакторный дисперсионный анализ в комплексе, сформированном из данных 1-й, 3-й, 5-й и 6-й групп, выявил статистически значимое влияние фактора только фактора "тироксин" на абсолютное и относительное число АОК в регионарном лимфатическом узле при отсутствии статистически значимого влияния фактора "антагонист р-адренорецепторов" и его взаимодействия с фактором "тироксин" (для относительного числа АОК: F(l,52)=16,610;/?=0,000151 для тироксина, F(l,52)=0,932; р 0,05 для соталола гидрохлорида и F(l,52)=0,757; /? 0,05 для взаимодействия двух факторов; для абсолютного числа АОК: F(l,52)=14,025; /7=0,000450 для тироксина, F(l,52)=0,253; р 0,05 для соталола гидрохлорида и F(l,52)=0,376;/? 0,05 для взаимодействия двух факторов). Аналогичная ситуация отмечена и для изменения числа ЯСК (F(l,52)=8,1956; /?=0,006041 для тироксина, F(l,52)=0,002; /? 0,05 для соталола гидрохлорида и F(l,52)=0,010;/? 0,05 для взаимодействия двух факторов).
В отдаленном лимфатическом узле на фоне тиреотоксикоза, вызванного введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг, число ЯСК и АОК увеличивается (табл. 20), однако эти показатели значительно ниже, чем в регионарном лимфатическом узле (р 0,05 по парному критерию Стыодента). Введение агониста Р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза не влияет на число ЯСК в левом лимфатическом узле и вызывает снижение абсолютного числа АОК до уровня контрольной группы, а относительного количества АОК до значений ниже, чем в контрольной группе. Фармакологическая блокада (3-адрепорецепторов на фоне тиреотоксикоза не влияет на эффект тироксина на клеточность органа и абсолютное число АОК в нем. Введение только гексопреналина сульфата или только соталола гидрохлорида не изменяет клеточность и число АОК в отдаленном лимфатическом узле в сравнении с контрольной группой.
При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в комплексе, сформированном из данных 1-й, 2-й, 4-й и 6-й групп, показано, что на относительное и абсолютное число АОК в отдаленном лимфатическом узле оказывагот статистически значимое влияние фактор "агонист (3-адренорецепторов" и его взаимодействие с фактором "тироксин" (для относительного числа АОК -F(l,47)=2,1242;/? 0,05 для тироксина, F( 1,47)= 15,4151; /?=0,000281 для гексопреналина сульфата и F(l,47) 28,3604; /?=0,000000 для взаимодействия двух факторов; для абсолютного числа АОК - /г(1,47)=0,012; р 0,05 для тироксина, F(l,47)=9,4016; /3=0,003585 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=23,0812; /?=0,000011 для взаимодействия двух факторов; рис. 5В, Г). На число ЯСК в отдаленном лимфатическом узле оказывал статистически значимое влияние только фактор "тироксин" (Д1,47)=4,3032; р=0,043541 для тироксина, /Д1,47)=0,0539; р 0,05 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=2,597;/? 0,05 для взаимодействия двух факторов).
При проведении дисперсионного анализа в комплексе, сформированном из данных 1-й, 3-й, 5-й и 6-й групп, выявлено статистически значимое влияние факторов "тироксин" и "антагонист р-адренорецепторов", но не их взаимодействия на относительное число АОК в отделенном лимфатическом узле (/7(1,52)=8,5221; /7=0,005171 для тироксина, F(l,52)=9,4618;/?=0,003345 для соталола гидрохлорида и /г(1,52)=0,0945; /? 0,05 для взаимодействия двух факторов). На абсолютное число АОК статистически значимое влияние оказывал только фактор "тироксин" (F(l,52)=14,609;/?=0,000355 для тироксина, F(l,52)=2,8869; /? 0,05 для соталола гидрохлорида и (1,52)=0,530;р 0,05 для взаимодействия двух факторов). Сходные закономерности выявлены и при анализе изменения числа ЯСК (F( 1,52)=9,969; /7=0,002649 для тироксина, F{ 1,52)=2,710; /? 0,05 для
При исследовании изменения антителообразования в селезенке установлено, что при введении тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг число ЯСК и АОК не изменяется (табл. 21). Введение агониста р-адренорецепторов животным на фоне тиреотоксикоза вызывает снижение числа ЯСК в селезенке по сравнению с животными, получавшими только тироксин. Подобное применение препарата не влияет на число АОК в селезенке. Фармакологическая блокада 3-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза, а также введение только гексопреналина сульфата или только соталола гидрохлорида не меняют число ЯСК и АОК в селезенке.
При проведении дисперсионного анализа в комплексе, сформированном из данных 1-й, 2-й, 4-й и 6-й групп, выявлено статистически значимое влияние только фактора "тироксин" на относительное и абсолютное число АОК в селезенке (для относительного числа АОК: F(l,47)=9,85803;/7=0,002929 для тироксина, F(l,47)=0,71057; /? 0,05 для гексопреналина сульфата и /г(1,47)=0,0997; /? 0,05 для взаимодействия двух факторов; для абсолютного числа АОК: F(l,47)=5,770;/7=0,020301 для тироксина, F0.47)=2,205;/? 0,05 для гексопреналина сульфата и /Д1,47)=0,292;/7 0,05 для взаимодействия двух факторов). В том же комплексе на число ЯСК оказывает статистически значимое влияние фактор "агонист р-адренорецепторов" и его взаимодействие с фактором "тироксин" (F(l,47)=0,005;/? 0,05 для тироксина, F(l,47)=4,533;/ =0,038511 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=4,788;/?=0,033666 для взаимодействия двух факторов).
При проведении дисперсионного анализа в комплексе, сформированном из данных 1-й, 3-й, 5-й и 6-й групп, выявлено статистически значимое влияние факторов "тироксин" и "антагонист р-адренорецепторов" на относительное число АОК в селезенке (F(l,52)=7,6839; /?=0,007711 для тироксина, F(l,52)=9,2413; /7=0,003691 для соталола гидрохлорида и /г(1,52)=0,0147; р 0,05 для взаимодействия двух факторов), фактора "тироксин" на абсолютное число АОК в селезенке (F(l,52)=6,345; /7=0,014881 для тироксина, F(l,52)=2,959; /»0,05 для соталола гидрохлорида и F(l,52)=0,006; р 0,05 для взаимодействия двух факторов). В данном комплексе на число ЯСК в селезенке не выявлено статистически значимого влияния факторов "тироксин", "антагонист р-адренорецепторов" и их взаимодействия (F(l,52)=l,416;/? 0,05 для тироксина, .Р(1,52)=1,839;/ 0,05 для сота-лола гидрохлорида и /г(1,52)=0,347;/? 0,05 для взаимодействия двух фашоров).
Как видно из табл. 22, введение тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг приводит к повышению степени выраженности воспаления при реакции ГЗТ. При введении агониста р-адренорецепторов гексопреналина сульфата на фоне тиреотоксикоза наблюдается не только отмена стимулирующего действия тироксина на выраженность реакции ГЗТ, но и существенное снижение ее в сравнении с контролем. В условиях фармакологической блокады р-адренорецепторов сотало-лом гидрохлоридом при тиреотоксикозе наблюдается усиление стимулирующего действия тироксина на выраженность реакции ГЗТ. При введении только гексопреналина сульфата отмечается депрессия реакции ГЗТ, а при введении только антагониста Р-адренорецепторов - стимуляция.
При проведении двухфакторного дисперсионного анализа в комплексе, сформированным из данных 1-й, 2-й, 4-й и 6-й групп выявлено статистически значимое влияние фактора "агонист Р-адренорецепторов" и его взаимодействия с фактором "тироксин" на выраженность реакции ГЗТ (для разности толщины: F(l,47)=0,309;/? 0,05 для тироксина, F(l,47)=27,943;/?=0,000000 для гексопреналина сульфата и /г(1,47)=7,9376; /?=0,007055 для взаимодействия двух факторов; для индекса реакции: /г(1,47)=0,8876; р 0,05 для тироксина, F(l,47)=32,310; /7=0,000000 для гексопреналина сульфата и F(l,47)=l1,416; /?=0,001471 для взаимодействия двух факторов).
Влияние агониста и антагониста бета-адренорецепторов на изменение показателей фагоцитарной активности и количественного состава лейкоцитов периферической крови крыс при экспериментальном тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг
Введение тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг не влияет на абсолютное число лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов, эозинофилов и нейтрофилов (табл. 32). При совместном введении тироксина и гексопреналина сульфата наблюдается увеличение общего числа лейкоцитов и абсолютного количества нейтрофилов в сравнении с контрольной группой. Введение только гексопреналина сульфата не оказывает влияния на количественный состав лейкоцитов периферической крови. Фармакологическая блокада Р-адренорецепторов на фоне тиреотоксикоза приводит к статистически значимому повышению количества моноцитов, эозинофилов и нейтрофилов, снижению числа лимфоцитов как по сравнению с контрольной группой, так и по сравнению с группой крыс, получавших только тироксин. Поскольку при введении одного соталола гидрохлорида отмечаются аналогичные сдвиги, можно считать, что изменения, выявленные при совместном введении тироксина и антагониста р-адренорецепторов, связаны с действием соталола.
При развитии тиреотоксикоза, вызванного введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг, увеличиваются относительные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, а абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов не меняются (табл. 33). Гексопреналина сульфат, введенный на фоне тиреотоксикоза, вызывает снижение процента фагоцитоза и фагоцитарного числа нейтрофилов по сравнению с группой крыс, получавших только тироксин, а также повышение абсолютного числа нефагоцитирующих нейтрофилов. Соїалола гидрохлорид при тиреотоксикозе повышает как относительные, так и абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов по сравнению с контрольной группой и группой животных, получавших только тироксин. Введение только гексопреналина сульфата статистически значимо увеличивает относительные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов, а введение одного соталола гидрохлорида повышает и относительные, и абсолютные показатели фагоцитарной активности нейтрофилов как по сравнению с контрольной группой, так и с крысами, получавшими только тироксин.
При развитии тиреотоксикоза, вызванного введением тироксина в суючной дозе 0,04 мг/кг, среди показателей моноцитарного фагоцитоза наблюдается статистически значимое увеличение процента фагоцитоза и снижение фагоцитарного индекса (табл. 34). При введении гексопреналина сульфата на фоне тиреотоксикоза действие тироксина на процент фагоцитоза отменяется, а фагоцитарный индекс не меняется. При совместном введении гексопреналина сульфат и тироксина наблюдается статистически значимое снижение процента активных фагоцитирующих моноцитов, чего нет при введении только тироксина. Введение соталола гидрохлорида крысам с тиреотоксикозом приводит к статистически значимому повышению и относительных, и абсолютных показателей фагоцитарной активности моноцитов по сравнению с группой крыс, получавших только тироксин. При введении одного гексопреналина сульфата повышается только процент фагоцитирующих моноцитов по сравнению с контрольной группой. Соталола гидрохлорид вызывает статистически значимое увеличение относительных и абсолютных показателей фагоцитарной активности моноцитов по сравнению с контрольной группой и животными, получавшими только тироксин.
Относительные и абсолютные показатели фагоцитарной активное і и эозинофилов при тиреотоксикозе статистически значимо не отличаются от таковых в контрольной группе (табл. 35). Введение гексопреналнна сульфата на фоне тиреотоксикоза статистически значимых изменений эозинофильного фагоцитоза не вызывает. Соталола гидрохлорид при тиреотоксикозе увеличивает и относительные, и абсолютные показатели фагоцитарной активности оозинофилов. Применение только гексопреналнна не влияет на показатели эозинофильного фагоцитоза. Соталола гидрохлорид вызывает статистически значимое повышение относительных и абсолютных показателей эозинофильного фагоцитоза.
Установлено, что при тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг, статистически значимо повышается вклад нейтрофилов и снижается вклад моноцитов в суммарный фагоцитоз (табл. 36). При введении одного соталола гидрохлорида, напротив, отмечается снижение вклада нейтрофилов и повышение вклада моноцитов в общий фагоцитоз. Эффекты соталола гидрохлорида сохраняются и при его введении крысам с тиреотоксикозом.
Анализ результатов стимулированного варианта НСТ-теста показал, что при тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг, абсолютное число НСТ-позитивных нейтрофилов статистически значимо не отличается от показателей контрольной группы (см. табл. 37). Гексопреналнна сульфат при тиреотоксикозе статистически значимо не оказывает влияния па абсолютное содержание НСТ-позитивных нейтрофилов при стагфляции зимоза-ном. При введении соталола гидрохлорида на фоне тиреотоксикоза повышается абсолютное число НСТ-позитивных нейтрофилов в стимулированном варианте теста. Применение только гексопреналнна сульфата статистически значимо не меняет абсолютное число НСТ-позитивных нейтрофилов в стимулированном варианте теста. Введение одного соталола гидрохлорида повышает абсолютное количество НСТ-позитивных нейтрофилов в стимулированном варианте теста.
При оценке спонтанного варианта НСТ-теста установлено, что тироксин в суточной дозе 0,04 мг/кг не влияет на абсолютное количество НСТ-позитивных нейтрофилов. При введении гексопреналнна сульфата на фоне тиреотоксикоза выявленные изменения сохраняются. Соталола гидрохлорид при тиреотоксикозе значительно повышает в спонтанном варианте теста абсолютное количество НСТ-позитивных.нейтрофилов. При введении одного гексопреналина сульфата статистически значимо не меняется абсолютное количество НСТ-позитивных нейтрофилов в спонтанном варианте НСТ-теста. Использование только соталола гидрохлорида значительно повышает абсолютное количество НСТ-позитивных нейтрофилов.
При оценке кислородзависимого микробицидного потенциала моноцитов в стимулированном варианте НСТ-теста установлено, что при тиреотоксикозе, вызванном введением тироксина в суточной дозе 0,04 мг/кг, абсолютное число НСТ-позитивных моноцитов статистически значимо не отличается от показателей контрольной группы (см. табл. 38). Гексопреналина сульфат при тиреотоксикозе не оказывает влияния на изучаемые показатели. Соталола гидрохлорид на фоне тиреотоксикоза статистически значимо повышает абсолютное количество НСТ-позитивных моноцитов. Использование одного гексопреналина сульфата не влияет на абсолютное количество НСТ-позитивных моноцитов.
Влияние тироксина и агонистов адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с митогеиом лаконоса
При оценке пролиферативного ответа лимфоцитов на тимусзависимый В-клеточный активатор митоген лаконоса (PWM) установлено, что тироксин не оказывает существенного влияния на индуцированную PWM пролиферацию лимфоцитов при культивировании клеток в течение 72 ч (табл. 41). При увеличении срока культивирования до 120 ч выявляется супрессивный эффект гормона в концентрации 10"8 и 10"9 М. Поскольку, как будет показано ниже, угнетения продукции IgM при этой концентрации тироксина не выявлено, а при концентрациях гормона 10 8 М выявляется и увеличение продукции IgG, можно предполагать, что снижение пролиферации В-лимфоцитов может быть обусловлено увеличением их дифференцировки в плазматические клетки. В 120-часовых культурах без митогена отмечается угнетение пролиферации лимфоцитов при концентрации тироксина 10 9М.
Агонист (3-адренорецепторов гексопреналина сульфат в культурах без тироксина не влияет на PWM-индуцированную пролиферацию лимфоцитов, но повышает ее в 72-часовых культурах без митогена (табл. 42). При совместном внесении в культуральную среду гексопреналина сульфата и тироксина в концентрации 10"9 М отмечено статистически значимое угнетение пролиферации лимфоцитов в 72-часовых культурах в сравнении с культурами с внесением только агоыиста Р-адренорецепторов. В 120-часовых культурах совместное супрессивное действие Р-адренергического агониста и гормона проявляется при концентрации тироксина 10"9 М (см. табл. 42). В целом результаты эксперимента указывают на усиление выраженности супрессивного действия Р-адренергического агониста при его совместном действии с тироксином, Полученные результаты, с одной стороны, согласуются с данными, полученными в настоящей работе в системе in vivo, ас другой - указывают на роль описанного в литературе на других. биологических системах повышения экспрессии р-адренорецепторов и/йли трансдукции с них сигнала в реализации иммуномодулирующего действия как адренергических соединений, так и тироксина.
Внесение только агониста агадренорецепторов фенилэфрина гидрохлорида не влияет на пролиферативную активность лимфоцитов в культурах с PWM при инкубации-в течение 72 и 120 ч (табл. 43). В культурах без митогена фенилэфрина гидрохлорид статистически значимо повышает пролиферацию лимфоцитов при инкубировании 72 ч. При добавлении фенилэфрина гидрохлорида совместно с тироксином изменения пролиферативного ответа лимфоцитов в 72-часовых культурах с PWM отсутствуют. В 120-часовых культурах при совместном внесении аі-адренергического агониста и тироксина в концентрации 10"9 М отмечается угнетение пролиферации лимфоцитов в сравнении с контролем. При этой же концентрации гормона агонист аі-адренорецепторов отменяет супрессивное действие тироксина на пролиферацию лимфоцитов в культурах без митогена.
Внесение только агониста оь-адренорецепторов клонидина гидрохлорид не влияет на пролиферацию лимфоцитов в 72- и 120-часовых культурах с митоге-ном лаконоса (табл. 44). При совместном воздействии клонидина гидрохлорида и тироксина изменения пролиферации клеток в 72-часовых культурах с PWM отсутствуют. В 72-часовых культурах без митогена клонидина гидрохлорид совместно с тироксином в концентрации 10"9 М статистически значимо усиливает спонтанную клеточную пролиферацию в сравнении с контролем. При этой же концентрации тироксина клонидина гидрохлорид отменяет супрессивное действие гормона на спонтанную пролиферацию и в 120-часовых культурах без митогена. В 120-часовых культурах с PWM клонидина гидрохлорид отменяет супрессивное действие тироксина в концентрации 10"9 М. Таким образом, агонист оь-адренорецепторов клонидина гидрохлорид в условиях совместного действия с тироксином проявляет преимущественно стимулирующее действие на пролифе-ративный ответ лимфоцитов, что не является случайным, т.к. стимуляция Gb-адренорецепторов приводит к ингибированию аденилатциклазы и к снижению уровня цАМФ (в отличие от (3-адренорецепторов, стимуляция которых приводит к активации аденилатциклазы и к повышению уровня цАМФ).
Добавление неселективного агониста а- и (3- адренорецепторов адреналина гидрохлорида совместно с тироксином приводит к снижению интенсивности пролиферации в 72-часовых культурах с митогеном лаконоса статистически значимому по отношению к культурам с внесением только адреналина при концентрации тироксина 10"10 М (табл. 45). В 72-часовых культурах без митогена адреналина гидрохлорид повышает спонтанную пролиферацию лимфоцитов при совместном внесении с тироксином в концентрации 10"8 М в сравнении с контролем.
Внесение только адреналина гидрохлорида статистически значимо увеличивает пролиферативный ответ лимфоцитов в 72-, но не в 120-часовых культурах с PWM и без митогена. В 120-часовых культурах без митогена адреналина гидрохлорид отменяет снижение пролиферации лимфоцитов, вызванное тироксином в концентрации 10 9 М (см. табл. 45). Внесение в культуры адреналина гидрохлорида отменяет супрессивное действие тироксина в концентрации 10"8 и 10" М с PWM. Таким образом, адреналина гидрохлорид в 72-часовых культурах способствует снижению PWM-индуцированной пролиферации лимфоцитов, в 120-часовых культурах уменьшает выраженность вызванного тироксином снижения митоген-индуцированной пролиферации. Подобная разнонаправленность совместного действия адреналина гидрохлорида и тироксина в 72- и 120-часовых культурах, возможно, связана с временными различиями экспрессии си-, а2- и (3-адренорецепторов, обусловленными временными различиями вклада в суммарную пролиферацию Т-хелперов и В-лимфоцитов, что нуждается в дальнейшей экспериментальной проверке.
Полученные при исследовании влияния тироксина и агонистов адренорецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов с митогеном лаконоса данные можно суммировать следующим образом.
Во-первых, установлено, что супрессивное действие тироксина на пролиферацию лимфоцитов периферической крови здоровых доноров при стимуляции митогеном лаконоса происходит при концентрации гормона 10 8 и 10"9 М. С учетом представленных ниже данных по изменению продукции IgM и IgG можно предполагать, что снижение пролиферации В-лимфоцитов может быть связано с увеличением их дифференцировки в плазматические клетки.
Во-вторых, выявлено усиление выраженности супрессивного действия Р" адренергического агонист а гексопреналина сульфата при его совместном действии с тироксином.
В-третьих, отмечено, что при внесении агониста оц-адренорецепторов фе-нилэфрина гидрохлорида в 120-часовые культуры с внесением тироксина в концентрации 10"9 М супрессивный эффект гормона сохраняется.
В-чегвертых, установлено, что агонист аг-адренорецепторов клонидина гидрохлорид в условиях совместного действия с тироксином отменяет супрессивное действие гормона на пролиферацию лимфоцитов в 120-часовых культурах с митогеном лаконоса при концентрациях тироксина 10"9 М.
В-пятых, неселективный агонист а- и (3- адренорецепторов в 120-часовых культурах отменяет вызванное тироксином снижение митоген-индуцированной пролиферации.
