Введение к работе
Актуальность проблемы.
Ревматоидный артрит – часто встречающееся воспалительное заболевание суставов, распространенность которого в популяции превышает 1,0% [Сигидин Я.А.,2001; Harris E.D., 1990.]. Одна из ключевых ролей в патогенезе заболевания отводится дисбалансу между продукцией провоспалительных цитокинов, таких как TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL-4, IL-10, растворимого антагониста IL-1, растворимых TNF рецепторов), с преобладанием продукции первых над вторыми [Feldman M., 1996; Dinarello C.A., 1999.].
Важное значение TNF- в патогенезе ревматоидного артрита определяется широким спектром биологических эффектов, в том числе его способностью стимулировать синтез других цитокинов, таких как IL-1, IL-6, IL-8, ГМ КСФ [Brennan F.M., 1989; Haworth, C., 1991; Butler D.M., 1995.], а также способностью вызывать деструкцию хрящевой и костной ткани [Dayer J.M., 1985; Bertolini D.R., 1986]. TNF- действует через два типа рецепторов TNFRI и TNFRII.
Одно из наиболее ярких достижений фармакотерапии воспалительных заболеваний человека связано с разработкой препаратов моноклональных антител против определенных детерминант иммунокомпетентных клеток или провоспалительных цитокинов [Breedveld F., 2000]. Одним из первых разработанных терапевтических препаратов, блокирующим эффекты TNF-, был инфликсимаб. Он представляет собой химерные моноклональные антитела, состоящие на 75% из человеческого белка и на 25% из мышиного. Инфликсимаб с высокой специфичностью связывается как с растворимым, так и с мембранно-связанным TNF-. Однако улучшение течения заболевания на фоне комбинированной терапии с использованием инфликсимаба не наблюдается приблизительно у 30% больных ревматоидным артритом (РА) [Насонов Е.Л, 2008; Lipsky P.E., 2000.] .
В последнее время накапливается все больше данных, свидетельствующих о том, что аллельный полиморфизм генов цитокинов, вносит существенный вклад в экспрессию конечных продуктов самих белков, влияя тем самым и на процессы, которые регулируют эти медиаторы. Для генов TNF и его рецепторов, а также гена IL1B известен целый ряд аллельных вариантов в промоторных и интронных областях, которые ассоциированы с повышенной или пониженной продукцией цитокина, а также с развитием целого ряда заболеваний, ключевую роль в которых играют данные цитокины (инфекционные, аутоиммунные, онкологические заболевания) [Bayley J-P., 2004; Gordon W. Duff., 2006; Qidwai T., 2011.].
В клинических исследованиях показано, что в сыворотке, в синовиальной ткани и жидкости у больных РА отмечено увеличение концентрации TNF-, коррелирующее с клиническими признаками активности ревматоидного процесса [Насонов Е.Л., 2000.]. TNF- реализует свои эффекты через 2 типа рецепторов, которые могут существовать как в мембранно-связанной, так и в растворимой форме и от уровня экспрессии которых зависят биологические эффекты этого медиатора. Использование ингибиторов TNF- является одним из наиболее эффективных методов терапии у большинства пациентов. Можно предположить, что одной из причин неэффективности использования блокаторов TNF- в терапии ревматоидного артрита у части больных РА может быть различный уровень продукции и экспрессии TNF- и его рецепторов вследствие аллельного полиморфизма их генов. Кроме того, на развитие РА оказывает влияние провоспалительный цитокин IL-1, который также обуславливает многие клинические проявления этого заболевания. Превалирующая роль в патогенезе РА IL-1 или TNF-, может влиять на эффективность применения инфликсимаба. Аллельный полиморфизм генов цитокинов и их рецепторов является одним из молекулярных механизмов, влияющих на уровень экспрессии медиатора, а, следовательно, и его участие в патогенезе, что в свою очередь может определять эффективность применения ингибитора данного цитокина в качестве метода терапии.
Следовательно, изучение влияние аллельного полиморфизма генов на уровень продукции самих медиаторов и исследование эффективности антицитокиновой терапии блокаторами TNF- у больных ревматоидным артритом в зависимости от аллельного полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов представляется актуальным и требует всестороннего изучения.
Цель работы: изучение аллельного полиморфизма генов IL1B, TNF и его рецепторов у больных ревматоидным артритом с различной эффективностью антицитокиновой терапии.
Задачи исследования:
1. Определить уровень продукции TNF- мононуклеарными клетками периферической крови условно здоровых доноров, являющихся носителями различных полиморфных вариантов промотора гена TNF в позиции -238, -308, -376, -857, -1031.
2. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов гена TNF в позициях -238, -308, -376, -857, -1031 и гена IL1B в позиции -31 и +3954 у больных ревматоидным артритом.
3. Изучить частоту встречаемости аллельных вариантов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в -1709 и -3609 у больных ревматоидным артритом.
4. Исследовать частоту встречаемости полиморфных вариантов генов провоспалительных цитокинов TNF и IL1B в группах больных ревматоидным артритом с различной эффективностью терапии инфликсимабом.
5. Оценить эффективность лечения ревматоидного артрита инфликсимабом с учетом аллельных вариантов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в -1709 и-3609.
Научная новизна работы.
В результате проведения работы впервые получены данные о взаимосвязи аллельных вариантов гена TNF в позициях -238G>A и -857C>T с уровнем его спонтанной и стимулированной Кон А продукции МНК ПК условно здоровых доноров.
Впервые выявлено сочетание генотипов -238GG/-308GG/-857CC/-1031NC, носители которого среди условно здоровых доноров характеризуются наименьшей продукцией TNF- как интактными, так и митоген-стимулированными мононуклеарными клетками в культуре при сравнении с группой носителей остальных генотипов.
Также впервые получены данные о частоте встречаемости сочетания аллельных вариантов промоторных регионов генов TNFRI в позициях -609 и -1207 и TNFRII типа в позициях -3609 и -1709 у больных ревматоидным артритом. Показано достоверное снижение частоты сочетания генотипов TNFRI-609GT + TNFRII-3609CC у больных РА.
Впервые получены данные по ассоциации аллельных вариантов генов TNF в позиции -857C>T и IL1B в позиции -31 T>C с эффективностью антицитокиновой терапии инфликсимабом у больных ревматоидным артритом. Показано, что генотип СС и аллель С полиморфизма промотора гена TNF в позиции -857C>T чаще представлены у больных с неэффективной терапией. Установлено, что генотип -31ТТ гена IL1B чаще встречается у больных с эффективной терапией.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Получены результаты о влиянии аллельного полиморфизма промотора гена TNF в позициях -238 и -857 на уровень продукции конечного белка мононуклеарными клетками, что является одной из причин индивидуальных различий в выраженности иммунных реакций, регулируемых данным медиатором, у носителей этих генотипов в норме и может являться одним из молекулярных механизмов их участия в патологических процессах. Выявлено изменение частоты встречаемости аллельных вариантов генов TNF и его рецепторов у больных РА, по сравнению с группой популяционного контроля, что может являться маркером предрасположенности к указанному патологическому процессу. Установлено, что эффективность терапии инфликсимабом зависит от аллельного полиморфизма генов TNF и IL1B. В силу чего, определение аллельных вариантов этих генов при назначении терапии инфликсимабом может помочь прогнозировать эффективность данного метода терапии у конкретного пациента.
Положения, выносимые на защиту.
1. Аллельный вариант CC гена TNF в позиции -857 ассоциирован с пониженным уровнем продукции медиатора мононуклеарными клетками
2. У больных с ревматоидным артритом наблюдается снижение частоты аллеля С в позиции -857 гена TNF, при этом среди не отвечающих на антицитокиновую терапию блокатором TNF- (инфликсимаб) больных носители аллеля С и генотипа СС в позиции -857 встречаются достоверно чаще.
Апробация материалов диссертации
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: 1. XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И.Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 8-11 июня 2009г., 2. Ежегодном конкурсе-конференции студентов и молодых ученых «Авиценна-2010», 15-16 апреля, г. Новосибирск 2010г., 3. Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии» Новосибирск 15-17 сентября 2010г., 4. Международном конгрессе EULAR 2010, 16-19 июня 2010 Италия, Рим, 5. 8 отчетной научной конференции НИИКИ СО РАМН 21-23 июня 2011г.
Публикации.
По теме диссертации опубликовано 13 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ. Подана 1 заявка на патент.
Личный вклад автора в проведение исследования.
Результаты, представленные в данной работе, получены лично автором, либо при его непосредственном участии. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной иммунологии и на базе отделения ревматологии клиники иммунопатологии ФГБУ «НИИКИ» СО РАМН.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из обзора литературы, описание материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения и выводов. Библиографический указатель включает 228 источников, из них 217 зарубежных. Работа иллюстрирована 2 рисунками и 18 таблицами.
