Введение к работе
Актуальность исследования
Выяснение важнейшей роли соотношения активации свободно-радикальных процессов и ограничивающей функции антиоксидантной системы в развитии клеточного повреждения привело к многочисленным, но не всегда успешным, попыткам применения специальных терапевтических приемов (Ланкин В.З., 2001; Qureshi G А., 2007; Меньшикова Е.Б., 2008; Miwa S.,2008; Moussa S.A., 2008; Sfrent-Comateanu R., 2008; Bondy S., 2010). Наиболее часто для коррекции подобных состояний используют лекарственные препараты с антиоксидантним действием (аскорбиновая кислота, мексидол, витамины А, Ей др.). При этом одной из наиболее вероятных причин неэффективности антиоксидантной терапии эксперты называют отсутствие четких методических подходов для определения показаний к назначению препаратов, мониторингу эффективности лечения, общепринятой методологии титрования дозы (Beckman A.J., 2003; Sagar S.M., 2005; Lawenda B.D., 2008; Monfared S.,2009; Bansal D., 2011; Showel! M.G, 2011). Учитывая, что антиоксидантная терапия является разновидностью метаболической терапии, очевидна необходимость лабораторного теста для принятия решения о назначении препарата и достаточности интервенции. А.А. Кишкун (2007) предложил использовать для этого анализ общей антиоксидантной активности (ОАОА) сыворотки крови. К тому же, в отечественных нормативных документах (Приказ МЗ РФ № 64 от 21 февраля 2000 г.) рекомендовано определять антиокислительную способность крови (п. 4.15.4.) и общую антиоксидантную активность сыворотки, плазмы крови (п. 6.3.3.).
Однако несмотря на это, в клинической лабораторной практике анализ антиоксидантной активности сыворотки крови не получил широкого распространения. Это, прежде всего, связано с отсутствием рекомендованных к клиническому применению надежных методик и коммерчески доступных реагентов, поэтому разработка нового метода анализа ОАОА в биологических объектах является актуальной задачей клинической лабораторной диагностики.
В соответствии с требованиями лабораторной аналитики этот метод должен иметь понятный молекулярный механизм, быть валидированньщ для определенных биологических объектов, иметь аналитические и экономические характеристики, пригодные для практического применения (Долгов В.В.,2009; Малахов В.Н., 2010; Меньшиков В.В.,2010). За основу для разработки нового метода определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях может быть выбрана процедура, описанная Пиллигрини с соавт. (1997) для анализа продуктов питания и фармацевтического сырья. Этот метод основан на способности различных веществ взаимодействовать с АБТС-катион-радикалом (АБТО+). Согласно требованиям надлежащей лабораторной практики при внедрении нового метода, он должен быть всесторонне изучен в строгом соответствии с отечественными и международными стандартами (USP 23, ІСН, NCCLS, FDA, ISO, CLSI, EURACHEM, IUPAC, ГОСТ-ИСО-5725 и ГОСТ-ИСО-11843). Другим важным направлением исследований при внедрении нового метода в клиническую практику является изучение интерпретируемости
результатов измерения ОАОА в биологических объектах. Для этого в первую очередь требуется изучение внутри и межиндивидуальной биологической вариабельности результатов лабораторного теста и его способности реагировать на изменение измеряемого показателя (Долгов В.В.,1995; Меньшиков В.В.,1997; Фрейзер К.Г., 2010).
На основании вышеизложенного можно заключить, что на данный момент лабораторная диагностика нуждается в лабораторном тесте для определения антиоксидантной активности в биологических жидкостях, отвечающего современным требованиям лабораторной аналитики и обладающего достаточной интерпретируемостью, получаемых результатов.
Диссертация подготовлена и выполнена по плану НИР ВолгГМУ на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии. Научное сотрудничество осуществлялось с НУЗ «Железнодорожная поликлиника №1» и ФГБУЗ "Волгоградский медицинский клинический центр ФМБА". Тема диссертации утверждена на заседании ученого совета ВолгГМУ. Работа выполнялась в рамках общего направления работы кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии.
Цель исследования
Целью исследования являлось проведение аналитической валидации и оценки применимости методов анализа общей антиоксидантной активности сыворотки крови и мочи в экспериментальной медицине и клинической лабораторной практике.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
-
Оптимизировать протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи.
-
Провести кросс-валидацию двух методов анализа ОАОА - АБТС-теста и метода обесцвечивания АБТО+ и оценить влияние веществ - компонентов биологических проб на результаты анализа ОАОА.
-
Оценить экономические и аналитические преимущества использования предлагаемого метода анализа ОАОА по сравнению с другими тестами, применяемыми для этой цели в клинической лабораторной диагностике.
-
Оценить возможность использования метода определения ОАОА для анализа образцов сыворотки крови лабораторных животных при моделировании процесса, сопровождающегося окислительным стрессом.
-
Определить применимость метода анализа ОАОА в клинической лабораторной практике для мониторинга состояния антиоксидантной системы у пациентов с сахарным диабетом (СД) 2-го типа в стадии декомпенсации.
-
Изучить возможность проведения мониторинга эффективности антиоксидантной терапии с использованием метода обесцвечивания АБТО+.
Научная новизна работы
В результате проведенной работы был разработан оптимизированный протокол фотометрического определения ОАОА сыворотки крови и мочи с помощью метода обесцвечивания АБТО+ и проведена процедура его валидации.
Впервые изучена популяционная вариабельность показателей ОАОА в сыворотке крови и моче. При этом выявлен двухмодальныи характер распределения показателя в популяции условно здоровых людей.
Впервые изучена индивидуальная вариабельность. Показано, что она в моче в 3 раза выше, чем в сыворотке крови.
Впервые был проведен корреляционный анализ взаимосвязи результатов определения ОАОА методом обесцвечивания АБТО+ с возрастом, полом, а также содержанием веществ, вносящих основной вклад в результаты анализа.
На группе здоровых добровольцев впервые показано, что ОАОА может быть повышена в результате действия антиоксидантного комплексного препарата «Лютеин Форте».
Научно-практическая значимость и внедрение результатов исследования:
На основании международных и отечественных правил, руководств, рекомендаций проведена кросс-валидация методов анализа ОАОА, в ходе которой разработан оптимизированный протокол фотометрического определения антиоксидантной активности биологических проб с помощью метода обесцвечивания АБТС*+. Новый метод анализа ОАОА превосходит уже имеющиеся коммерчески доступные аналоги по своим аналитическим характеристикам, он не требует дорогостоящего оборудования, с его использованием можно достаточно быстро и с минимальными трудовыми затратами оценить антиоксидантный статус пациента.
Определены границы референтных интервалов ОАОА в сыворотке крови и моче у условно здоровых лиц, проживающих на территории Волгоградской области.
В соответствии с ГОСТом Р 53022.2-2008 были рассчитаны биологически обоснованные критерии точности метода обесцвечивания АБТО+. Показана возможность проведения рутинного внутрилабораторного контроля качества измерений.
Установлено референтное значение различий (RCV), необходимое для использования метода в мониторинговых обследованиях при проведении терапии антиоксидантами в клинической практике.
На основании предложенного протокола метода обесцвечивания АБТО+ могут быть созданы коммерческие наборы реагентов для определения ОАОА сыворотки крови и мочи.
Положения, выносимые на защиту:
1. Метод обесцвечивания АБТО превосходит традиционно используемый АБТС-тест по своим аналитическими характеристикам: коэффициент чувствительности выше в 1,4 раза; предел обнаружения и определения ниже в 3 и 2,5 раза соответственно; воспоризводимость и сходимость лучше в 1,9-2,5 и 2-3,5 раза. Применение метода обесцвечивания АБТО+ в клинической лабораторной практике позволяет снизить экономические затраты в 14,3 раза по сравнению с АБТС-тестом.
-
Установлено, что АБТО+ в основном взаимодействует с низкомолекулярными компонентами биологических жидкостей - мочевой кислотой, цистеином, аскорбиновой кислотой, глутатионом и триптофаном. Их вклад составил около 70% при анализе сыворотки крови здоровых лиц.
-
Метод обесцвечивания АБТО+ может быть использован в экспериментальной медицине для мониторинга развития окислительного стресса при моделировании хронической эндотоксемии у крыс наравне с классическим АБТС-тестом, а также анализом продуктов перекисного окисления липидов.
4. Применение метода обесцвечивания АБТО+ позволяет оценить состояние
антиоксидантной системы у больных СД 2-го типа в стадии декомпенсации и
выявить лиц со сниженной ОАОА, а также рекомендовать и мониторировать
антиоксидантную терапию.
Внедрение в практику
Отдельные положения и выводы нашли применение в учебном процессе для подготовки врачей клинической лабораторной диагностики на кафедре теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ГБОУ ВПО «ВолгГМУ»; на кафедре клинической лабораторной диагностики ФПДО ГБОУ ВПО «СтГМА»; на кафедре клинической лабораторной диагностики с курсом медицинской техники и метрологии ГБОУ ВПО «СПбГМУ им. И.П.Павлова»; в исследовательской работе НИИ фармакологии ГБОУ ВПО ВолгГМУ и НИИ клинической и экспериментальной ревматологии РАМН.
Личный вклад автора в научное исследование
Автором непосредственно проведены все указанные в работе анализы с использованием метода обесцвечивания АБТО+, АБТС-теста, метода анализа железовосстанавливающей способности (FRAP), метода определения продуктов перекисного окисления липидов и других исследований; статистическая обработка и анализ полученного материала.
Апробация работы
Апробация диссертации состоялась на базе Волгоградского государственного медицинского университета 13 декабря 2011г. Материалы диссертации доложены на 64-й, 67-й и 68-й научных конференциях студентов и молодых ученых ВолГМУ «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2006, 2009, 2010); конференции «Молодежь и наука: итоги и перспективы YSRP 2007» (Саратов, 2007); 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (Пятигорск, 2008); Молодежном научно-практическом симпозиуме «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2010); 56-й региональной конференции «Инновационные достижения фундаментальных и прикладных медицинских исследований в развитии здравоохранения Волгоградской области» (Волгоград, 2009); Ш Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России» (Краснодар, 2009); конференции «Проблемы биомедицинской науки
третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2010); VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 4 - в журнале, рекомендованном ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, состоит из введения, семи глав (обзор литературы; материалы и методы, 5 глав, описывающих результаты собственных исследований и их обсуждение), выводов, практических рекомендаций и приложения. Список литературы включает 27 отечественных и 182 зарубежных источника. Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 18 рисунками.
