Введение к работе
Актуальность исследования
В настоящее время герпесвирусные инфекции входят в число наиболее распространенных заболеваний. По данным литературы свыше 90% людей инфицировано одним или несколькими вирусами герпеса человека [Кицак В.Я., 2005; Исаков В.А., 2006; Харламова Ф.С., 2006; Сухих Г.Т., 2010].
Особое значение активная форма герпесвирусной инфекции приобретает у беременных. Первичное заражение будущей матери, например, вирусом простого герпеса 2 типа (ВПГ-2), цитомегаловирусом (ЦМВ) или реактивация латентного вируса во время беременности, может привести к внутриутробному инфицированию плода, невынашиванию, возникновению генерализованной инфекции у новорожденного, гибели плода и др. [Краснопольский В.И., 2006; Макаров О.В., 2007; Anzivino E.,2009; Corey L.,2009].
Известно, что первой линией защиты организма от инфекционных агентов является система врожденного иммунитета [Clark R., 2005; Ганковская О.А., 2010; Ярилин А.А., 2011]. На фоне физиологического изменения баланса между системами врожденного и адаптивного иммунитета во время беременности факторы врожденного иммунитета приобретают особое значение в защите от патогенов [Gonzalez J., 2007; Сухих Г.Т., 2010].
Клетки системы врожденного иммунитета способны распознавать консервативные структуры, представленные у различных микроорганизмов. Среди распознающих структур, активирующих клеточное звено врожденного иммунитета, ключевая роль отводится Toll-подобным рецепторам (TLRs) [Takeda K., 2005; Ковальчук Л.В., 2006; Семенов Б.Ф., 2009]. Активация TLRs приводит к выработке эффекторных молекул (ИФН/, ФНО, ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-12 и др.), необходимых для защиты организма от инфекционных агентов, в том числе вирусов [Sandor F., 2005; Parker L., 2007; Gribar S., 2008].
Экспрессия TLRs показана на клетках врожденного иммунитета (макрофагах, дендритных клетках и др.), а также на эпителиальных клетках слизистых оболочек дыхательных путей, желудочно-кишечного тракта, репродуктивной системы и т.д. [Sandor F., 2005; Aflatoonian R., 2008; Chang Z., 2010]. В клетках слизистой оболочки женского репродуктивного тракта выявлена экспрессия TLR1-10 [Fazeli A., 2005; Sonnex C., 2010]. Установлено, что при герпесвирусной инфекции особое значение имеет эндосомальный TLR9, который распознает неметилированные повторы CpG ДНК [Andersen J., 2006; Bowie A., 2007; Gill N., 2008]. Взаимодействие TLR9 c лигандом запускает сигнальный путь рецептора, что приводит к активации важнейшего транскрипционного фактора клетки – NF-B, инициирующего процесс транскрипции генов провоспалительных цитокинов, хемокинов, молекул адгезии и некоторых других факторов системы врожденного иммунного ответа [Sandor F., 2005; Martin T., 2005; Семенов Б.Ф., 2009; Chang Z., 2010].
В последние годы в научной литературе стали все чаще появляться работы, указывающие на непосредственное участие иммунных механизмов в развитии различных осложнений беременности [Abrahams, 2006; Макаров О.В., 2007; Ганковская О.А., 2008]. Однако остается неисследованным TLR9-опосредованный сигнальный путь при герпесвирусной инфекции у беременных женщин. Изучение системы TLR-опосредованных сигнальных путей при активации факторов врожденного иммунитета у беременных с герпесвирусной патологией позволит на молекулярном уровне изучить патогенетические особенности развития инфекционного процесса, вызванного ВПГ-2, оценить степень участия иммунных механизмов в развитии осложнений беременности.
Цель: изучение TLR9-опосредованного сигнального пути при моделировании герпесвирусной инфекции in vitro и в клетках слизистой оболочки цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией.
Задачи:
-
Разработать на основе полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) системы для количественного определения уровней экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО.
-
Изучить динамику экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках HeLa, инфицированных ВПГ-2 in vitro.
-
Исследовать TLR9-опосредованный сигнальный путь при блокировании
NF-B специфическим ингибитором (изохеленином) в культуре клеток HeLa, инфицированных ВПГ-2. -
Определить уровни экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин с герпесвирусной патологией (ВПГ-2, ЦМВ).
-
Выявить корреляционную зависимость между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках слизистой цервикального канала беременных женщин.
-
Провести сравнительный анализ экспрессии гена ФНО в клетках слизистой цервикального канала и продукции ФНО в сыворотке крови у женщин с нормально протекающей беременностью и беременностью на фоне герпесвирусной урогенитальной инфекции.
Научная новизна
Разработан подход к оценке TLR9-опосредованного сигнального пути, основанный на определении экспрессии генов рецептора TLR9, транскрипционного фактора NF-B и эффекторной молекулы – ФНО.
Впервые показана активация TLR9-опосредованного сигнального пути в культуре клеток HeLa, инфицированных ВПГ-2.
Впервые, используя специфический ингибитор NF-B (изохеленин), доказано, что ВПГ-2-индуцированное повышение экспрессии гена ФНО в клетках цервикального канала является следствием активации TLR9-опосредованного сигнального пути.
Впервые определено увеличение экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках слизистой цервикального канала беременных с герпесвирусной урогенитальной инфекцией (УГИ).
Впервые установлено наличие статистически значимой положительной корреляции между уровнями экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках слизистой цервикального канала беременных.
Впервые показано, что увеличение экспрессии гена ФНО в клетках слизистой цервикального канала сопровождается гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови у беременных с герпесвирусной инфекцией.
Практическая значимость работы
На основе ПЦР в режиме реального времени разработаны лабораторные варианты систем, предназначенные для количественного определения экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО, позволяющие оценивать экспрессию генов компонентов TLR9-опосредованного сигнального пути.
На основе культуры клеток HeLa создана модель герпесвирусной инфекции in vitro, с помощью которой возможна оценка факторов врожденного иммунитета в клетках цервикального канала.
Положения, выносимые на защиту
-
Доказана ВПГ-2-индуцированная активация TLR9-опосредованного сигнального пути, приводящая к повышенной экспрессии гена ФНО, в клетках цервикального канала in vitro.
-
Герпесвирусная урогенитальная инфекция вызывает повышение уровней экспрессии генов TLR9, NF-B и ФНО в клетках слизистой цервикального канала беременных. Между показателями экспрессии исследуемых генов установлены положительные, статистически значимые корреляционные связи.
-
Активация TLR9-опосредованного сигнального пути в слизистой оболочке цервикального канала беременных с герпесвирусной патологией сопровождается локальным увеличением экспрессии гена ФНО и гиперпродукцией данного цитокина в сыворотке крови.
Внедрение результатов работы в практику
Материалы диссертации в 2010-11 гг. использовались в педагогическом процессе (лекциях и семинарских занятиях) кафедры вирусологии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы представлены на XIV Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011г.), Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2007, 2010гг.), XVI Российском Национальном Конгрессе «Человек и Лекарство» (Москва, 2010г.), 29-th Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Великобритания, Лондон, 2010г.), IV Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008г.), III Международной Пироговской студенческой научной конференции (Москва, 2008г.), Международной конференции «Генетика в России и в мире» (Москва, 2006г.).
Апробация диссертации состоялась 14 июня 2011 года на научной конференции отдела вирусологии им. О.Г. Анджапаридзе НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Публикации результатов исследования
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 5 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 135 источников, из которых 32 отечественных и 103 зарубежных. Работа выполнена на 120 страницах машинописного текста и иллюстрирована 6 таблицами и 17 рисунками.
