Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень её разработанности
Туберкулез (ТБ) относят к числу социально-значимых инфекционных заболеваний. Несмотря на то, что согласно данным ФГУ <<ЦНИИОИЗ Минздравсоцразвития РФ» заболеваемость ТБ на 100 000 населения в 2012 г. снизилась до 68,1 с 73,0 в 2011 г., растет распространенность туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя, в т.ч среди ВИЧ-инфицированных.
Точная и быстрая диагностика играет ключевую роль в контроле над заболеванием (Al-Zamel F. Detection and diagnosis of Mycobacterium tuberculosis II Expert Rev. Anti Infect. Ther. 2009. Vol.7, N 9. P. 1099-1108). В настоящее время в лабораторной диагностике ТБ применяют микробиологические и молекулярно-генетические методы исследования. Однако каждый из них имеет свои ограничения, связанные с трудоёмкостью, длительностью, а также с невозможностью выявления Mycobacterium tuberculosis (Mtb) в мокроте, в частности, при латентной туберкулезной инфекции (ЛТБИ). В этих случаях большое значение приобретают иммунологические методы исследования. На протяжении десятилетий с этой целью применяли кожно-аллергические пробы Манту и Пирке. Однако, с момента введения в нашей стране массовой вакцинации новорожденных авирулентным штаммом Mycobacterium bovis (М. bovis) BCG в 1949 г., диагностическое значение пробы с туберкулином снизилось из-за перекрестной сенсибилизации организма вакцинным штаммом М. bovis BCG и вирулентными штаммами Mtb при инфицировании (Митинская Л. А. Новые технологии при профилактике, выявлении, диагностике и лечении туберкулеза у детей // Проблемы туберкулеза. 2003. №1. С. 19-25), а также по той причине, что в качестве антигена используют PPD (purified protein derivate) - смесь более 200 антигенов, получаемых из микобактерий-возбудителей туберкулеза человека и крупного рогатого скота (Литвинов В.И. Латентная туберкулезная инфекция -миф или реальность? // Туберкулез и болезни легких. 2011. № 6. С. 3-9). В современных условиях доля ложноположительных реакций Манту составляет от 40 % до 90% (Белушков В.В. Значение диаскинтеста и квантиферонового теста в диагностике туберкулеза у детей // Фундаментальные исследования. 2012. № 7 (часть 1). С. 34-39).
В результате полной расшифровки генома Mtb (Cole S.T. Deciphering the biology of Mycobacterium Tuberculosis from the complete genome sequence II Nature. 1998. Vol.393, N 6685. P. 537-544) и M. bovis BCG были идентифицированы гены, контролирующие экспрессию белков-антигенов, используемых в недавно разработанных тестах для оценки противотуберкулёзного клеточного иммунного ответа. К их числу следует отнести кожную пробу Диаскинтест и клеточный тест in vitro QuantiFERONTB Gold In-Tube. Последний основан на количественном определении специфической продукции интерферона-гамма (IFNyag), индуцированной антигенами ESAT6, CFP10 и ТВ 7.7 (р4). Оба теста показали высокую специфичность выявления туберкулезного инфицирования у здоровых вакцинированных лиц, однако они не позволяют дифференцировать активный туберкулез от латентного (Pai М. Systematic review: T-cell-based assays
for the diagnosis of latent tuberculosis infection: an update II Ann Intern Med. 2008. Vol.149, N 3. P. 177-184). В связи с этим активно ведется поиск новых альтернативных биомаркеров и методов оценки клеточного иммунного ответа у инфицированных и больных ТБ.
Определенные успехи были достигнуты и в разработке тестов для диагностики ТБ на основе оценки гуморального иммунного ответа с использованием различных видоспецифичных антигенов Mtb. Показано, что применение индивидуальных рекомбинантных антигенов для выявления специфических антител повышает специфичность анализа, значительно уменьшая при этом его чувствительность. Для решения этой проблемы предлагается использовать не один антиген, а их комбинацию, что позволяет значительно повысить чувствительность метода при сохранении его высокой специфичности (Wu X. et al. Comparision of antibody responses to seventeen antigens from Mycobacterium tuberculosis II Clinica Chim Acta. 2010. Vol. 411, Issues 19-20. P. 1520-1528).
Таким образом, в связи с появлением новых методов оценки клеточного и гуморального иммунного ответа при ТБ легких требуется, с одной стороны, углубленное изучение их диагностической значимости, а с другой стороны, их дальнейшее совершенствование в целях повышения эффективности дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ.
Цель исследования
Поиск информативных иммунологических биомаркеров и разработка алгоритма, позволяющего дифференцировать активный туберкулез легких от латентной туберкулезной инфекции.
Задачи исследования:
-
Оценить информативность определения антиген-индуцированной продукции IFNy в плазме крови при туберкулезе легких у взрослых.
-
Изучить спонтанную и специфическую антиген-индуцированную продукцию EGF, MIP-ip, VEGF, IL-2, IL-4, IL-6, IL-la, IFN-a2, TGFa, TNFa, sIL-2Ra, sCD40L, IP-10 в плазме крови больных ТБ легких, контактных лиц и здоровых доноров.
-
Оценить эффективность использования комбинации биомаркеров активного ТБ легких при исследовании цитокинового профиля с применением технологии хМар.
-
Разработать иммуно ферментную тест-систему для определения специфических антител класса IgG к рекомбинантным антигенам CBD-CFP10, CBD-ESAT6, ESAT6-CFP10, CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3 Mtb.
-
Оценить значимость определения неоптерина и специфических антител класса IgG в сыворотке крови для лабораторной диагностики ТБ легких.
6. Разработать алгоритм иммунодиагностики ТБ легких с использованием
наиболее информативных биомаркеров.
Научная новизна: - впервые разработан алгоритм дифференциальной диагностики активного ТБ и ЛТБИ на основе определения комплекса специфической антиген-индуцированной продукции IL-6 и IFNy и спонтанной продукции TGFa;
доказана эффективность определения специфической антиген-индуцированной продукции IP-10 и IL-2 в плазме крови, в качестве альтернативных цитокину IFNy, для диагностики туберкулезного инфицирования;
разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb - рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии;
- впервые разработан двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ, в
котором на 1 этапе выявляют туберкулезное инфицирование путем определения
специфической антиген-индуцированной продукции IFNy, IP-10 и/или IL-2, а на
втором этапе, для диагностики активного ТБ легких проводят количественное
определение цитокинов IFNy/TGFa/IL-б, неоптерина и/или специфических
антител класса IgG к рекомбинантному белку CBD-P38 и лизатному антигену
PPDN3.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Проведено сравнительное исследование эффективности современных иммунологических методов лабораторной диагностики ТБ легких.
Разработана иммуноферментная тест-система для определения специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb, которая позволяет диагностировать активный ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.
Разработан алгоритм дифференциальной диагностики латентной туберкулезной инфекции и активного ТБ легких. Применение разработанного алгоритма иммунологической диагностики туберкулеза позволяет повысить эффективность выявления лиц с ЛТБИ, которые являются «группой риска» по развитию данного заболевания, для диспансерного наблюдения.
Разработанный в рамках настоящего диссертационного исследования алгоритм может быть основой для проведения дальнейших валидационных исследований на различных группах пациентов. Материалы диссертации могут быть включены в учебные программы медицинских высших учебных заведений и факультетов усовершенствования врачей.
Результаты исследования используются в учебном процессе на кафедре технологии микробиологического синтеза ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)», а именно, на практических занятиях по учебной дисциплине «Иммунобиотехнология» для магистрантов 1 курса, обучающихся по направлению 240700.68 - «Биотехнология».
Получено решение о выдаче двух патентов Российской Федерации на изобретения: «Способ диагностики туберкулеза легких» (заявка №2012128311, решение о выдаче патента от 25.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина И.Ю.) и «Способ диагностики туберкулезного инфицирования» (заявка №2012128312, решение о выдаче патента от 26.07.2013, авторы Васильева Е.В., Вербов В.Н., Тотолян Арег А., Лядова И.В., Никитина И.Ю.).
Методология и методы исследования
Диссертационная работа основана на обследовании 321 пациента с ТБ легких, 68 пациентов с заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии, 47 лиц, имеющих профессиональный контакт с больными ТБ и 366 условно здоровых людей. В работе были использованы современные иммунологические и серологические методы исследования с автоматизированным учетом и оценкой результатов. В процессе работы всего было исследовано 797 образцов крови. Полученные данные подвергнуты адекватной статистической обработке.
Положения, выносимые на защиту
1. Биомаркерами, альтернативными IFNy, при выявлении туберкулезного
инфицирования вне зависимости от активности ТБ легких (бактериовыделения)
могут служить IP-10 и IL-2, а комбинированное определение трех цитокинов
(TGFa, IL-6 и IFNy), по разработанному алгоритму, позволяет дифференцировать
активный ТБ легких и ЛТБИ.
2. Разработанная иммуноферментная тест-система для определения
специфических антител класса IgG к двум антигенам Mtb: рекомбинантному
белку CBD-P38 и лизатному антигену PPDN3, позволяет выявлять больных
активным ТБ легких и проводить дифференциальную диагностику ТБ с
заболеваниями легких нетуберкулезной этиологии.
3. Двухступенчатый алгоритм иммунодиагностики ТБ позволяет на первом этапе
выявлять контингент лиц, инфицированных Mtb, при определении специфической
антиген-индуцированной продукции IFNy, IP-10 и/или IL-2, и на втором этапе
проводить дифференциальную диагностику активного ТБ и латентной
туберкулезной инфекции при определении комбинации IFNy/TGFa/IL-6,
специфических антител класса IgG и/или неоптерина.
Степень достоверности и апробация результатов
Серологические и иммунологические исследования, систематизация и статистический анализ данных проведены лично автором в лаборатории биопрепаратов ФБУН «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера». Синтез рекомбинантных химерных антигенов проведен в лаборатории генной инженерии НИИ Биохимии СО РАМН. Подбор групп больных ТБ и предоставление информации, в соответствии с протоколом исследования, осуществляли врачи-фтизиатры СПбГУЗ ПТД, СПбПТД №3, ЦНИИТ РАМН, СПБ ГУЗ ГМБ № 2.
По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 7 в научных журналах и изданиях, которые включены в «Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий», рекомендуемых ВАК Министерства образования и науки РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций.
Диссертация апробирована на заседании Ученого Совета ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера (протокол № 6 от 29 мая 2013 года). Основные положения диссертационной работы были представлены на III научной школе-конференции «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2011); X конференции иммунологов Урала (Тюмень, 2012); II всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург,
2012); научно-практической конференции молодых учёных, посвященной Всемирному дню борьбы с туберкулезом «Новые технологии в эпидемиологии, диагностике и лечении туберкулёза взрослых и детей» (Москва, 2013); 15 международном конгрессе по иммунологии (Милан, Италия, 2013).
