Содержание к диссертации
Введение
Глава I Нейтрофилы, как одно из звеньев врожденного иммунитета 12
1.1 Нейтрофилы и их функции 12
1.2 Нейтрофильные внеклеточные ловушки 25
1.3 Влияние иммуностимуляторов на функциональный ответ нейтрофилов ...32
Глава II Материалы и методы исследования 38
2.1 Характеристика обследованных лиц 38
2.2 Получение сыворотки и плазмы крови 38
2.3 Истощение сыворотки и плазмы крови по комплементу 39
2.4 Истощение сыворотки и плазмы крови по специфическим иммуноглобулинам 39
2.5 Получение лейкоцитарной взвеси 40
2.6 Выделение нейтрофилов из периферической крови 40
2.7 Методы исследования нейтрофильных внеклеточных ловушек 40
2.7.1 Активация нейтрофилов микроорганизмами 41
2.7.2 Активация нейтрофилов иммуностимуляторами 41
2.7.3 Изучение влияния сыворотки и плазмы крови на формирование НВЛ 42
2.7.4 Изучение влияния комплемента на формирование НВЛ 43
2.7.5 Изучение влияния специфических иммуноглобулинов на формирование НВЛ 44
2.8 Обнаружение нейтрофильных внеклеточных ловушек при окраске акридиновым оранжевым, Sytox green и по Романовскому-Гимзе 44
2.9 Метод статистической обработки результатов 46
Глава III Влияние некоторых представителей микробной флоры (лактобактерий, бифидобактерий, кишечной палочки, стафилококка и грибов рода Candida) на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина 47
Глава IV Влияние комплемента и специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина 71
Глава V Влияние иммуномодуляторов «Пирогенал», «Солкотриховак», «Интерферон» и «Циклоферон» на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина 90
Заключение 105
Выводы 121
Список литературы 123
- Влияние иммуностимуляторов на функциональный ответ нейтрофилов
- Истощение сыворотки и плазмы крови по специфическим иммуноглобулинам
- Влияние некоторых представителей микробной флоры (лактобактерий, бифидобактерий, кишечной палочки, стафилококка и грибов рода Candida) на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина
- Влияние комплемента и специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина
Введение к работе
Актуальность проблемы
Более века исследователи всего мира с интересом изучают строение, физиологию нейтрофилов, биохимический состав их гранул, структуры синтезируемых ими метаболитов и роль этих клеток в регуляции иммунного и других звеньев гомеостаза [Хаитов Р.М., Пинегин Б.В., 1995; Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000; Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001; Пинегин Б.В., Маянский А.Н., 2007; Virchow R., 1897; Lehrer R.I. еt аl., 1988; Pabst M.J., 1994; Smolen J.E., 1995].
В 1908 году русский ученый И.И. Мечников получил Нобелевскую премию за открытие центральной роли фагоцитирующих клеток в неспецифической защите организма и указал на их бактерицидные свойства и способность продуцировать «секретины» [Мечников И.И., 1947].
Нейтрофилы обладают способностью захватывать бактерии и другие частицы с помощью специфических рецепторов или без их участия, убивать захваченные микроорганизмы с использованием кислородзависимых и кислороднезависимых механизмов и переваривать захваченные объекты фагоцитоза [Фрейдлин И.С., 1998]. До недавнего времени нейтрофилы рассматривались как исключительно неспецифические эффекторные клетки врожденного иммунитета, не имеющие возможность четко направлять комплекс иммунных реакций. Наиболее вероятным исходом дифференцированных нейтрофилов считался апоптоз после фагоцитоза инфекционных объектов или некроз, обусловленный, например, бактериальными токсинами.
В последнее время знание об иммунологическом репертуаре нейтрофилов значительно расширилось. Были обоснованы представления о важной роли бактерицидных продуктов, выделяемых этими клетками наружу, в противомикробной защите [Долгушин И.И., Бухарин О.В., 2001]. Brinkmann V. и соавторы в 2004 году сообщили, что нейтрофилы выбрасывают во внеклеточное пространство свой хроматин, формируя нейтрофильные внеклеточные ловушки (Neutrophil Extracellular Traps, NETs, НВЛ), состоящие из нуклеиновых кислот, гранулированных пептидов и антимикробных молекул, с ранее неизвестной целью – для изоляции и уничтожения Грам-положительных, Грам-отрицательных бактерий и грибов [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., 2009; Brinkmann V., Reichard U., et al., 2004]. Эта кислородзависимая клеточная гибель была названа термином «NETosis» [Steinberg B.E., Grinstein S., 2007]. Позднее подобное явление было обнаружено у тучных клеток и эозинофилов [Von Kockritz-Blickwede M. еt аl., 2008]. Формирование нейтрофилами внеклеточных ловушек – важный механизм врожденного иммунного ответа, когда, погибая, нейтрофил защищает организм от инфекционных патогенов [Fuchs T.A. еt аl., 2007; Wartha F., Henriques-Normark B., 2008].
Однако до сих пор четких представлений о формировании нейтрофилами внеклеточных ловушек нет.
Цель исследования
Оценить влияние представителей нормальной и условно патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека (Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Candida albicans) и иммуномодуляторов различной природы (пирогенал, солкотриховак, циклоферон, интерферон), а также гуморальных факторов (комплемент и специфические Ig) на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами периферической крови.
Задачи исследования
-
Определить влияние Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus spp., E. coli, S. aureus и C. albicans на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами в цельной гепаринизированной крови, в лейкоцитарной взвеси и нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.
-
Оценить роль плазмы, сыворотки крови и их компонентов (комплемента и специфических Ig) в секреции внеклеточной ДНК нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, в системе in vitro.
-
Изучить воздействие пирогенала, солкотриховака, циклоферона и интерферона на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина.
Научная новизна
Впервые было проведено исследование образования внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси. При этом использовались различные методы обнаружения внеклеточно расположенной нейтрофильной ДНК: фиксированные мазки цельной крови, окрашенные по Романовскому-Гимзе, оценивались при световой иммерсионной микроскопии; фиксированные препараты выделенных нейтрофилов окрашивались раствором акридинового оранжевого или Sytox green и подвергались люминесцентной микроскопии; образцы, содержащие выделенные нейтрофилы и сыворотку или плазму крови, исследовались в нативном состоянии при люминесцентной микроскопии и окраске акридиновым оранжевым. Все эти методы позволили произвести количественную оценку НВЛ по отношению к другим морфологическим формам нейтрофилов (с сегментированным и с недифференцированным ядром).
На основании количественной оценки установлен дозозависимый эффект влияния различных видов микроорганизмов и биологически активных веществ на образование НВЛ. Представители нормальной и условно-патогенной микрофлоры слизистых оболочек гениталий и кишечника человека стимулируют образование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными на двойном градиенте фиколла-верографина, но не оказывают влияния на нейтрофилы цельной гепаринизированной крови, лейкоцитарной взвеси и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы крови, независимо от концентрации микроорганизмов. При сравнительном анализе установлено, что наиболее выраженный стимулирующий эффект на формирование НВЛ оказывают Candida albicans и Lactobacillus spp.
Сыворотка и плазма крови, независимо от присутствия в них специфических иммуноглобулинов и комплемента, оказывают ингибирующее действие на внеклеточный выброс ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.
Иммуностимуляторы различной природы (пирогенал, солкотриховак, интерферон и циклоферон) оказывают активирующее влияние на секрецию хроматина нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Однако различные дозы иммуностимуляторов по-разному влияют на формирование НВЛ. Интерферон в высоких концентрациях ингибирует образование нейтрофильных внеклеточных ловушек. Пирогенал, солкотриховак и циклоферон активнее стимулируют внеклеточный выброс нейтрофильной ДНК в концентрациях, эквивалентных средней терапевтической дозе для каждого конкретного препарата.
На основании проведенного исследования был разработан метод оценки эффективности вакцины «Солкотриховак» [приоритетная справка «Способ оценки эффективности вакцин, участвующих в формировании мукозального иммунитета» № 2009102575 (003293) от 26.01.2009].
Теоретическая и практическая значимость работы
Проведенные исследования позволяют расширить представление о роли нейтрофилов в антимикробной защите организма, в частности их способности к образованию внеклеточных ДНК-овых сетей.
Полученные результаты дают возможность оценить дозозависимый эффект и селективность секреции хроматина во внеклеточное пространство нейтрофильными гранулоцитами в ответ на стимуляцию факторами микробной и немикробной природы и обосновывают возможность использования метода определения НВЛ для оценки иммунотропной активности различных препаратов.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Под действием представителей нормальной и условно-патогенной микрофлоры активируется секреция хроматина во внеклеточное пространство нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина.
-
Иммуномодуляторы оказывают стимулирующий дозозависимый эффект на образование нейтрофилами внеклеточных ловушек, при этом максимальное влияние оказывает средняя терапевтическая доза препаратов.
-
Сыворотка и плазма крови блокируют выброс нитей ДНК нейтрофилами во внеклеточное пространство. Участия специфических IgG в данном процессе не выявлено. Аутологичный комплемент в присутствии сыворотки и плазмы крови не оказывает влияния на формирование НВЛ, однако комплемент морской свинки дозозависимо стимулирует секрецию ДНК нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, этот эффект снижается после термической денатурации комплемента.
Внедрение результатов исследования
Результаты исследований внедрены в лабораторную диагностику НИИ иммунологии и в учебный процесс на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены, обсуждены и опубликованы на X – X Всероссийском научном Форуме имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге: Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции» (г. Санкт-Петербург, 2008, 2009), V Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург 2009), V итоговой научно-практической конференции молодых ученых ЧелГМА (Челябинск, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, из них в ведущих рецензируемых научных изданиях и журналах, рекомендованных ВАК – 10.
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 3-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего работы 91 отечественных и 128 иностранных авторов. Диссертация изложена на 143 страницах, включает 32 таблицы и 8 рисунков.
Влияние иммуностимуляторов на функциональный ответ нейтрофилов
На сегодняшний день в клинической практике большое распространение получила иммунотропная терапия. Учитывая, что образование нейтрофильных внеклеточных ловушек является мощным биологически активным явлением и до конца не изучено, важно выяснить, какое влияние на него оказывают наиболее широко применяемые иммуностимуляторы. Иммунотропные препараты, используемые в современной клинической практике можно разделить по происхождению действующего вещества и способу получения на группы [Тотолян А. А. и соавт., 2006]: 1. препараты эндогенной природы (природные, рекомбинантные, синтетические): иммуноглобулины, интерфероны, цитокины, моноклональные антитела против молекул иммунной системы человека; 2. препараты микробного происхождения (природные, рекомбинантные, синтетические): анатоксины, смеси лизатов бактерий, бактериальные липополисахариды, вакцины; 3. препараты животного происхождения (природные, рекомбинантные, синтетические): вакцины, пептидные экстракты тимуса, препараты селезенки, препараты костного мозга; 4. препараты растительного происхождения: индукторы интерферона; 5. препараты, не имеющие аналогов в природе: синтетические низкомолекулярные, высокомолекулярные, поверхностно-активные вещества. Традиционно считается, что на нейтрофильные гранулоциты оказывают наибольшее влияние препараты микробного и эндогенного происхождения.
Пирогенал - иммунотропный липополисахарид, оказывающий пирогенное и интерфероногенное действие. Иммуномодулятор широкого спектра действия. Главным механизмом иммуномодулирующего действия является активация системы гипоталамус - гипофиз — кора надпочечников, а также ретикулоэндотелиальной и фибринолитической систем. Оказывая влияние на функцию коры надпочечников, повышает концентрацию кортикостероидов в крови. Пирогенал обладает адъювантным, десенсибилизирующим и противовоспалительным эффектами, повышает общую и специфическую резистентность организма, влияет на терморегулирующие центры гипоталамуса, создает регулируемый пирогенный эффект. Применяют для стимулирования восстановительных процессов при заболеванях нервной системы, для рассасывания рубцов и спаек, в комплексной терапии хронических инфекционных заболеваний, в т.ч. женских половых органов, эпидидимитов и простатитов, стрептодермии и другие [Нестеров И.М., Тотолян А.А., 2007]. Основная клиническая область использования пирогенала как средства неспецифической стимулирующей терапии — хронические инфекционно-воспалительные заболевания [Ермоленко Д.К. и др., 2007]. Влияние пирогенала на иммунологические процессы изучено недостаточно, однако не исключено, что его действие также связано с интерфероногенной активностью [Пигаревский В.Е., 1978]. Препарат давно вошел в арсенал средств неспецифической терапии. Он вызывает кратковременную лейкопению, сменяющуюся лейкоцитозом, и повышает фагоцитарную функцию лейкоцитов. Увеличение количества лейкоцитов происходит, главным образом за счет палочкоядерных и сегментоядерных нейтрофилов, с одновременным повышением фагоцитарного числа, показателя завершенности фагоцитоза, активности кислой и щелочной фосфатазы, пероксидазы и цитохромоксидазы [Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985]. Действуя на клетки фагоцитарной системы, пирогенал активирует фагоцитоз, секрецию кислородных радикалов, синтез ИЛ-1, ИЛ-2, фактора некроза опухоли (ФНО-а), интерферона (ИФН-а), стимулирует кининовую систему. Подобное действие пирогенала на лейкоциты типично для всех липополисахаридов. данный препарат — компонент клеточной стенки микроорганизма Pseudomonas aeruginosa. Учитывая, что различные микроорганизмы активно стимулируют образование нейтрофильных внеклеточных ловушек (НВЛ) [Brinkmann V. et al., 2004], можно полагать, что и пирогенал влияет на этот процесс.
Солкотриховак - это вакцина, используемая для повышения мукозального иммунитета, с целью профилактики и лечения неспецифического бактериального вагиноза и трихомониаза у женщин [Нестеров И.М., Тотолян А. А., 2007]. Препарат содержит селекционные инактивированные лиофилизированные лактобациллы (коккоидные формы) 8 штаммов в эквивалентном количестве: L.rhamnosus (3 штамма), L.vaginalis (3 штамма), L.fermentum (1 штамм), L.salivarius (1 штамм) не менее 7x109 КОЕ/мл.
Адаскевич В. П. (1999) рекомендует применять эту вакцину одновременно с этиотропной терапией. Как средство монотерапии ее применение у ряда авторов вызывает осторожное отношение [Мавров И.И., 2003; Alderete J.F., 1984; Gombosa А.Р. et al., 1986; Sarach L. et al., 2004]. На сегодняшний день механизм действия вакцины связывают с индукцией гуморального звена иммунитета. Индуцированные вакцинацией антитела способствуют не только устранению микробного фактора (влагалищные трихомонады, анаэробная флора), но и восстановлению нормального микробиоценоза влагалища, нормализации рН ВС, а также стимуляции факторов местного иммунитета [Кира Е. Ф., 2001]. Под действием препарата происходит повышение уровня антител класса IgG в ответ на введение поверхностных антигенов атипичных лактобактерий, содержащихся в препарате, а также повышение общего содержания slgA в секрете влагалища, которые обеспечивают неспецифическую защиту слизистых оболочек. Однако, исследованиями ряда авторов показано, что спустя некоторое время после введения препарата содержание специфических sIgA-антител снижается до исходного уровня, но защитный эффект препарата сохраняется, снижая риск развития реинфекции. Таким образом, имеющиеся положения не достаточно убедительно объясняют механизм действия препарата.
Истощение сыворотки и плазмы крови по специфическим иммуноглобулинам
Для инактивации естественного комплемента исследуемую сыворотку крови прогревали на водяной бане при 56С в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975]. Этим же методом инактивировали комплемент в плазме крови.
В ряде опытов для оценки влияния специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови, участвовали лица с подтвержденным повышенным содержанием антител класса IgG к С. albicans, которое устанавливалось с помощью иммуноферментного анализа (Кандида- О-ИФА-БЕСТ, г.Новосибирск-117).
К осадку С. albicans (штамм 601) (1х109 клеток/мл) добавляли 0,5 мл свежей сыворотки крови, инкубировали в режиме, исключающем активацию комплемента, при +4С в течение 30 минут, встряхивая каждые 5 минут [Маянский А.Н. и др., 1982]. Затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 минут и использовали в опытах как истощенную по специфическим иммуноглобулинам сыворотку, так и опсонизированную С. albicans (штамм 601).
Плазму крови истощали по специфическим иммуноглобулинам так же. Для получения лейкоцитарной взвеси 6 мл гепаринизированной (из расчета 10 ЕД гепарина («Гедеон-Рихтер», Hyngery) на 10 мл крови) венозной крови оставляли в пробирке при комнатной температуре на 30 — 60 минут. После седиментации эритроцитов, обогащенную лейкоцитами плазму крови (лейкоцитарная взвесь) аккуратно собирали стерильным наконечником в чистые стерильные пробирки и использовали в дальнейших исследованиях.
Для выделения нейтрофилов кровь забирали из локтевой вены, добавляли гепарин из расчета 10 ЕД («Гедеон-Рихтер», Hyngery) на 10 мл крови. 2 мл гепаринизированной крови смешивали с 3 мл стерильного физиологического раствора, полученную смесь наслаивали на градиент плотности стерильных растворов фиколла-верографина (Pharmacia, Sweden; Spofa, CSSR). Плотность верхнего слоя - 1.075-1,077, нижнего - 1,093-1.095 [Wong L., 1975], объем каждого слоя - 2 мл. Через 40 минут центрифугирования при 1500 об/мин на границе градиентов образовывалось кольцо гранулоцитов с чистотой 98 — 100%, мононуклеары составляли 2% или отсутствовали. Кольцо нейтрофилов аккуратно собирали, переносили в стерильную пробирку. Клетки трижды отмывали от градиента стерильным физиологическим раствором хлорида натрия центрифугированием при 1500 об/мин 10 минут, доводили до концентрации 5x10 клеток/мл и использовали в исследованиях.
Изучение образования внеклеточных ловушек проводили после активации нейтрофилов факторами микробной и немикробной природы.
Для постановки эксперимента использовали различные концентрации трехкратно отмытой от питательной среды взвеси суточной культуры контрольных моноштаммов S. aureus («Cowan 209»), Е. coli (штамм М-17), Lactobacillus spp. (препарат "Лактобактерин сухой", фирма "ИмБио", г.Нижний Новгород), Bifidobacterium spp. (препарат "Бифидумбактерин сухой", ЗАО "Экополис", г.Ковров) и С. albicans (штамм 601). По стандарту мутности БАК — 10 (ООО "Ормет", г. Екатеринбург) получали концентрацию 1 млрд. микробных тел в 1мл (1х109/мл) [Иммунологические методы..., 1981], затем разводили в 10 и в 100 раз. Таким образом были получены концентрации бактерий 1х109/мл, 1x10 /мл и 1х107/мл. 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5x106 клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейковзвеси инкубировали при температуре +37 С в течение 30 минут в присутствии 0,1 мл взвеси микроорганизмов доведенных до различных концентраций. Для контроля использовали 1 мл взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина и доведенных до концентрации 5x106 клеток/мл, 1 мл цельной гепаринизированной крови или 1 мл лейковзвеси, инкубированных в тех же условиях, но без активаторов.
Для оценки влияния различных иммуностимуляторов на формирование НВЛ in vitro, нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали 30 минут при 37С в присутствии различных концентраций тестируемых препаратов. Для контроля гранулоциты инкубировали в тех же условиях, но без активатора.
Интерферон человеческий лейкоцитарный (интерферон альфа) (ФГУП «НПО „Микроген"», г.Пермь) — препарат для местного применения на слизистые оболочки полости носа и рта, поэтому было невозможно точно произвести перерасчет разовой терапевтической дозы на 1 мл клеточной взвеси. Исходя из этого, препарат тестировался в широком диапазоне концентраций: 500 ME на 1 миллилитр взвеси нейтрофилов, 50 МЕ/мл, 5 МЕ/мл, 0,5 МЕ/мл, 0,05 МЕ/мл, 0,005 МЕ/мл и 0,0005 МЕ/мл.
Выбранные нами иммуномодуляторы — «Циклоферон» (ООО «НТФФ „ПОЛИСАН"», г.Санкт-Петербург), «Пирогенал» (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи / Медгамал, Россия) и «Солкотриховак» (SOLCO BASEL AG, Швейцария), -имеют точную, описанную в инструкции по применению, дозировку для парентерального применения, поэтому тестируемые концентрации подбирались в соответствии с разовой терапевтической дозой для конкретного препарата, в перерасчете на 1 миллилитр взвеси нейтрофилов, выделенных на двойном градиенте фиколла-верографина. Для циклоферона была определена концентрация, соответствующая разовой терапевтической дозе, - 0,5 мкг/мл, в 10 раз меньше - 0,05 мкг/мл, а также в 10 и в 100 раз больше - 5 мкг/мл и 50 мкг/мл, соответственно. Мукозальную вакцину «Солкотриховак» использовали в концентрациях 0,002 мкл/мл, 0,02 мкл/мл (эквивалент разовой терапевтической дозы), 0,2 мкл/мл и 2 мкл/мл. Действие пирогенала исследовали в концентрациях: 0,002 мкг/мл, 0,02 мкг/мл (соответствует разовой терапевтической дозе), 0,2 мкг/мл и 2 мкг/мл. Аутологичную сыворотку или плазму крови, полученные способом, описанным в пункте 2.2, и взвесь нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, инкубировали в присутствии С. albicans (штамм 601) при 37С в течение 30 минут. Для контроля инкубировали в тех же условиях взвесь нейтрофилов без активаторов, взвесь нейтрофилов в присутствии сыворотки или плазмы и взвесь нейтрофилов в присутствии С. albicans (штамм 601).
Влияние некоторых представителей микробной флоры (лактобактерий, бифидобактерий, кишечной палочки, стафилококка и грибов рода Candida) на образование внеклеточных ловушек нейтрофилами цельной гепаринизированной крови, лейковзвеси и нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина
Для количественной оценки уровня внеклеточных ловушек образованных нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, нами был использован метод индикации НВЛ при окраске фиксированных препаратов 0,04% раствором акридинового оранжевого [Долгушин И.И., Андреева Ю.С., патент РФ на изобретение № 2384844]. Авторы данного метода предложили количественно оценивать разные стадии преобразования нейтрофилов в процессе синтеза ловушек, с помощью люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм.
По морфологическим признакам визуализируемые структуры были разделены на 3 группы: 1-я группа объединяла клетки с сегментированным ядром, 2-я группа включала клетки с недифференцированным ядром и к 3-ей группе были отнесены свободно лежащие волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофилов (нейтрофильные внеклеточные ловушки). Проводился подсчет 100 структур разных групп.и определялось процентное содержание каждой морфологической единицы. При этом под термином «нейтрофилы с сегментированным ядром» подразумевались клетки с неизмененной морфологией и характерной дольчатостью ядра, окрашенного в ярко-зеленый цвет [Зеленин А.В., 1971] (рисунок 1).
Термином «нейтрофилы с недифференцированным ядром» обозначались клетки, в которых начался процесс преобразования в нейтрофильные внеклеточные ловушки, этап, когда ядерная оболочка уже растворилась и хроматин распределился по всему объему цитоплазматического пространства. При этом, диаметр клеток с недифференцированным ядром не отличался от нейтрофилов с сохраненной морфологией, либо незначительно превосходил клетки с сегментированным ядром. Нейтрофильные внеклеточные ловушки представляли собой структуры разнообразной формы и размеров, которые всегда превосходили клетки с сегментированным ядром в 2 - 3 и более раз; визуализировались как сетеподобные образования, иногда содержащие остатки ядер и цитоплазматической оболочки нейтрофилов. Внеклеточно расположенные нити ДНК нейтрофилов также окрашивались раствором акридинового оранжевого в ярко-зеленый цвет.
Кроме того, нами было проведено обнаружение внеклеточных ловушек в фиксированных препаратах нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, при окраске 0,002% раствором Sytox Green. Этот флюоресцентный краситель также предназначен для верификации ДНК при люминесцентной микроскопии, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. Такой способ окраски также позволил произвести количественную оценку образования ловушек, так как хорошо визуализировалась морфология нейтрофилов и внеклеточно расположенные волокна ДНК (рисунок 2).
При этом методе окрашивания проводили учет процентного содержания нейтрофилов с сегментированным ядром, с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Данный способ является методом выбора при исследовании ловушек в секрете слизистых оболочек и в отличии от акридинового оранжевого позволяет окрашивать только нити ДНК, в то время как акридиновый оранжевый окрашивает кант и нити муцина.
Данные методы окраски подразумевали использование люминесцентного микроскопа, поэтому мы воспользовались еще одним методом окраски фиксированных препаратов нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, с применением световой иммерсионной микроскопии - по Романовскому-Гимзе. Этот сложный краситель обычно используется в гематологических исследованиях для оценки лейкоцитарной формулы.
При окраске методом Романовского-Гимза ядра нейтрофилов становятся сине-фиолетовыми, цитоплазма - нежно-розового оттенка, а цитоплазматические гранулы — розово-фиолетового цвета (рисунок 3). В обработанных таким образом препаратах мы также выделяли нейтрофилы с сегментированным ядром, нейтрофилы с недифференцированным ядром и нейтрофильные внеклеточные ловушки, с процентным учетом этих морфологических единиц.
Кроме фиксированных препаратов, мы исследовали нативные препараты нейтрофилов, выделенных из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина. Здесь нам также было важно произвести количественный учет нейтрофилов с сегментированным ядром, нейтрофилов с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек. Для этого мы воспользовались методом окраски раствором акридинового оранжевого с оценкой в люминесцентном микроскопе.
После отработки всех методик, был произведен сравнительный анализ уровня всех морфологических форм нейтрофилов, используя выбранные нами способы окраски и микроскопии. Для этого нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, после инкубации при 37 С в течение 30 минут в присутствии физиологического раствора, были разделены на 4 группы. Первая и вторая группы проб наносились на предметное стекло, высушивались, фиксировались 96% этиловым спиртом, окрашивались 0,04% раствором акридинового оранжевого или 0,002% раствором Sytox Green и затем исследовалась при люминесцентной микроскопии. Нейтрофилы третьей группы также наносились на стекло, высушивались, фиксировались 96% этиловым спиртом, а затем окрашивались по методу Романовского-Гимза, учет проводили в световом иммерсионном микроскопе. Четвертую группу клеток окрашивали в нативном состоянии 0,04% раствором акридинового оранжевого, готовили препараты «раздавленная капля» и оценивали при люминесцентной микроскопии.
Влияние комплемента и специфических иммуноглобулинов сыворотки и плазмы крови на формирование внеклеточных ловушек нейтрофилами, выделенными из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина
В опытах использовались аутологичные сыворотка и плазма крови и нейтрофилы, выделенные на двойном градиенте фиколла-верографина.
Для получения сыворотки забиралось 6 мл крови из локтевой вены в стерильную пробирку. После формирования сгустка пробирки центрифугировали 10 минут при 3 тысячах оборотов для осаждения форменных элементов крови. Полученную сыворотку аккуратно собирали в чистую стерильную пробирку и использовали для проведения исследования.
Плазму получали из 6 мл гепаринизированнои венозной крови. Для этого пробирки с гепаринизированнои кровью после седиментации эритроцитов центрифугировали при 1,5 тысячах оборотов в течение 10 минут. Полученную плазму собирали стерильным наконечником в чистую стерильную пробирку. Далее исследования проводили по схеме, описанной для сыворотки крови.
Для постановки опыта нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601) в присутствии сыворотки или плазмы крови. Мы использовали несколько контролей: нейтрофилы в присутствии физиологического раствора, нейтрофилы в присутствии Candida albicans (штамм 601) и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы крови, в соответствии с исследованием. Все пробы инкубировали в одинаковых условиях - при 37 С в течение 30 минут. Затем нативные препараты окрашивали 0,04% раствором акридинового оранжевого в течение 5 минут и производили оценку в люминесцентном микроскопе, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. Производился подсчет нейтрофилов с сегментированным ядром, клеток с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек с процентным соотношением этих структур.
Как видно из таблиц 4.1.1 и 4.1.2, в присутствии сыворотки и плазмы крови, даже после активации С. albicans (штамм 601), по сравнению с неактивированными нейтрофилами значимых отличий показателей не происходило. Кроме того, отмечено достоверное блокирование образования НВЛ по сравнению с группой нейтрофилов, активированных С. albicans (штамм 601) без сыворотки или плазмы крови.
Для инактивации естественного комплемента исследуемую сыворотку или плазму крови прогревали на водяной бане при 56С в течение 30 минут [Мирахмедов У.М., Резникова Л.С., 1975]. Для постановки опыта нейтрофилы, выделенные из периферической крови на двойном градиенте фиколла-верографина, активировали взвесью Candida albicans (штамм 601) в присутствии прогретой сыворотки или плазмы аутологичнои крови. Мы использовали несколько контролей: нейтрофилы в присутствии физиологического раствора, нейтрофилы в присутствии Candida albicans (штамм 601) и нейтрофилы в присутствии сыворотки или плазмы (в соответствии с опытом) крови. Схема опыта представлена на рисунке 4. Все пробы инкубировали в одинаковых условиях — при 37С в течение 30 минут. Затем нативные препараты окрашивали 0,04% раствором акридинового оранжевого в течение 5 минут и производили оценку в люминесцентном микроскопе, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длинной волны 520 нм. Производился подсчет нейтрофилов с сегментированным ядром, клеток с недифференцированным ядром и нейтрофильных внеклеточных ловушек с процентным соотношением этих структур.
