Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Современные возможности фармакотерапии микозов противогрибковыми препаратами 10
1.2. Взаимодействие противогрибковых препаратов на уровне метаболизма 16
1.3. Методы оценки активности цитохромов Р450 20
1.4. Современные возможности применения гепатопротекторов в комбинированной фармакотерапии онихомикозов 27
Глава 2. Материал и методы исследования
2.1. Клиническая часть исследования 44
2.1.1. Характеристика больных, включенных в исследование 44
2.1.2. Характеристика лекарственных препаратов, применявшихся в исследовании 51
2.1.3. Методы оценки эффективности фармакотерапии онихомикозов 52
2.1.3.1. Оценка динамики клинических проявлений онихомикоза 52
2.1.3.2. Оценка динамики биохимических показателей функции печени 53
2.1.3.3. Микологическое исследование ногтевых пластин пальцев стоп и кистей 53
2.2. Электрохимическое исследование по влиянию различных гепатопротекторов на активность цитохрома Р450 ЗА4 54
2.3. Оценка активности цитохрома Р450 ЗА4 неинвазивным методом по соотношению бр-гидроксикортизол/кортизол в моче 57
2.4. Методика определения итраконазола в плазме крови 59
2.5. Статистическая обработка результатов исследования 59
Глава 3. Результаты собственных исследований 60
3.1. Динамика клинических проявлений заболевания под влиянием итраконазола и комбинаций его с гепатопротекторами 60
3.2. Динамика биохимических показателей функции печени под влиянием терапии итраконазолом и комбинаций его с гепатопротекторами 66
3.2.1. Динамика показателей цитолитического синдрома на фоне проводимой терапии итраконазолом и комбинации его с гепатопротекторами 66
3.2.2. Динамика показателей холестатического синдрома на фоне проводимой терапии итраконазолом и комбинации его с гепатопротекторами 74
3.3. Экспериментальное электрохимическое исследование влияния итраконазола и гепатопротекторов на активность цитохрома Р450 ЗА4 79
3.4. Оценка активности цитохрома Р450 ЗА4 неинвазивным методом по соотношению бр-гидроксикортизол/кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне проводимой терапии итраконазолом в комбинации с гепатопротекторами 85
3.5. Динамика изменения максимальной равновесной концентрации итраконазола в плазме крови больных онихомикозом на фоне проводимой пульс терапии 88
Глава 4. Обсуждение полученных результатов 92
Заключение 103
Выводы 105
Практические рекомендации 106
Список литературы 1
- Взаимодействие противогрибковых препаратов на уровне метаболизма
- Характеристика лекарственных препаратов, применявшихся в исследовании
- Динамика биохимических показателей функции печени под влиянием терапии итраконазолом и комбинаций его с гепатопротекторами
- Оценка активности цитохрома Р450 ЗА4 неинвазивным методом по соотношению бр-гидроксикортизол/кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне проводимой терапии итраконазолом в комбинации с гепатопротекторами
Введение к работе
Актуальность проблемы
Поражение кожи и ее придатков грибковой инфекцией остается одной из наиболее важных проблем дерматологии (Потекаев Н.С., 2006; Sigurgeirsson В, 2002). По данным мировой литературы, в общей популяции грибковыми инфекциями страдает каждый 4-й житель планеты (Gupta А.К., Scher R.K. 2008). На территории Российской Федерации инфицированность патогенными грибами составляет в среднем 30-40% (Сергеев Ю.В., 2000).
Наиболее часто встречающейся формой грибковых инфекций является онихомикоз (Новоселов B.C., 2004, Сергеев А.Ю., 2006). По данным ВОЗ (2002), микозами стоп страдает от 11,5 до 18% населения. Это заболевание приводит к разрушению ногтевой пластинки, что, в свою очередь, ведет к появлению тревоги, пониженной самооценке, снижению работоспособности (Курдина М.И., Иваников И.О., Сюткин В.Е., 2004).
В связи с отсутствием субъективных ощущений при онихомикозах преобладает поздняя обращаемость к врачу, когда поражение ногтей становится распространенным, а наружное лечение малоэффективным.
Больным с множественными поражениями ногтей и кожи, а также при отсутствии эффекта от местной терапии показано лечение антимикотиками системного действия (Потекаев Н.С. 2005; Evans EG, 1999.; Sigurgeirsson В, 2002). В последние годы синтезированы новые поколения антимикотиков для системного применения, что привело к изменению подходов к рациональной фармакотерапии онихомикозов.
Одним из наиболее эффективных препаратов для лечения онихомикоза является противогрибковый препарат из класса азолов итраконазол, обладающий фунгицидным и фунгистатическим действием в отношении дерматофитов и дрожжевых грибов, однако в последние годы его применяют несколько реже, в связи с возможным гепатотоксическим действием.
Показано, что гепатотоксический эффект азолов, как правило, связан с повышением концентрации препарата в плазме крови (Wang J.L., Chang С.Н., 2010.) Сопутствующее применение других ЛС может изменять биотрансформацию итраконазола, а через нее и концентрацию ЛС в плазме крови, что может иметь важное клиническое значение.
Итраконазол является одновременно субстратом и ингибитором изофермента цитохрома Р450 ЗА4 (CYP3A4). В связи с этим изменение активности этого фермента может повлиять на эффективность и безопасность длительного применения итраконазола.
В настоящее время в фармакотерапии онихомикозов наряду с противогрибковыми препаратами часто применяют гепатопротекторы. Известным является факт различного влияния гепатопротекторов на активность цитохрома Р450 ЗА4, однако рекомендации по рациональному выбору препаратов этой группы в зависимости от влияния их на активность ферментов системы метаболизма отсутствуют.
В связи с этим, весьма актуальным является сравнительное изучение применения гепатопротекторов с различным влиянием на активность цитохрома Р450 ЗА4 в комбинации с препаратом итраконазол при лечении онихомикозов.
Цель исследования
Оптимизация фармакотерапии больных онихомикозом
антимикотическими препаратами в сочетании с гепатопротекторами,
оказывающих различное влияние на изофермент CYP 450 ЗА4, на основе
клинико-экспериментального изучения и возможностей
фармакологической регуляции активности гемопротеина.
Задачи исследования
-
Изучить в эксперименте с помощью электрохимического метода исследования влияние силибинина и таурина на активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4, метаболизирующего итраконазол.
-
Изучить влияние силибинина и таурина на активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4 с помощью теста определения соотношения 6В-гидроксикортизола/ кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне длительного лечения итраконазолом.
-
Изучить динамику изменения максимальной равновесной концентрации итраконазола в плазме крови больных онихомикозом на фоне проводимой пульс-терапии.
-
Оценить клиническую эффективность различных комбинаций итраконазола и гепатопротекторов по динамике регрессии клинико-лабораторных симптомов онихомикоза и показателей, характеризующих функцию печени.
-
Сопоставить данные эксперимента (in vitro) с динамикой клинико-лабораторных симптомов и биохимических показателей крови, характеризующих функцию печени, на фоне длительного применения итраконазола у больных онихомикозом.
Научная новизна
Впервые в эксперименте in vitro с помощью электрохимического метода изучено влияние различных гепатопротекторов (таурина и силибинина) на активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4, метаболизирующего итраконазол.
Впервые у больных онихомикозом, принимающих итраконазол, изучено влияние гепатопротекторов (таурин и силибинин) на активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4 с помощью неинвазивного метода по тесту определения соотношения 66-гидроксикортизола/ кортизола в моче.
Впервые проведено сопоставление экспериментальных
результатов, полученных с помощью электрохимических методов
исследования (in vitro) с клинико-лабораторными показателями у
больных онихомикозом (тест определения соотношения 60-
гидроксикортизола/ кортизол в моче (in vivo), динамикой регрессии клинических симптомов онихомикоза, динамикой биохимических показателей крови, характеризующих функцию печени, на фоне курсового применения итраконазола).
Практическая значимость
В экспериментальной части исследования показано, что таурин не является субстратом изофермента цитохрома Р450 ЗА4. Таурин нивелирует ингибирующее влияние итраконазола на цитохром Р450 ЗА4 в электрохимическом эксперименте.
Результаты теста определения соотношения 6й-гидроксикортизола/ кортизола в моче показали, что одновременное с итраконазолом назначение таурина больным онихомикозом на фоне длительного лечения приводит к статистически значимо меньшему ингибированию фермента цитохрома Р450 ЗА4.
Показано, что выбор в качестве гепатопротектора таурина, оказывающего индуцирующее действие на изофермент цитохрома Р450 ЗА4, позволяет повысить безопасность длительного применения итраконазола у больных онихомикозом.
Внедрение результатов исследования
Результаты работы используются в практике кожно-венерологического диспансера №15 Юго-Восточного округа г. Москвы, кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета, кафедры кожных и венерических болезней факультета послевузовского профессионального образования врачей ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова, ГКБ № 23 им. «Медсантруд» г. Москвы.
Положения, выносимые на защиту
По данным электрохимического эксперимента таурин не является субстратом изофермента цитохрома Р450 ЗА4.
По данным электрохимического эксперимента и результатам определения соотношения бр- гидроксикортизол /кортизол таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола на цитохром Р450 ЗА4.
По данным электрохимического эксперимента и результатам определения соотношения бр- гидроксикортизол /кортизол силибинин не влияет на активность цитохрома Р450 ЗА4.
Эффективность и длительность терапии онихомикоза
итраконазолом не зависит от выбора гепатопротектора.
Применение таурина в качестве гепатопротектора при лечении больных онихомикозом повышает безопасность фармакотерапии итраконазолом.
Апробация работы
Апробация работы проведена 14 декабря 2010 года на совместном заседании секции №1 Ученого Совета ФГБУ «НЦ ЭСМП» Минздравсоцразвития России и кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней лечебного факультета ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М.Сеченова.
Структура и объем работы
Взаимодействие противогрибковых препаратов на уровне метаболизма
Поражение кожи и ее придатков грибковой инфекцией остается одной из наиболее важных проблем дерматологии [11, 15, 28, 45, 55, 67]. По данным мировой литературы, в человеческой популяции грибковыми инфекциями поражен каждый 4-й житель планеты [63]. В нашей стране инфициро-ванность патогенными грибами составляет в среднем 30 0% [8, 50].
Наиболее часто встречающейся формой грибковых инфекций является онихомикоз [26, 49]. Мужчины страдают этим заболеванием в 1,5-3 раза чаще [25], чем женщины, однако женщины чаще обращаются к врачу [46]. По данным ВОЗ (2002), микозами стоп страдает от 11,5 до 18% населения [39, 51]. Это заболевание приводит к разрушению ногтевой пластинки, что, в свою очередь, ведет к появлению тревоги, пониженной самооценке, снижению работоспособности [35, 38, 40].
Все возбудители онихомикозов принято делить на 3 группы: дермато-мицеты, дрожжеподобные грибы рода Candida и плесневые грибы [36]. Чаще всего в ногтевых пластинках обнаруживают Trichophyton rubrum, второе и третье место по частоте занимают Trichophyton mentagrophytes и редко Epidermophyton floccosum [16]. На долю этих инфекций приходится 90% грибковых заболеваний [30]. Поражение ногтей могут вызывать также Candida albicans, Scopulariosis brevicaulis, Scytalidium dimidiatum, разновидности Aspergillus и другие микроорганизмы [29, 65]. В связи с отсутствием субъективных ощущений при онихомикозах, преобладает поздняя обращаемость пациента к врачу, когда поражение ногтей становится распространенным, а наружное лечение малоэффективно [2, 34, 47].
В настоящее время на вооружении микологов имеется широкий выбор противогрибковых препаратов системного и наружного действия в различ ных лекарственных формах (мази, кремы, растворы, лаки, пудра) [3, 21, 102, ПО, 133]. Однако проблема лечения больных онихомикозом по-прежнему остается актуальной, так как нередко наблюдаются рецидивы заболевания [20]. При выборе рациональной фармакотерапии для такой категории больных необходимо прежде всего учитывать ее терапевтическую эффективность, безопасность, способ применения и стоимость препаратов [31, 32, 52, 60, 62, 80].
Для получения нужного терапевтического эффекта предпочтительны антимикотики с фунгицидным действием на различные виды возбудителей, со способностью накапливаться в ногтевой матрице и ногтевом ложе [37, 43, 101, 109]. Важным моментом является способ применения выбранного препарата [3, 21, 33, 61]. Кроме того, при выборе лекарственной терапии необходимо учитывать ряд факторов, такие как тип и форма поражения ногтевых пластин, степень распространения и давность заболевания, скорость роста ногтей и общее состояние больного, наличие сопутствующих заболеваний, состояние иммунной системы и др. [52, 60].
В настоящее время в современном арсенале врача для лечения больных онихомикозом имеется 3 высокоэффективных антимикотика системного действия: тербинафин [99], итраконазол [86], флуконазол [60, 81, 126] и ряд препаратов для местной терапии [44, 79].
Одним из наиболее часто применяемых препаратов в практической микологии является итраконазол [86]. Итраконазол — антимикотик широкого спектра действия, обеспечивающий возможность эффективной борьбы с грибковой инфекцией [20, 84]. Ингибирует синтез эргостерина клеточной мембраны грибов [20, 24]. Активен в отношении дерматофитов, дрожжепо-добных и дрожжевых грибов, плесневых грибов [31, 34].
Итраконазол, синтезированный в 1986 году, является триазолом с широким спектром антифунгальной активности, включая грибы рода Aspergillus [37].
Фармакокинетика. Препарат достаточно полно всасывается из желудочно-кишечного тракта. Прием итраконазола в капсулах сразу после еды увеличивает его биодоступность. Прием препарата в виде раствора натощак приводит к более высокой скорости достижения Стах по сравнению с приемом после еды (на 25%). ТСтах при приеме капсул составляет около 3-4 часов. Время наступления Css в плазме при длительном применении - 1-2 недели. Связь с белками плазмы составляет 99,8%. Препарат хорошо проникает в ткани и органы, содержится в секрете сальных и потовых желез [20].
Концентрация итраконазола в легких, почках, печени, костях, желудке, селезенке, скелетных мышцах в 2-3 раза превышает его концентрацию в плазме; в тканях, содержащих кератин, в 4 раза [119]. Терапевтическая концентрация итраконазола в коже сохраняется течение 2-4 недель после прекращения 4-недельного курса лечения [111]. Терапевтическая концентрация в кератине ногтей достигается через 1 неделю после начала лечения и сохраняется в течение 6 месяцев после завершения 3-месячного курса лечения [188]. Длительное сохранение терапевтической концентрации итраконазола определяет тактику применения препарата у больных онихимикозом [129].
Метаболизм. Доказано, что все противогрибковые препараты метабо-лизируются с помощью цитохрома CYP3A4 [18], и сами являются не только субстратом, но и ингибитором этого цитохрома. То есть, чем дольше они применяются, тем ниже активность цитохрома CYP3A4, выше концентрация противогрибковых препаратов и сильнее выражена их гепатотоксичность.
Итраконазол метаболизируется в печени с образованием активных метаболитов, в том числе гидроксиитраконазола [111, 119]. Препарат является ингибитором изоферментов CYP3A4, CYP3A5 и CYP3A7 [18, 19]. Имеет двойной путь выведения: почками в течение 1 недели (35% в виде метаболитов, 0,03% - в неизмененном виде) и через кишечник (3-18%) в неизмененном виде) [129]. Итраконазол можно назначать один раз в сутки. Тем не менее, высокие дозы (более 400 мг/сутки), которые применяются при тяжелых ми-котических процессах и при пульс-терапии, целесообразно назначать в два приема [44]. Вследствие липофильности итраконазола его концентрация в коже может быть в 10, а в печени - в 10-20 раз выше, чем в плазме крови [111]. Биодоступность итраконазола может значительно варьироваться: она максимальная, когда препарат назначают вместе с приемом пищи [119]. Прием грейпфрутового сока, являющегося пищевым ингибитором цитохрома С450, не влияет на фармакокинетику итраконазола [18].
Итраконазол в основном расщепляется ферментом CYP3A4 [18]. В связи с этим изменение активности этого фермента может повлиять на эффективность и безопасность длительного применения итраконазола [19].
Взаимодействие. В ряде работ было изучено взаимодействие итраконазола с рифампицином, рифабутином и фенитоином, являющимися мощными индукторами фермента CYP3A4 [81]. Результаты исследования показали, что биодоступность итраконазола и его активного метаболита гидрокси-итраконазола значительно снижается, что приводит к существенному уменьшению эффективности препарата. Поэтому одновременное применение итраконазола с вышеуказанными препаратами, являющимися потенциальными индукторами печеночных ферментов, не рекомендуется.
Характеристика лекарственных препаратов, применявшихся в исследовании
Наиболее часто среди гепатопротекторов растительного происхождения применяется силимарин, который представляет собой экстракт расто-ропши пятнистой (Silybum marianum) - растения из семейства сложноцветных. Его активные компоненты включают 4 флавоноида, основным из которых является силибинин. Последний составляет 80-90% экстракта, химический состав остальных компонентов не определен. Фармакокинетические исследования показали, что после приема внутрь силибинин быстро всасывается, период полувыведения составляет 6 часов. Эксперименты на животных показали, что силимарин обладает свойствами антиоксиданта [94] и предупреждает истощение запасов глутатиона, а также предотвращает повреждения печени, вызываемые бледной поганкой, четыреххлористым углеродом и парацетамолом. Кроме того, считается, что силимарин тормозит развитие фиброза. In vitro силимарин блокирует пролиферацию купферов-ских клеток и снижает выделение трансформирующего фактора роста р. При пероральном приеме у крыс силимарин дозозависимо снижает накопление коллагена. Кроме того, недавние исследования in vitro показали, что силимарин может обладать противовоспалительными свойствами за счет подавления синтеза провоспалительного лейкотриена В4 в купферовских клетках.
На экспериментальных моделях продемонстрировано уменьшение под влиянием силимарина скорости фиброзной трансформации ткани печени, что связывается как с повышением клиренса свободных радикалов, так и с непосредственным подавлением синтеза коллагена.
В противоположность экспериментальной клиническая эффективность силимарина практически не подтверждена из-за недостатка адекватных исследований. Во многих испытаниях участвовали больные острым вирусным гепатитом, при котором очень часто наблюдается спонтанное выздоровление. Кроме того, результаты многих работ опубликованы в журналах не на английском языке, которые обычно не индексируются Pubmed и Medline. Наконец, фармакокинетические исследования различных препаратов силимарина обнаружили значительные колебания его пиковой концентрации. Несмотря на эти ограничения, данный препарат широко применяется в развитых странах.
Результаты большинства исследований по изучению силимарина при алкогольных поражениях печени (АЛЛ) трудно интерпретировать вследствие гетерогенности групп пациентов и отсутствия стратификации по тяжести заболевания. Кроме того, наблюдение во многих исследованиях не предусматривало изучения биоптатов печени, как и оценки воздержания от алкоголя по объективным критериям. В крупнейшем из этих исследований 170 больных циррозом печени (подтвержденным гистологическим исследованием биоптатов в 70% случаев: 92 - АЛЛ и 78 - другие заболевания) ран-домизировали для получения силимарина (420 мг/сут.; п=87) или плацебо (п=83) в течение 2-6 лет (в среднем 41 мес). В группе силимарина биохимические параметры не претерпели статистически значимых изменений, но выживаемость повысилась (77 vs 67% через 2 года; 58 vs 39% через 4 года), особенно у больных с печеночной недостаточностью класса А по классификации Чайлд-Пью.
Другие исследователи [Pares et al.] получили противоположный результат: в группах силимарина и плацебо выживаемость была близкой (17 vs 12% через 2 года; 19 vs 16% через 5 лет), 75% летальных исходов были прямо связаны с заболеванием печени. Таким образом, до настоящего момента нет данных в пользу применения силимарина при АЛЛ, несмотря на безопасность этого препарата.
Влиянию силимарина (420 мг) на первичный билиарный цирроз посвящено всего лишь одно исследование (27 больных, у которых не было получено биохимического ответа на урсодезоксихолевую кислоту). Через 1 год наблюдения не зарегистрировано статистически значимого улучшения биохимических показателей функции печени или индекса риска Мейо. К тому же исследование имело ряд недостатков: плохой дизайн, малый объем выборки и короткий период наблюдения.
Таким образом, опыт применения силибинина в основном ограничивается АПП, работ по изучению его эффективности при снижении побочных эффектов лекарственных препаратов совсем немного. Так, в частности, в экспериментальных и клинических исследованиях показано, что силима-рин обладает гепатопротективным свойством в отношении ряда лекарственных средств и токсинов. Согласно ретроспективному анализу, включившему 205 больных с отравлением бледной поганкой, в подгруппе из 30 больных, которые получали силимарин в/в, летальность оказалась ниже (12,8 vs 22,4%). В другом неконтролируемом исследовании (п=60) больным в/в вводили силимарин (20 мг/кг в сутки) в пределах 24-36 часов от употребления в пищу бледной поганки; все из них выжили. Другие исследования, в которых оценивалась способность силимарина противодействовать влиянию иных токсинов и лекарственных средств, включали очень малое число больных и дали противоречивые результаты.
Таким образом, в основе гепатопротекторного действия силимарина (син.: легален) лежит способность препарата нейтрализовать свободные радикалы кислорода в тканях печени и тем самым препятствовать разрушению ее клеточных структур. Помимо этого препарат обладает способностью активировать фермент РНК-полимеразу и тем самым стимулировать синтез структурных и функциональных белков в поврежденных гепатоцитах. Силимарин стабилизирует клеточные мембраны гепатоцитов, ускоряет репара-тивные (от лат. reparaiio - восстановление, возобновление - восстановление исходной структуры) процессы в тканях печени. Имеются данные о том, что силимарин замедляет проникновение в клетки печени некоторых гепатоток-сичных соединений.
Динамика биохимических показателей функции печени под влиянием терапии итраконазолом и комбинаций его с гепатопротекторами
На первом этапе эксперимента подтверждена достоверность применяемой методики путем измерения электрохимической активности цитохрома Р450 ЗА4 в присутствии диклофенака. Результаты исследования показали, что при добавлении диклофенака к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду происходит достоверное увеличение каталитического тока с -0,622 до -0,742 дА (р 0,05).
Результаты экспериментального изучения влияния итраконазола на электрохимическую активность цитохрома Р450 ЗА4 показали, что при добавлении итраконазола к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду не наблюдается увеличение катодного каталитического тока. Так, среднее значение тока DDAB/Au/P450 составило 0,913±0,209 дА (100%), при добавлении итраконазола к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду - 0,83 3±0,167 дА (91,2%). Полученные результаты исследования можно объяснить проявлением не только субстратных, но и ингибирующих свойств итраконазола по отношению к цитохрому Р450 ЗА4.
Проведено изучение в электрохимических экспериментах влияния тау-рина на электрохимическую активность цитохрома Р450 ЗА4. Оценка проводилась с помощью анализа отклика фермента на вещество-модулятор. При добавлении таурина (конечная концентрация 50 мкМ) к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду наблюдается увеличение катодного тока, что обычно характерно для субстратов цитохрома Р450.
Для доказательства отсутствия связывания таурина с цитохромом Р450 по типу субстратов были исследованы разностные спектры поглощения цитохрома Р450 в присутствии диклофенака, итраконазола и таурина. Спектр поглощения гемопротеина (рис. 14) имеет характерный максимум при 420 нм. Wavelength (n m )
Разностный спектр связывания с диклофенаком имеет характерную форму для связывания субстратов I типа: с максимумом при 380 нм и минимумом при 416 нм (см. рис. 15). Итраконазол дает разностный спектр связывания II типа, характерный для соединений - ингибиторов с максимумом при 420 нм и минимумом при 390 нм (см. рис. 16). Таурин не дает характерных разностных спектров связывания ни I, ни II типа (см. рис. 17), что доказывает отсутствие субстратных свойств у таурина.
Увеличение каталитического тока при прибавлении таурина можно объяснить антиоксидантными свойствами этого соединения. В результате электрокаталитического восстановления цитохрома Р450 ЗА4 происходит генерирование активных форм кислорода, что в соответствии с механизмом каталитического действия цитохрома может приводить к частичной инактивации фермента. Антиоксидантные свойства таурина проявляются в нейтрализации этих активных форм кислорода, что приводит к стабилизации фермента и увеличению восстановительного катодного тока. Ингибирующее дейст 82
виє итраконазола (в концентрации 10 мкМ) в присутствии 50 мкМ таурина существенно снижается. Основной вывод, который можно сделать на основании проведенный экспериментов - таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола.
В экспериментах по схеме «итраконазол, затем таурин» итраконазол, как и следует ожидать, ингибирует цитохром Р450 ЗА4, что проявляется в отсутствии каталитического тока (102%). Добавка таурина к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду в присутствии итраконазола дает прирост регистрируемого катодного тока (139%), т.е. антиоксидантные свойства таурина проявляются и в присутствии ингибитора цитохрома Р450 ЗА4 (приведены средние значения 3-х экспериментов по схеме итраконазол, затем таурин).
Таким образом, используя электрохимическое восстановление цитохрома Р450 ЗА4 в качестве инструмента для исследования электрокаталитической активности гемопротеина и влияния на электрохимическую цитохром Р450-содержащую систему различных биологически активных веществ, можно сделать вывод: таурин, являясь антиоксидантом, положительно влияет на электрокаталитическое восстановление цитохрома Р450 ЗА4. При этом таурин снижает ингибирующий эффект итраконазола.
Проведено экспериментальное изучение влияния силибинина на электрохимическую активность CYP450 ЗА4. Результаты исследования показали, что при добавлении силибинина к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду не наблюдается увеличение катодного каталитического тока. Так, среднее значение тока DDAB/Au/P450 составило -0,838±0,109дА (100%), при добавлении силибинина к DDAB/Au/P450 ЗА4 электроду - -0,894±0,311 цА (106,7%). При последующем добавлении итраконазола также не отмечено увеличения каталитического тока: среднее значение составило -0,868±0,276 JIA (103,6 %). Результаты электрохимического анализа показали, что силибинин не оказывает существенного влияния на активость цитохрома Р450 ЗА4 и не снижает ингибирующий эффект итраконазола. Средние значения катодного каталитического тока под влиянием различных комбинаций субстратов, ингибиторов, модуляторов CYP450 ЗА4 представлены в табл. 12.
В среднем по группе больных, получавших лечение итраконазолом соотношению концентраций 63-гидроксикортизола и кортизола (6р-гидрокси-кортизол/кортизол) в утренней порции мочи составило до начала терапии 2,68±0,2. После проведения первого тура терапии отмечено статистически значимое снижение его значения до 2,23±0,1 (t=2,04; Р 0,05).
В дальнейшем при поведении туров терапии так же отмечается снижение коэффициента, которое в связи с выраженной индивидуальной вариабельностью значений не является статистически значимым для средних по группе значений при сравнении последующего значения с предыдущим. Однако при проведении парного сравнения непараметрическим тестом Вилкок-сона установлено статистически значимое снижение значения соотношения 6р-гидроксикортизол/кортизол от тура к туру на протяжении всего периода наблюдения.
В среднем по группе пациентов за время наблюдения у пациентов, получавших терапию итраконазолом, произошло уменьшение соотношения в 2,4 раза. Полученные результаты подтверждают данные литературы о наличии ингибирующего влияния итраконазола на активность CYP450 ЗА4 и согласуются с собственными данными, полученными экспериментально при проведении электрохимических исследований. При этом необходимо отметить наличие прямой обратной коррелятивной зависимости (г=-0,97) между длительностью терапии и величиной значения соотношения 6р-гидрокси-кортизол/кортизол, что подтверждает зависимость степени ингибирования CYP450 ЗА4 от длительности проводимой итраконазолом терапии (см. рис. 19 и табл. 13).
Оценка активности цитохрома Р450 ЗА4 неинвазивным методом по соотношению бр-гидроксикортизол/кортизол в моче у больных онихомикозом на фоне проводимой терапии итраконазолом в комбинации с гепатопротекторами
В группе больных онихомикозом, принимавших итраконазол одновременно с таурином, не отмечено значимого изменения величины соотношения 6(3-гидроксикортизол/кортизол независимо от продолжительности проводимой терапии. Отмечено статистически незначимое увеличение соотношения бр-гидроксикортизол/кортизол, особенно в период времени начиная с 4-го тура терапии. В общем, за время применения таурина одновременно с итраконазолом активность цитохрома Р450 ЗА4 возросла на 8,1 А%.
Полученные результаты позволяют предположить наличие индуцирующего эффекта таурина на активность цитохрома Р450 ЗА4 и согласуются с собственными данными, полученными экспериментально при проведении электрохимических исследований.
Учитывая противоречивые литературные данные [Кукес ВТ. с соавт., 2008] о влиянии препаратов расторопши (силибинина) на активность изо-фермента цитохрома Р450 ЗА4 (индукция/ингибиция), что зависит от количества и соотношения отдельных флаволигнанов, нами было проведено дополнительное исследование по сравнению влияния силимарина на активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4.
При проведении терапии итраконазолом совместно с силибинином после первого тура отмечается некоторое, статистически незначимое снижение величины соотношения 6р-гидроксикортизол/кортизол с 2,74±0,2 до 2,61±0,2. В этой группе пациентов также имеет место наличие ярко выраженной обратной коррелятивной зависимости (г=-0,97) между длительностью терапии и величиной значения соотношения 63-гидроксикортизол/кортизол, что подтверждает зависимость степени ингибирования цитохрома Р450 ЗА4 от длительности проводимой терапии итраконазолом совместно с силибинином.
Однако при сравнении результатов, полученных у пациентов, необходимо отметить более низкую степень ингибирования цитохрома Р450 ЗА4 в группе пациентов, принимавших совместно с итраконазолом силибинин. Значение соотношения бр-гидроксикортизол/кортизол у пациентов, принимавших итраконазол в комплексе в силибиноном, существенно превосходит значение этого соотношения при приеме только итраконазола во всех контрольных временных точках, начиная с первого тура терапии.
Изучение динамики максимальной равновесной концентрации в конце каждого тура терапии позволило установить, что у всех больных онихомико-зом, получающих гепатопротекторы, концентрация итраконазола в плазме крови была в диапазоне терапевтических концентраций (2-10 мкг/мл). При этом необходимо отметить, что при проведении комбинированной терапии «итраконазол + таурин» отмечено статистически незначимое повышение максимальной равновесной концентрации итраконазола по мере увеличения количества туров терапии.
При применении итраконазола в виде монотерапии статистически значимое увеличение максимальной равновесной концентрации препарата по сравнению с 1-м туром лечения отмечено после 5-го тура, при применении комбинации итраконазол+силибинин - после 7-го тура терапии
Таким образом, системные антимикотики, в частности, итраконазол, метаболизируются с помощью цитохрома Р450 ЗА4, и сами являются не только субстратом, но и ингибитором этого цитохрома. То есть, чем дольше они применяются, тем ниже активность цитохрома, выше концентрация противогрибковых азолов и сильнее их гепатотоксичность. Поэтому, вместе с противогрибковыми препаратами назначают гепатопротекторы, которые различаются по влиянию на активность цитохрома Р450 ЗА4: не изменяют (например, силибинин); активируют (например, таурин). Таким образом, можно предположить, что за счет регуляторного влияния гепатопротекторов (таурин) на активность цитохрома Р450 ЗА4 можно существенно снизить гепатотоксичность противогрибковых азолов.
Таким образом, настоящая работа посвящена оптимизации фармакотерапии больных онихомикозом антимикотическими препаратами в сочетании с гепатопротекторами, оказывающими различное влияние на активность активность изофермента цитохрома Р450 ЗА4, на основе клинико- экспериментального изучения активности цитохрома Р450 ЗА4 и возможностей фармакологической регуляции его активности.
В эксперименте in vitro с помощью электрохимического метода изучено влияние различных гепатопротекторов (таурина и силибинина) на активность фермента цитохрома Р450 ЗА4, метаболизирующего итраконазол.
Впервые у больных онихомикозом, принимающих итраконазол, изучено влияние гепатопротекторов (таурин и силибинин) на активность фермента цитохрома Р450 ЗА4 неинвазивным методом по тесту определения соотношения бБ-гидроксикортизола/ кортизола в моче.
В работе проведено сопоставление экспериментальных результатов, полученных с помощью электрохимических методов исследования (in vitro) с клинико-лабораторными показателями у больных онихомикозом (тест определения соотношения 6В-гидроксикортизола/ кортизол в моче (in vivo), динамикой регрессии клинических симптомов онихомикоза, динамикой биохимических показателей, характеризующих функцию печени на фоне курсового применения итраконазола.
Показано, что выбор в качестве гепатопротектора таурина, оказывающего индуцирующее действие на цитохром Р450 ЗА4, позволяет повысить безопасность длительного применения итраконазола у больных онихомикозом.
Более того, в электрохимическом эксперименте показано, что при проведении комбинированной фармакотерапии лекарственными препаратами, ингибирующими активность цитохрома Р450 ЗА4, таурин может быть использован в качестве модулятора активности гемопротеина.
Полученные данные подтверждены результатами неинвазивного метода по определению активности цитохрома Р450 ЗА4 с помощью теста соотношения 6б-гидроксикортизола/ кортизол в моче: выявлено наличие у тау-рина свойства снижать ингибирующий эффект итраконазола на цитохром Р450 ЗА4. Добавление таурина к терапии итраконазолом позволяет нивелировать ингибирующее действие итраконазола на цитохром Р 450 ЗА4 независимо от длительности проводимой терапии.
