Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы. Технология получения лекарственных препаратов из лечебных грязей и их фармакологическая активность
1.1. Химический состав лечебных грязей 12
1.2. Биологическая активность пелоидов.
1.2.1. Антирадикальная активность пелоидов 20
1.2.2. Иммунотропная активность пелоидов 22
1.2.3. Противовоспалительная активность пелоидов 25
1.3. Лекарственные препараты лечебных грязей
1.3.1. Технология переработки лечебных грязей 27
1.3.2. Биологическая активность извлечений из лечебных грязей 34
Выводы к литературному обзору 38
Экспериментальная часть
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1. Материалы исследования 39
2.2. Методы исследования
2.2.1. Оценка качества и стандартизация ЛФ, содержащих биологически активные вещества грязи озера Эльтон 40
2.2.2. Исследование антирадикальной активности 42
2.2.3. Биофармацевтические исследования ЛФ 43
2.2.4. Исследований иммунотропной активности 44
2.2.5. Исследование противоожоговой активности разработанных лекарственных форм 44
2.2.6. Исследование противовоспалительной активности разработанных лекарственных форм 46
Глава 3. Разработка технологии лекарственных форм, содержащих биологически активные вещества лечебной грязи озера Эльтон
3.1. Разработка технологии олеогеля «Эльтон»
3.1.1. Обоснование состава олеогеля 48
3.1.2. Технологическая схема получения олеогеля 52
3.2. Разработка технологии эмульсионной мази «Эльтон»
3.2.1. Обоснование состава и выбор основы 53
3.2.2. Технологическая схема получения эмульсионной мази «Эльтон» 57
3.3. Разработка технологии мази «Эльтон» на основе ПЭО
3.3.1. Определение состава и концентрации вспомогательных веществ 58
3.3.2. Технологическая схема получения мази на основе ПЭО 63
3.4. Разработка технологии ректальных суппозиториев «Эльтон»
3.4.1 Обоснование состава суппозиториев 65
3.4.2. Технологическая схема получения суппозиториев 69
3.5. Биофармацевтическая оценка лекарственных форм, содержащих масляный раствор «Эльтон» 72
Выводы к главе 3 73
Глава 4. Разработка методов контроля качества и стандартизации лекарственных форм
4.1. Разработка методов контроля и стандартизации масляного раствора «Эльтон» 74
4.2. Разработка методов контроля и стандартизации олеогеля 79
4.3. Стандартизация и изучение стабильности эмульсионной мази на основе метилцеллюлозы в процессе хранения 82
4.5. Стандартизация и изучение стабильности мази «Эльтон» на основе ПЭО 86
4.5. Разработка методов контроля качества и стандартизации ректальных суппозиториев «Эльтон» 88
Выводы к главе 4 91
Глава 5. Исследование фармакологической активности разработанных лекарственных форм
5.1. Исследование антирадикальной активности 92
5.2. Исследований иммунотропной активности 94
5.3. Изучение противовоспалительной активности 98
5.4. Исследование ранозаживляющей активности 102
Выводы к главе 5 109
Общие выводы 110
Список литературы 112
Приложения 142
- Технология переработки лечебных грязей
- Определение состава и концентрации вспомогательных веществ
- Стандартизация и изучение стабильности эмульсионной мази на основе метилцеллюлозы в процессе хранения
- Исследование ранозаживляющей активности
Введение к работе
Актуальность темы. Поиск и создание новых лекарственных средств (ЛС), отличающихся высокой фармакологической активностью и низкой токсичностью, является актуальной задачей современного здравоохранения.
Одним из богатых источников природных БАВ является иловая грязь озера Эльтон - ценнейшего природного объекта Волгоградской области. Побережье озера - санитарная охранная зона санатория «Эльтон», расположенного в поселке с одноименным названием, в котором с 1904 г. эффективно лечат многие заболевания с помощью уникальной лечебной грязи, рапы, минеральной соли Сморогдинского источника.
Лечебные грязи (ЛГ) оказывают на организм как местное, так и системное воздействие через сложные нейрогуморальные механизмы. Иловые ЛГ стимулируют процессы регенерации, иммунокоррекции, оказывают обезболивающие, противовоспалительное действие. Однако, биологически активные компоненты ЛГ не стабильны, разрушаются под воздействием факторов внешней среды, теряя свои лечебные свойства, особенно в процессе транспортирования и хранения. Кроме того, ЛГ чаще всего в виде аппликаций, компрессов и в комплексе с методами физиотерапии имеют определенные ограничения (стрессовое воздействие - механическое и тепловое) и противопоказания (наличие патологий сердечно-сосудистой системы), особенно у лиц пожилого и старческого возраста. Использование препаратов, содержащих БАВ ЛГ обеспечивает существенное уменьшение расхода нативной ЛГ, позволяет расширить показания к пелоидотерапии, получить терапевтический и экономический эффект. В настоящее время ассортимент отечественных ЛС, содержащих БАВ ЛГ, крайне ограничен. С этой точки зрения разработка технологии ЛФ, содержащих БАВ лечебной грязи озера Эльтон, не обладающих недостатками, присущими нативным ЛГ, удобных для применения, транспортирования и хранения является актуальной задачей современной фармации. Так, разработана технология комплексной переработки иловой ЛГ озера Эльтон, позволяющая получить масляный раствор липидного комплекса (ЛК) - «Эльтон» (патент РФ № 2107504) [Симонян А.В., 1998]. Следует подчеркнуть, что масляный раствор
«Эльтон», является аналогом разрешенного к медицинскому применению препарата «Тамбуканской грязи» включенного в Государственный реестр лекарственных средств РФ (Per. № 71/528/48).
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка технологии мягких ЛФ, содержащих БАВ Ж озера Эльтон, соответствующих цели назначения, отличающихся высокой биологической доступностью и стабильностью.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
-
обосновать и разработать оптимальный состав и технологию ЛФ, содержащих БАВ иловой лечебной грязи озера Эльтон;
-
исследовать влияние технологических факторов на биофармацевтические характеристики приготовленных ЛФ;
-
исследовать биологическую доступность разработанных ЛФ, предназначенных для наружного применения;
-
исследовать противовоспалительную, ранозаживляющую и противоожоговую активность разработанных ЛФ в опытах in vivo;
-
разработать методы контроля качества и стандартизации приготовленных ЛФ по срокам хранения;
-
разработать проекты нормативной документации на разработанные ЛФ в виде проектов ФСП и ЛР.
Научная новизна работы. Впервые разработаны составы и технология мягких ЛФ на полимерных основах - метилцеллюлозе (МЦ), сплаве полиэтиле-ноксидов (ПЭО), олеогеля с аэросилом, содержащих БАВ Ж озера Эльтон, соответствующих требованиям ГФ XI.
Впервые разработана технология суппозиториев ректальных «Эльтон», соответствующих требованиям ГФ XI.
Впервые установлено антирадикальное (АР) и иммунотропное действие разработанных ЛФ в опытах in vitro.
Установлена выраженная противовоспалительная, ранозаживляющая и противоожоговая активность разработанных ЛФ в опытах in vivo.
Практическая значимость и внедрение результатов работы. В результате проведенных исследований разработаны ЛФ, содержащие БАВ ЛГ озера Эльтон:
олеогель «Эльтон» с аэросилом;
10 % эмульсионная мазь «Эльтон» на основе МЦ
10 % мазь «Эльтон» на основе сплава ПЭО;
суппозитории «Эльтон» на гидрофобной основе.
На основании проведенных исследований разработаны методы контроля качества и стандартизации приготовленных ЛФ, составлены проекты ФСП и ЛР, апробированные на производстве ООО «НПО «Башбиомед» (г. Уфа).
Результаты исследований внедрены в учебный процесс и научно-исследовательскую работу кафедры фармацевтической, токсикологической и аналитической химии КГМУ, кафедры фармации КубГМУ, кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ВГУ, кафедры фармацевтической технологии ПГФА и кафедры фармацевтической технологии с курсом биотехнологии БГМУ.
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами научно-исследовательских работ ГБОУ ВПО «ВолгГМУ Минздравсоцразвития России» по проблеме «Фармация» кафедры фармацевтической технологии и биотехнологии (№ государственной регистрации 012007 06751).
Апробация работы. Результаты исследований доложены на: 3-й Международной выставке «О ходе реализации приоритетного национального проекта Здоровье» (Москва, 2007); 14-й Международной фармацевтической выставке «Аптека-2007» (Москва, 2007); итоговых научных конференциях молодых ученых и профессорско-преподавательского коллектива ВолгГМУ (2007-2010); региональных конференциях молодых исследователей Волгоградской области (2007-2010); IX Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва 2007); XI Поволжской научно-практической конференции «Пути сохранения репродуктивного здоровья женщин и его значение в решении демографических проблем» (Астрахань, 2007); IV Всероссийской конференции «Инновационные
технологии в ревматологии» (Нижний Новгород, 2008), XIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В. И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2009), научно-практической конференции «Новые технологии физиотерапии в акушерстве и гинекологии» (Санкт-Петербург, 2010), Всероссийской научно-практической интернет-конференции с международным участием «Современные аспекты разработки и совершенствования технологии лекарственных форм» (Курск, 2011).
Публикации. По материалам исследований диссертационной работы опубликовано 18 научных работ, в том числе 4 работы в рецензируемых ВАК изданиях.
Основные положения, выносимые на защиту:
технология мягких ЛФ, содержащих БАВ ЛГ озера Эльтон, на гидрофобных, гидрофильно-липофильных и гидрофильных основах;
технология суппозиториев ректальных, содержащих масляный раствор ЛК из ЛГ озера Эльтон, на гидрофобной основе;
результаты исследований антирадикалыюй, иммунотропной активности средства «Эльтон»;
- результаты исследований противовоспалительной, ранозаживляющей и
противоожоговой активности разработанных ЛФ.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (главы 2-5), общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 21 таблицу, 20 рисунков, 4 схемы, 250 библиографических источников, из которых 35 на иностранных языках.
Технология переработки лечебных грязей
Грязевые лекарственные препараты (ЛП) характеризуются высокой биологической активностью, хорошей переносимостью- и терапевтической эффективностью. Необходимо отметить также невысокую стоимость, доступность, удобство транспортирования и хранения. Грязевые ЛИ имеют преимущество перед применением грязелечебных процедур, а именно отсутствие нагрузки на сердечно-сосудистую и вегетативную нервную систему, устранение влияния температурных и механических факторов грязевых ванн или аппликаций. Применение грязевых ЛП оказывает стимулирующее влияние на метаболические процессы, на повышение регенерации тканей, десенсибилизацию. Кроме того, они обладают противовоспалительным, болеутоляющим и антибактериальным действием. Введенные в организм человека ЛП оказывают стимулирующее влияние на различные функции адаптивных систем, а также ускоряют процессы физиологической репарации тканей. Грязевые ЛП используются в виде компрессов, примочек, микроклизм, влагалищных орошений, ингаляций, питья, подкожных и внутримышечных инъекций, а также путем введения с помощью гальванического тока ингредиентов нативной грязи - экстрактов, центрифугатов [Олифенко В.Т., 1982]. Грязевые ЛП получают, используя различные технологические приемы и методы (экстрагированием водой, спиртом этиловым, маслами и др. органическими растворителями). Механическим отделением жидкой фазы ЛГ получают грязевые препараты (отжимы, водные экстракты, центрифугаты) физико-химический состав которых максимально соответствует составу на-тивного грязевого раствора. Так, для получения отэюима иловой ЛГ озера Тамбукан заполняют холщовый мешок (5-7 слоев материи) ЛГ и под давлением пресса силой 100-300 кг на см2 в течение 4-6 ч получают прозрачный опалесцирующий грязевой раствор. Водный экстракт получают добавлением воды-очищенной к нативной грязи, учитывая ее влажность, под давлением груза 15 кг в течение 3 сут.
Наиболее простым, экономичным, отвечающим санитарно-гигиеническим требованиям получения ГП является способ центрифугирования. При одинаковом количестве сырья центрифугированием при-5000-10000 об/мин в течение 40 мин. можно получить грязевого раствора на 25 % больше, чем отжима или водного экстракта.
Гумизолъ (Humisolum) — 0,01% раствор фракций FK хаапсалуской. морской лечебной грязи (Балтийское море) в изотоническом растворе натрия хлорида, выпускается по 2 и 10 мл. Способ получения гумизоля основан на осаждении гуматов натрия из щелочного экстракта ЛГ. Нативную ЛГ заливают 10-кратным объемом 2 % раствора натрия гидроксида, кипятят в течение 4-6 ч, охлаждают и разбавляют двухкратным количеством воды, отстаивают 24 часа, фильтруют. Осадок промывают водой, сушат при 60 С [Маш-ковскийМ.Д., 2006; Севостьянова Н.В., 1998; Суй В.М. и др., 1986].
Разработана ресурсосберегающая технология получения. комплекса ГК, обладающего НАД-Н-оксидазной активностью из некондиционных и бывших в употреблении ЛГ, что экономит истощающиеся сырьевые ресурсы кондиционных ЛГ. Иловую грязь декальцинируют и десульфируют 2 М раствором кислоты хлороводородной, промывают водой, экстрагируют 0,5 М раствором натрия гидроксида, фильтруют, осаждают 50 % раствором кисло ты серной, осадок промывают водой, этиловым спиртом, растворяют в 0,02 М растворе натрия гидроксида, после чего осаждение повторяют. Промытый водой осадок растворяют в 0,02 М растворе натрия гидроксида, пропускают через катионит в Н-форме, сушат. Декальцинирование и десульфирование образца с помощью 2 М раствора кислоты хлороводородной уменьшает продолжительность операции и увеличивает выход ГК. 0,5 М раствор натрия гидроксида извлекает ароматические ГК и снижает загрязнение минеральными примесями. Перевод грязевого препарата в Н-форму с помощью катио-нита многократно сокращает процесс получения конечного продукта, а сушка при температуре 35-40 С предотвращает деструкцию ГК. Выделение целевых компонентов низкоминерализованных ЛГ повышает эффективность их использования и способствует сохранению экологического равновесия, позволяет получить ЛП, очищенный от солей тяжелых металлов, пестицидов и других продуктов антропогенного воздействия [Агапов А.И. и др., 1998].
Пелоидин (Peloidinum)— водно-солевой экстракт из лечебной грязи Ку-яльницкого лимана Одесской области. Лечебную грязь загружают в керамический бак в количестве 280 кг, и туда же помещают 6,68 кг натрия хлорида и 420 л воды. Смесь настаивают при постоянном перемешивании от 3 до 6 суток при комнатной температуре, пока оставшаяся над грязью профильтрованная жидкость будет иметь плотность 1,008-1,010, содержание хлоридов - 11,5-13,5 г/л, сухой остаток - 12-16 г/л, значение рН=8,2-9,5. Затем жидкость сливают с осадка и дважды фильтруют для удаления механических включений и микроорганизмов: первый раз — через глубинные фильтры, второй — через стерильные пластины или мембранные фильтры с диаметром пор не более 0,3 мкм. Фильтрат нагревают в течение 1,5 ч при температуре 60—70 С и после охлаждения в асептических условиях разливают во флаконы по 0,5 л. Пелоидин входит в состав мази пелан ( пелоидин — 500 г, анальгин - 125 г, вазелин - 125 г и ланолин - 500 г). Применяют ваку-ум-ультрафонофорез пелоидина на мазевой основе в область поражения и рефлексогенные зоны, при язвенной болезни желудка и двеннадцатиперст ной кишки, гастритах, колитах, ранах. Назначают внутрь и наружно [Маш-ковский М.Д., 2006].
ФиБС для инъекций (Fibs pro injectionibus) - отгон лиманной грязи, содержит коричную кислоту и кумарины. Получил название от начальных букв фамилий авторов средства: В.П. Филатова, В.А. Бивер и В.В. Скородинской. Сырьем для получения ЛП служит иловая грязь Куяльницкого лимана, которую перегоняют с водяным паром. Отгон содержит большое количество серы и сероводорода. Для осаждения серы к отгону добавляют натрия хлорид (7,5 г на 1 л), отстаивают и фильтруют через тканевой фильтр. Фильтрование можно заменить сепарацией на жидкостном сепараторе тарельчатого типа, которая обеспечивает получение прозрачного раствора при высокой производительности - 55 л/ч. Сероводород удаляют нагреванием, и раствор повторно перегоняют для освобождения от натрия хлорида. Затем в пелоид добавляют кислоту коричную (0,3-0,4 г на 1 л) и кумарин (0,1 г на 1 л), раствор фильтруют. ФиБС - бесцветная жидкость с запахом кумарина, значение рН 4,6-5,4. Стерилизуют при температуре 120 С в течение 1 ч. Хранят в защищенном отсвета месте. ЛП предназначен для подкожных инъекций. Выпус-каетсяш ампулах по 1 мл. Применяют при блефарите, коньюктивите, кератите, помутнении стекловидного тела, а также при артритах, радикулитах [Машковский М.Д., 2006; Шустов Л.П., 1999].
Разработан способ получения липидов из ЛГ, который заключается в том, что нативную грязь сушат до влажности 12 %, перед экстракцией замачивают ее в 95 % этаноле при рН 9,0, экстракцию проводят этанолом или смесью этанола и неполярного растворителя в соотношении 5:1, а сгущение осуществляют отгонкой в присутствии 1 объема масла вазелинового или растительного. Обезвоживание ЛГ до влажности 12 % дает возможность приготовления гранулированного сырья, т.к. сохраняет достаточную пластичность и адгезию. Проведение процесса экстракции при рН=9,0 повышает выход целевого продукта и увеличивает срок его хранения. Экстракция сырья смесью полярного и неполярного растворителя, например смесью 5 % спирта этило вого и хлороформа, либо экстракция 95 % спиртом этиловым также способствует увеличению выхода целевого продукта и увеличению сроков его хранения. Отгонка спирта этилового или его смеси с неполярным растворителем осуществляется в присутствии 1 объема масла, что предотвращает спекание остатка и способствует количественному переходу липидов из экстракта в масляный раствор [Щербак И.Ф., Симонян А.В., 1995].
Известен способ получения липидов, включающий экстракцию органическим растворителем непосредственно нативной грязи [Симонян А.В., 1998]. Повышение выхода продукта и обеспечение микробиологической чистоты достигается экстрагированием органическими растворителями ЛГ. На-тивную грязь с влажностью 50-60 % обезвоживают отжатием под грузом до остаточной влажности 20-40 %, экстрагируют в массовом соотношении 1,5: 0,5: 1,0 маслом и этанолом соответственно при температуре 98-100 С до концентрации суммы каротиноидов в отдельной пробе не менее 22 мг %. Полученный концентрат разбавляют стерильным маслом в соотношении 1:9 и стерилизуют в течение 2-3 ч при 125-130 С [Щербак И:Ф. и др., 2000].
Разработанные способы получения липидов позволяют получить препараты ЛГ Тамбуканского озера расположенного в окрестностях Пятигорска, и соленого озера Эльтон Волгоградской области. Препарат «Тамбуканской грязи» включен в Государственный реестр лекарственных средств РФ (Per. № 71/528/48). Источником получения ЛП является иловая лечебная грязь Тамбуканского озера. ЛК содержит: глицериды, насыщенные и ненасыщенные высокомолекулярные органические кислоты, стерины, фосфолипиды (лецитины и кефалины), каротины, ксантофиллы, хлорофиллы. Грязевой ЛП оказывает противовоспалительное, антибактериальное, биостимулирующие действие. ЛК из Тамбуканской грязи применяют при ожогах, гнойно-воспалительных процессах, заболеваниях периферических сосудов, при язвенной болезни желудка и 12-ти перстной кишки, при кератитах, гингивитах [Карагулов, Х.Г. и др., 2006; Меркулова Г.А., 2008].
Определение состава и концентрации вспомогательных веществ
Большинство используемых на сегодняшний день мазей, обладает узконаправленным действием,, а для лечения в I фазе раневого процесса необходимо воздействие как минимум в трех направлениях: усиление оттока из раны, некротическое действие, подавление патогенной микрофлоры. Мази, используемые в I фазе, должны, поглощать раневой экссудат, т.е. обладать осмотическими свойствами. Для создания терапевтической концентрации мази должны обеспечивать высвобождение из ЛФ и транспортирования ЛВ в зону повреждения, а также способствовать восстановлению микроциркуляции в раневой области и стабилизации клеточных мембран, ингибировать активность протеолитических ферментов для предотвращения вторичного некроза, проявлять противовоспалительное действие. Поэтому одной из задач фармацевтической технологии является создание новых мягких ЛФ, оказывающих широко направленное действие на основные этиопатогенетические факторы.воспалительного процесса [Астраханова М.М., Алексеев К.В., 1997; Багирова В.Л. и др., 2002; Даценко Б.М., 1984; Зверева Е.Ю., 2006].
Для решения поставленных задач одной из наиболее рациональных ЛФ могут быть мази на основе сплава полиэтиленоксидов, являющихся относительно индифферентными соединениями. Они легко наносятся и распределяются на раневые поверхности, не препятствуют влаго- и газообмену тканей, не нарушают их физиологические функции. ПЭО оказывают слабое бактерицидное действие, обусловленное дегидратирующим действием, которое распространяется и на микробные клетки, вследствие чего происходит их обезвоживание и гибель. Кроме того, ПЭО основы хорошо смешиваются с различными жидкостями, в том числе и раневым экссудатом, малочувствительны к введению электролитов и изменениям рН [Гаврилин М .В:, Иодлужная А\В., 2002; Шараф. X. и др., 2001].
Нами приготовлены образцы, содержащие в оптимальных соотношениях сплавы ПЭО с различными М.м., обладающие мазеобразной консистенцией. Исследованию подвергли образцы мази, с содержанием, масляного раствора- Ж 10 % следующих составов: ПЭО-400:ПЭО-1500 (2:1) (образец № 1), ПЭО 00:ПЭО-1500 (3:1) (образец № 2), ПЭО-400:ПЭО-4000 (3:2) (образец № 3), ПЭО 00:ПЭО-4000 (3:1) (образец № 4). Свежеприготовленные образцы.мази- исследовали- в соответствии с требованиями ГФ XL , предъявляемыми мазям (табл. 6).
Определения коллоидной стабильности мази проводили центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин., что способствует коагуляции или коалесценции систем, обладающих кинетической и агрегативной неустойчивостью [ГОСТ 29188.3-91].
Термическая стабильность определена нами следующим образом: образцы хранили при температуре + 40 С в течение 2 сут. с последующим центрифугированием, как описано выше.
Установлено, что по органолептическим свойствам наиболее оптимальной консистенцией обладают образцы мази следующих составов: сплав образец № 1, образец № 4, образец № 2.
Использование в качестве основы сплавов ПЭО-400:НЭО 4000 (3:2) (образец № 3) приводит к получению мази, обладающей неудовлетворительными органолептическими свойствами (непластичная, неоднородная- консистенция). Установлено, что по исследуемым показателям качества соответствуют требованиям, предъявляемым к дерматологическим мазям образцы № 1 и № 4 (табл. 6). Для образцов, обладающих удовлетворительными показателями качества, предъявляемыми к дерматологическим мазям (орга-нолептические свойства, однородность, стабильность, значение рН) проведено исследование структурно-механических свойств.
Упруго-вязко-пластичные свойства образцов мази исследовали на вискозиметре Brookfield RVDV Il+Pro. Для оценки консистенции образцов мази анализировали полученные в диапазонах скоростей деформации рео-граммы течения, соответствующие скоростям технологической обработки.
Полученные данные показали, что наилучшими тиксотропными свойствами, характеризующими способность дисперсной фазы восстанавливать структуру после прекращения механических воздействий на неё, обладает образец № 1. Анализ петли гистерезиса показывает, что напряжение сдвига сначала резко, а потом плавно возрастает с увеличением скорости деформации до величин, способствующих полному разрушению структуры мази (рис. 4). В период убывающего напряжения сдвига вязкость мази вновь воз растает, однако восстановление исходной структуры запаздывает у образца № 4, свойства композиции № 1 полностью восстанавливаются.
Этот процесс, который отражает на графике в виде петли гистерезиса, образованный восходящей и нисходящей кривыми, характеризует тиксо-тропные свойства мази, обеспечивая ее равномерное и сплошное распределение на поверхности кожи и слизистой оболочки [Моисеева А.Е. и др., 2001]. На основании полученных данных для образца № 1 определены значения коэффициентов динамического разжижения Кд=46 % и механической стабильности МС=0,22. Полученные значения свидетельствуют о незначительной степени разрушения структурного каркаса и о тиксотропных свойствах системы.
Таким образом, образец мази, приготовленный на основе ПЭО— 400:ПЭО-1500 (2:1) стабилен и характеризуется удовлетворительными реологическими показателями. Состав мази на 100,0 г:
Определение осмотической активности
До недавнего времени основы для мазей считали индифферентными веществами и служили вспомогательным агентом при изготовлении мазей. В результате биофармацевтических исследований, отмечено, что мазевой основе принадлежит важная роль в обеспечении терапевтического эффекта. В настоящее время наметилась тенденция к более широкому использованию мягких ЛФ - мазей в различных областях медицины. Значительно расширился диапазон применения мазей в проктологии, офтальмологии, оториноларингологии, гинекологии, в хирургии при лечении гнойной раневой инфекции. При использовании мазей для лечения гнойно-воспалительных процессов, необходимо учитывать их осмотическую активность, которая во многом определяет специфическую активность мази, особенно на первой фазе раневого процесса. В данном случае мазевая основа способствует отторжению некротических масс, очищает рану, впитывает раневое отделяемое; оказывает потенцирующее действие на лечебный эффект мази в целом. Согласно современным требованиям ЛФ, применяемые для лечения ран должны соответствовать состоянию раневой поверхности. Одним из важных свойств мазей для лечения ран I фазы раневого процесса является наличие осмотического эффекта, которое обеспечивает отток гнойно-раневого содержимого и создает необходимые условия для заживления поврежденных тканей [Гунько, В.Г. и ДР, 1982].
На этом основании целесообразно проведение исследований по определению осмотической активности разработанных мазевых композиций. Суть метода заключается в следующем: в диализатор (полупроницаемая мембрана - целлофан диаметром 45 мм с величиной пор 0,025 мм) помещают 10,0 г мази, в диализную камеру наливают физиологический 0,9 % раствор натрия хлорида. Диализатор термостатируют при 37 С и каждый час проводят взвешивание. По разнице между полученным и предыдущим результатом определяют количество физиологического раствора, поглощенной исследуемой мазевой композицией. Диализ проводят до установления постоянной массы исследуемой системы. В качестве контроля используют 10 % раствор натрия хлорида (рис. 5).
Таким образом, проведенными исследованиями на модели диализа через полупроницаемую мембрану установлено, что мазь на основе ПЭО обладает высокой и продолжительной осмотической активностью необходимой в I фазе раневого процесса и может быть рекомендована для лечения раневой поверхности с обильной экссудацией.
Стандартизация и изучение стабильности эмульсионной мази на основе метилцеллюлозы в процессе хранения
Оценку качества разработанной нами ЛФ проводили по показателям описание, растворимость, подлинность, количественного содержания каротиноидов в пересчете на р-каротин, перекисное число (ПЧ), коллоидная стабильность, микробиологическая чистота, размер частиц дисперсной фазы (табл. 17). При разработке методик качественного и количественного анализа ЛК в ЛФ использованы методы, модифицированные нами с учетом специфики мягких лекарственных форм.. Описание. Мазь гелеобразной однородной консистенции светло-желтого цвета со слабым своеобразным запахом:
Растворимость. Мазь растворима в воде, умеренно растворим в 96 % этаноле.
Значение рН определяют потенциометрически (ГФ ХП, т. 1, ОФС 42-0048-07).
Перекисное число определяют в соответствии с ГОСТ Р 51487-99 «Масла растительные и жиры, животные. Метод определения перекисного числа».
Подлинность. К 1, 0 г ЛФ добавляют 2 мл хлороформа, встряхивают и добавляют 0,5 мл кислоты серной концентрированной. Верхний слой жидкости окрашивается в сине-зеленый цвет. Количественное содержание суммы каротиноидов в эмульсионной мази на основе МЦ проводят по модифицированной нами методике: около 0,5 г (точная навеска) мази помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл. Добавляют 15 мл воды очищенной и перемешивают до полного растворения мази. Объем раствора в колбе доводят водой очищенной до метки и тщательно перемешивают. Содержимое мерной колбы переносят в делительную воронку, добавляют 25 мл хлороформа, перемешивают, хлороформное извлечение отделяют и центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. Содержание каротиноидов определяют по формуле (см. раздел 2.2.1)
Нами проведены исследования степени дисперсности частиц разработанной эмульсионной мази (ГФ XI, вып. 2, стр. 146). Эмульсионная мазь является гетерогенной термодинамически неустойчивой системой, т. к. характеризуется развитой поверхностью раздела фаз и обладает избытком свободной поверхностной энергией. Однако, в результате использовании в качестве основы 7 % геля МЦ, обладающего большой вязкостью, стабильность эмульсионной мази в процессе хранения сохраняется (рис. 11).
Оценку коллоидной стабильности ЛФ проводили методом центрифугирования по следующей методике: 10,0 мази центрифугируют 5 минут при частоте-вращения 6000 об/мин. Рассчитывают коэффициент К Н/Н, где: Н/ - в высота слоя жидкости, выделившейся после центрифугирования; Н — первоначальная высота слоя мази в пробирке (ГОСТ 29188.3-91) (табл. 17).
Проведенный анализ показал, что в процессе хранения мазь устойчива и сохраняет свойства высокодисперсной эмульсии, что можно объяснить высокой вязкостью дисперсионной среды.
Стерильность эмульсионной, мази «Эльтон» подтверждена в КАЛ ГУЗ «Волгоградский Центр сертификации и контроля качества лекарственных средств» (соотв. требованиям ГФХП, т. 1, ОФС 42-0066-07, с. 150) (приложение 2).
Таким образом, проведенные исследование стабильности эмульсионной мази «Эльтон» на основе 7 % МЦ свидетельствует о её соответствии требованиям проекта ФСП 42- на эмульсионную мазь «Эльтон» (приложение 1)
Исследование ранозаживляющей активности
При исследовании процессов заживления ожоговой поверхности нами отобраны наиболее информативные критерии: площадь ожоговой поверхности и гистологическое исследование аутопсииного материала, полученного при выведении животных из эксперимента на 3, 7 и 14 сутки.
Данные критерии представляют собой совокупность трех адекватных методов исследования, показатели которых отражают различные стороны течения- раневого процесса и обеспечивают наиболее достоверную и максимально объективную оценку процесса заживления [ Хэм А., Кормак Д., 1983; Волкова О.В:, Елецкий Ю.К., 1971]. Животным под нембуталовым наркозом (40 мг/кг) наносились ожоговые повреждения твердофазным индукционно-терморегуляционным способом (80 С) с известной площадью 255 мм2 в течение 15 секунд в области спины. Для исключения погрешностей при оценке степени регенераторного процесса ожоговые повреждения наносили в верхней и нижней трети спины поочередно. Одна из ожоговых поверхностей на теле каждого животного являлась образцом сравнения (без лечения). Живот- ные содержались в условиях вивария при стандартном режиме кормления и освещения- при температуре 25 С изолированно друг от друга. Полученные» образцы кожи помещали в-10 % нейтральный раствор формалина с последующей проводкой по стандартной методике и окраской гематоксилином и эозином. При гистологическом исследовании мы определяли характер заживления раны: воспалительный, воспалительно-регенеративный, регенеративный, путем оценки степени эпителизации и характера струпа, степени и характера клеточной инфильтрации, состояния сосудистого русла, состояния придатков кожи и собственно дермы (прилож. 3).
Результаты гистологического исследования ожоговых ран при применении исследуемых образцов мазей показали, что на 3 сутки эксперимента при применении олеогеля «Эльтон» появляются признаки краевой эпитализациии (прилож. 3). Струп плотно прилегает к подлежащим тканям и представляет собой плотный эозинофильный слой с коагулированными клетками эпидермиса. Под струпом отмечается умеренная лейкоцитарная инфильтрация, наличие которой активно влияет на сроки заживления и на скорость эпитализа-ции. Наблюдается также незначительное полнокровие сосудов глубоких слоев дермы. При применении мази «Эльтон» на основе МЦ эпителизация происходит по перифолликулярному типу и имеет очаговый характер. Следует отметить, что под струпом на этом этапе начинает формироваться незрелая грануляционная ткань. Клеточная инфильтрация варьирует от умеренно выраженной до слабо выраженной; что видимо, связано с индивидуальной реактивностью животных. Сосудистая реакция слабая. При использовании мази «Эльтон» на основе ПЭО в течение 3 суток эксперимента отмечаются признаки перифолликулярной эпителизации при практическом отсутствии признаков заживления от края-дефекта. Демаркационное воспаление слабо выражено. Отмечается также незначительное полнокровие капилляров глубокого слоя дермы и первые признаки образования грануляционной ткани.
На 7 сутки эксперимента гистологическое исследование при применении олеогеля «Эльтон» характеризуется краевой эпителизацией и эпителиза-цией по перифолликулярному типу (прилож. 3). Собственно дерма в области ожогового повреждения представлена незрелой грануляционной тканью. Применение мази «Эльтон» на основе МЦ показало, что1 эпителизация происходит по перифолликулярному типу. Обращает на себя внимание небольшое количество гомогенной эозинофильной жидкости под струпом (раневого экссудата), что связано с первоначальной реакцией сосудистого русла на повреждение. Эпителизация выражена в большей степени, чем в других образцах. Собственно дерма также представлена грануляционной тканью с признаками созревания-. При применении мази «Эльтон» на основе ПЭО установлено, что заживление ожоговой раны происходит аналогичным образом, однако грануляционная ткань достаточно рыхлая, струп плотно прилежит к дерме. Заживление ожоговой раны контрольного образца (без лечения) происходит более медленно, эпителизация начинается с краев дефекта и по перифолликулярному типу. В местах эпителизации происходит постепенное отторжение струпа. Собственно дерма в области ожогового повреждения представлена незрелой грануляционной тканью с бедной васкуляризацией.
На 14 сутки исследования при лечении раневой поверхности олеогелем «Эльтон» наблюдается краевая эпителизация (прилож. 3). Отмечается обильная васкуляризация по сравнению с другими образцами. В отдельных случаях наблюдается частичное отторжение струпа с краев ожоговой раны в местах эпителизации. При использовании мази «Эльтон» на основе МЦ наблюдается активное разрастание пласта эпителия с булавовидными выростами неправильной формы, а также краевая пролиферация эпителия и пролиферация эпителия волосяных фолликулов. Под струпом во всех случаях обнаруживается грануляционная ткань с признаками зрелости. При использовании мази «Эльтон» на основе ПЭО эпителизация шла за счет краевого эпителия с равномерным замещением ожогового дефекта и отторжением струпа в мес-тах эпителизации. В контрольном образце происходила краевая эпителизация, но пласт эпителия заметно более массивный обильным роговым слоем по краям дефекта.. Отторжения струпа практически не наблюдается. Дерма также представлена незрелой грануляционной тканью.
Следует отметить, что при использовании мази «Левомеколь» эпителизация происходит с элементами патологической регенерации, проявляющаяся в виде роста эпителия вокруг волосяного фолликула. Применение исследуемых образцов мазей «Эльтон» вызывает заживление ожоговой поверхности, особенностью которой является длительное сохранение струпа (вплоть до полной эпителизации), что обуславливает асептическое ведение раны и объясняет низкую микробную обсемененность. Для такой раны характерно относительно более быстрое созревание грануляционной ткани, процесс вас-куляризации и эпителизации происходит практически исключительно с краев ожоговой раны. Ни в одном из случаев не наблюдается гнойно-деструктивных осложнений, заживление происходит без образования рубца. Материалом для бактериологического исследования ожоговых поверхностей послужили смывы с ожоговой поверхности кожи крыс. Ожоговая поверхность крыс обрабатывалась образцами мазей, содержащими БАВ ЛГ озера Эльтон. В качестве группы сравнения использовали смывы с ожоговых поверхностей у животных, не подвергавшихся лечению.
Количественный и видовой состав микрофлоры ожоговой поверхности изучали бактериологическим методом. Для этого смывы с поверхности ожога (после предварительного подращивания микроорганизмов в мясо-пептонном бульоне в течение 24 ч) высевали на универсальную плотную среду — МПА с последующим пересевом на дифференциально-диагностические среды и определением общейк микробной обсемененности при применении различных лекарственных препаратов. Посева смывов производили на 3, 7 и 14 сутки эксперимента.
Для выделения микробов семейства Enterobacteriaceae использовали среду Эндо, для выделения Staphylococcus - желточно-солевой- агар, дрож-жеподобные грибы-рода-. Candida- культивировали на среде Сабуро (НИИЭМ им: Пастера, Россия). Для определения гемолитической активности микроорганизмов использовали 5 % кровяной агар. Посевы инкубировали в термостате 24-48.часовпри?температуре 37 С.
При исследовании обсемененности ожоговой поверхности учитывали:: 1) общее количество микроорганизмов;" 2) количество микробов семейства Enterobacteriaceae; 3) количество Staphylococcus; 4) обсемененность грибами рода Candida.
Культуры, выросшие на питательных средах подвергали групповой и родовой идентификации. Таксономическую принадлежность бактерий определяли покультуральным (рост бактерий в аэробных, характер роста на селективных средах), тинкториальным (ЗАО «НПО Биоконт», Россия), и-биохимическим свойствам.
Биохимическую идентификацию энтеробактерий проводили с использованием стандартных микро-тест-систем (МТС-М-12Е, НПО «Питательные среды», Россия), учитывая ферментацию глюкозы с образованием кислоты и газа, расщепление лактозы, образования сероводорода, ферментации маннита, сахарозы, сорбита, мочевины. Идентификация стафилококков проводилась в соответствии с приказом № 691 от 28.12.1989, с использованием стандартных микро-тест-систем (МТС- С, НПО «Питательные среды», Россия). Патогенность определяли по их способности вырабатывать токсин и ферменты агрессии (плазмокоагулазу, лецитовиттелазу, гемолизин).
Дрожжеподобные грибы высевали на среде Сабуро. Идентификация выделенных грибов проводилась по определению типа филаментации, ферментативной активности (расщепление лактозы, мальтозы, сахарозы, галактозы).
Оценивали частоту встречаемости отдельных видов микроорганизмов, в зависимости от биотопа и применяемых препаратов для лечения ожогов, плотность бактериальной обсемененности в динамике на 3, 7 и 14 сут. лечения ожоговой поверхности.
Установлено, что основными представителями, высеваемыми с ожоговой поверхности, являются стафилококки, а именно S. saprophyticus, S. epi-dermidis, S. aureus. Анализ доминантности состава стафилококков показал, что при использовании образцов мази «Эльтон» превалировал непатогенный сапрофитический стафилококк (на биотопах, обрабатываемых олеогелем -76,9 %, мазью на основе МЦ - 67 %, мазью на основе ПЭО - до 100 %, масляным раствором- 58,7 %), что свидетельствует о положительном влиянии мази на ожоговую поверхность. На ожоговой поверхности группы сравнения абсолютно доминирует золотистый стафилококк (54,8 %) и эпидермальный стафилококк с гемолитическими свойствами. В1 то же время традиционно применяющийся в настоящее время препарат «Левомеколь», по-видимому, утрачивает свою привлекательность, в связи с тем, что на» биотопах, обрабатываемых данным лекарственным средством, доминировал золотистый стафилококк (45,1 %), наличие которого осложняет течение раневого и ожогового процесса и обусловливает гнойные осложнения.
Показатель доминантности у энтеробактерий был максимальным на ожоговой поверхности без лечения, минимальным при применении масляного раствора «Эльтон» — 8,3 %. Наличие в биоценозе микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae, в частности Escherihia coli, может быть расценено как один из показателей снижения неспецифической реактивности данного конкретного организма. Но может быть связан с локализацией биотопа (нижняя часть тела животного). Показатель постоянства вида для грибов рода Candida был минимальным при использовании масляного раствора «Эльтон» (25%), наибольшим - в группе контроля (75 %), при этом образованная ассоциация «грибы рода Candida + Staphylococcus», является прогностически чрезвычайно неблагоприятной и свидетельствует об экологическом неблагополучии данного биотопа и повышенном риске нагноения.
