Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 14
1.1. Основы для мягких лекарственных форм 14
1.1.1. Гидрофобные основы их преимущества и недостатки 16
1.1.2. Гидрофильные основы их преимущества и недостатки 28
1.1.3. Дифильные мазевые основы их преимущества и недостатки 32
Глава 2. Материалы и методы исследования 35
2.1. Материалы 35
2.1.1. Краткая характеристика экспериментальных животных 35
2.1.2. Описание основ для мягких лекарственных форм, применённых в исследовании 36
2.2. Методы исследования 37
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 43
3.1. Доклиническая оценка токсичности, безопасности в применении основ для мягких лекарственных форм 43
3.2. Исследование общефармакологического действия мягких основ 47
3.2.1. Влияние глицерогидрогелей на этологические показатели крыс на фоне термического ожога 47
3.3. Влияние глицерогидрогелей на основные гематологические показатели у крыс с термическим ожогом при пролонгированном лечении 57
3.4. Влияние глицерогидрогелей на основные биохимические показатели сыворотки крови крыс при термическом ожоге 62
3.5. Изучение местноанестезирующего действия кремниицинксодержащего глицерогидрогеля и глицеролата цинка 65
3.6. Исследование транскутанной активности через кожу лягушек глицерогидрогелей в сравнительном аспекте
Глава 4. STRONG Сравнительная оценка воздействия глицерогидрогелей на процессы репарации в коже крыс и определение возможного общетоксического действия кремнийцинксодержащего
глицерогидрогеля на некоторые висцеральные органы STRONG 72
4.1. Изучение влияния исследуемых основ для мягких лекарственных форм при накожной аппликации на процессы репарации в коже крыс на 19-й день после создания модели термического ожога 72
4.2. Оценка морфологии некоторых висцеральных органов после 5 5-ти дневной накожной аппликации кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля у крыс с ожоговой раной 82
Глава 5. Оценка иммунотропного действия кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля при лечении механической полнокожной раны, осложнённой иммуносупрессией 87
5.1. Сравнительная оценка процессов репарации в коже при местном лечении кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля и композицией механической полнокожной раны, осложнённой иммуносупрессией 89
5.2. Оценка иммунотропного действия кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля на 3-й и 8-й день лечения раны, осложнённой иммуносупрессией 94
Заключение 97
Выводы 103
Практические рекомендации 105
Список сокращений 106
Список литературы 1
- Гидрофильные основы их преимущества и недостатки
- Исследование общефармакологического действия мягких основ
- Оценка морфологии некоторых висцеральных органов после 5 5-ти дневной накожной аппликации кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля у крыс с ожоговой раной
- Оценка иммунотропного действия кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля на 3-й и 8-й день лечения раны, осложнённой иммуносупрессией
Гидрофильные основы их преимущества и недостатки
Жиры совместимы со многими лекарственными веществами, они хорошо всасываются, обеспечивают глубокую резорбцию лекарственных веществ. Жиры содержат более 50% ненасыщенных жирных кислот, поэтому их не используют в мазях с окислителями и солями тяжёлых металлов. Мази на основе жиров можно хранить не более 1—2 недель, так как при хранении жиры имеют свойства окисляться с образованием пероксидов, которые вызывают разложение лекарственных веществ и могут оказывать раздражающее действие на кожу [25, 28, 38].
Фармакопеи Европы и США ограничивают применение жиров в составе основ для мягких лекарственных форм [36, 37, 109]. В производстве отечественных мазей используется свиной жир. В косметической практике в качестве основ используют жиры: говяжий, бараний, норковый, куриный, утиный, кашалотовый и китовый.
Жир свиной (Adepssuillus (axungiaporcina) depuratus) не прогорклый имеет белый цвет. По химическому строению состоит из триглицеридов олеиновой, пальмитиновой, стеариновой кислот, содержит незначительное количество холестерина, который обеспечивает эмульгирующие свойства основы. Температура плавления свиного жира 34-46С. Жир свиной наиболее близок по своим свойствам к человеческому жиру. Он легко наносится и распределяется по коже, хорошо смывается, легко отдаёт лекарственные вещества, не оказывает раздражающего действия на кожу, не препятствует кожному дыханию, сплавляется с другими жирами. Недостатки свиного жира как основы для мягких лекарственных форм: под действием кислорода воздуха, света, влаги он окисляется, приобретает кислую реакцию, неприятный запах и раздражающее действие на кожу. Жир свиной химически неиндифферентен. Непредельные жирные кислоты разрушаются с образованием озонидов. Жир свиной не совместим с окислителями, йодидами, полифенолами, адреналином. Основа реагирует со щелочными соединениями, с солями тяжёлых металлов (образует токсичные металлические мыла). В мазях серной простой, калия йодида простой, скипидарной, йодной, йодоформной, карболовой, колларголовой, календулы, в состав которых входит свиной жир, его заменяют консистентной эмульсионной основой типа вода/масло [3, 57, 67].
Жир бычий (Sebumbovinum) - это триглицериды пальмитиновой, стеариновой, олеиновой кислот. Температура его плавления 42-50С. По свойствам уступает жиру свиному из-за высокой температуры плавления. Бычий жир, а также бараний используются как уплотнители мазевых основ.
Растительные масла (жиры). Представляют собой смесь триглицеридов предельных и непредельных высших жирных кислот. При сравнении с животными жирами растительные масла содержат большее количество непредельных кислот. Они хорошо всасываются и обеспечивают глубокую резорбцию лекарственных веществ. Растительные масла (кокосовое, пальмоядровое, пальмовое) при увеличении содержания предельных кислот могут иметь твёрдую консистенцию. Твёрдые растительные масла в качестве основы не обладают достаточной пластичностью и используются как уплотнители мазевых основ. Жидкие растительные масла не пригодны в качестве основы в чистом виде. Они применяются в качестве компонентов основ в линиментах (олименты), в смеси с твёрдыми веществами (восками, парафинами), для получения эмульсионных основ. В зависимости от содержания непредельных кислот масла деляться: невысыхающие (оливковое, персиковое, абрикосовое, какао, кунжутное, кокосовое, пальмовое, пальмоядровое); полувысыхающие (касторовое, подсолнечное); высыхающие (арахисовое, льняное, хлопковое). Все невысыхающие масла хорошо переносятся кожей, смягчают эпидермис, всасываются. Высыхающие масла могут оказывать раздражающее действие на кожу. Растительные масла при длительном хранении могут окисляться (гидролизоваться вследствие содержания воды), образовывать пероксиды. Они более устойчивы к развитию микрофлоры, чем животные жиры, вследствие содержания фитонцидов [59, 77, 107, 117].
Гидрогенизированные жиры. Для получения мазевых основ с мягкой консистенцией из растительных масел и жидких животных жиров используют направленную гидрогенизацию, фракционирование, переэтерификацию. Гидрогенизированные жиры - это полусинтетические продукты, получаемые при каталитическом гидрировании жидких растительных жиров. При этом происходит насыщение непредельных жирных кислот, консистенция жиров уплотняется. В зависимости от степени гидрирования можно получать продукты любой консистенции, с различными температурами плавления. Гидрированные жиры имеют повышенную стабильность при хранении.
В качестве основ для мягких лекарственных форм применяют: гидрожир -смесь рафинированных растительных масел. По свойствам гидрожир близок к свиному жиру, но имеет более плотную консистенцию. Растительное сало — представляет собой сплав 80-90% гидрожира и 20-10% растительного масла. Комбижир - сплав 55% гидрожира, 30% растительного масла и 15% животного жира (говяжьего, свиного или гидрогенизированного китового). Температура плавления 26-32С. Он хорошо намазывается, совместим с большим количеством лекарственных веществ. Недостатком комбижира как основы является более медленное высвобождение лекарственных веществ по сравнению со свиным жиром. В качестве основ для мазей с калия йодидом, экстрактом красавки, серой используют гидрогенизированные арахисовое и касторовое масла, которые имеют вязкопластичную консистенцию, температуру плавления 38-41 С [77, 91,103,106].
Углеводородные основы представляют собой продукты перегонки нефти. Преимущественно состоят из смеси предельных углеводородов. Они микробиологически и химически индифферентны, хорошо смешиваются с жирами и маслами, совместимы с большим количеством лекарственных веществ, не всасываются. Данные основы плохо высвобождают лекарственные вещества, а при длительном применении оказывают раздражающее действие на эпидермис кожи. Применяют как основы в мазях наружного действия. Они способны нарушать газообмен кожи.
Исследование общефармакологического действия мягких основ
Моделирование ожоговой раны II- Ша степени создавали путём плотного контакта предварительно обработанной от шерсти кожи крыс с металлической пластиной площадью 1200 мм2 (20 60мм) разогретой до температуры 100-98С. Эту процедуру осуществляли под эфирным рауш - наркозом в течение 40 сек [92].
Исследуемые гели в дозе 2000мг/кг наносили на поражённый участок кожи один раз в сутки, в одно и тоже время, равномерно распределяя по всей ожоговой поверхности в течение 20 дней (курсовое лечение). Для оценки отдалённых последствий влияния изучаемых основ продолжали до 50 дней. Лабораторные методы исследования После завершения курса лечения (19 суток) термического ожога у 5 животных из каждой группы под эфирным наркозом брали кровь из полостей сердца. Оставшимся крысам продолжали нанесение гелей в течение 35 дней для выявления возможного как местного, так и общего отрицательного действия на организм экспериментальных особей. После последнего указанного срока применения изучаемых основ провели забор крови оставшимся 25-ти крысам вышеуказанным методом. Показатели общего анализа периферической крови исследовали на аппарате Mythic 18, биохимические показатели исследовали на автоматическом анализаторе INTEGRA 400 Plus.
Морфологические методы Гисто-морфологические исследования экспериментального материала кожного лоскута крыс выполняли на базе гистологической лаборатории ЦНИЛ УГМУ. В исследование включали 6 групп крыс популяции линии Wistar, по 5 особей в каждой. Гистологические препараты получали на 19-й день лечения созданного термического ожога после выведения животных из эксперимента. Пять групп с различным локальным воздействием (аппликации) на кожу глицерогидрогелями и контрольная - ожог без лечения. Далее тканевые образцы, полученные при вырезке материала, проводили по спиртам возрастающей концентрации, заливали в парафин. Для приготовления гистологических срезов использовали микротом НМ-450 MICROM. Гистологические срезы внутренних органов (печени, лёгких, почек, селезёнки, головного мозга, сердца) окрашивали гематоксилином эозином, пикрофуксином и фуксилином. Микропрепараты исследовали на микроскопе Olympus СХ41 с применением стандартных объективов при увеличении 50, 100, 200, 400. Морфометрическое исследование осуществляли с оценкой степени васкуляризации дермы в зоне аппликации с применением сетки Автандилова в группах сравнения [1]; активность воспалительной реакции оценивали полуколичественно по содержанию нейтрофильных гранулоцитов в клеточном составе грануляционной ткани. Для полуколичественной оценки использовались категории: + слабая, ++ умеренная, +++ выраженная инфильтрация.
Метод оценки чувствительности и двигательной активности мелких лабораторных животных (мышей) к термическому раздражению
Эксперимент осуществляли при использовании методики исследования болевой чувствительности на «горячей пластинке» по Эдди и Леймбаху. На кафедре фармакологии ГБОУ ВПО УГМУ Минздрава России Л.П. Ларионовым методика была усовершенствована и получила название актотермальгезиметрия (АТАМ-0,01). Прибор представляет собой прозрачный цилиндр диаметром 30 см и высотой боковой стенки 32 см, дно изготовлено из алюминия диаметром 30 см. Встроенный нагревательный элемент поддерживает постоянную температуру дна (55С). В приборе предусмотрены 2 уровня световых лучей на высоте 3 и 6 см для регистрации горизонтальной и вертикальной локомоторной активности в момент нахождения в эксперименте. Методика заключается в оценке болевого рефлекса при контакте подушечек лап с горячей поверхностью, что основано на измерении времени до момента отдёргивания передней или задней лапы, облизывания лап и / или прыжка. Поведенческие реакции оценивали через 10, 30, 60, 90, 120 минут после нанесения КЦГТ и глицеролата цинка на подушечки лап мышей.
Метод оценки транскутанной активности
Метод заключается в измерении степени диффузии ципрофлоксацина в присутствии исследуемых основ через естественные мембраны из интактной кожи лягушек. Данный эксперимент проводили на предварительно отпрепарированных лоскутах кожи лягушек (10 особей) массой 30-40 г. Под рауш-наркозом лягушек декапитировали. Затем брали с передней стенки живота лоскуты кожи, промывали изотоническим раствором хлорида натрия. Подготовленную кожу закрепляли на основаниях полых стеклянных цилиндров диаметром 5 см стороной эпидермиса вовнутрь. На поверхность кожи наносили по 5 г мази с ципрофлоксацином, исходная концентрация которого составила 10%. Затем цилиндры с кожей погружали в ёмкости с дистиллированной водой объёмом 50 мл. Опыты проводили параллельно при времени выдержки 3, 6 и 9 часов.
Создание модели раны, осложнённой иммуносупрессией
По данным литературы цинк, как химический элемент обладает иммунотропной активностью. Оценку иммуностимулирующего действия КЦГ изучали на модели раны, осложнённой иммуносупрессией. Эксперимент проводили на крысах, разделённых на 4 группы по 10 животных в каждой. За 1 день до создание механической раны животным вводили гидрокортизон 25мг/кг массы тела внутримышечно, кроме группы контроля. Далее крысам под эфирным наркозом создавали на спиной поверхности полнокожные раны диаметром 8 мм скальпелем для биопсии, продолжая введение гидрокортизона опытным группам. По 5 животных из каждой группы выводили из эксперимента под эфирным наркозом на 3-й и 8-й день эксперимента, проводили забор лоскутов кожных ран для последующего гистологического и иммуногистохимического исследования [73,162].
Иммуно-гистохимическое исследование
Срезы ткани в парафине размещали на готовые предметные стёкла с полизиновым покрытием и хорошо просушивали. Депарафинизацию осуществляли обработкой ксилолом и спиртами различной концентрации. Восстановление эпитопов проводили высокотемпературным методом путём нагревания в течение 10 мин в цитратном буфере (рН 6.0). Протокол исследования: промывку образцов после каждого этапа осуществляли в фосфатно-солевом буфере (20Х PBS IHC Wash Buffer+Tween 20) в течение 5мин; до инкубации с антителом проводили инактивацию эндогенной пероксидазы; для идентификации макрофагов в зоне раны использовали первичное антитело CD 68 (Ab-3 (КР1) Thermo scientific) в разведении 1:6000. В качестве системы визуализации применяли универсальный иммуно-пероксидазный полимер Histofine Simple Stain MAX PO (30 мин) и ДАБ Histofine DAB (5 мин). Докрашивание ядер проводили гематоксилином, просветление в ксилолах. Микропрепараты исследовали на микроскопе Olympus СХ41 с применением стандартных объективов при увеличении 50, 100, 200, 400.
Методы статистической обработки результатов
Статистическую обработку результатов проводили на базе пакета стандартных программ Windows (Excel) и Statistica 6.0. Достоверными считались различия показателей при р 0,05. Результаты представлены в виде среднего арифметического ± стандартная ошибка среднего (М±т). Для оценки достоверности различий параметрических показателей применяли t-критерий Стьюдента и непараметрических показателей Манна-Уитни, критический уровень значимости при проверке статистических гипотез принимали меньшим или равным 0,05 [26, 60, 105].
Оценка морфологии некоторых висцеральных органов после 5 5-ти дневной накожной аппликации кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля у крыс с ожоговой раной
В настоящее время представляет интерес сравнительный анализ действия данных глицерогидрогелей на основные биохимические показатели периферической крови при местном лечении ожога. При ожоге отмечается расстройство почечной гемодинамики, выражающееся в резком снижении клубочковой фильтрации и эффективного почечного кровотока, а также поражение секреторной функции почек. Уже в первые часы после ожога, развивается поражение печени с нарушением белковообразовательной, протромбинообразовательной и экскреторной функций. Ожоговая травма сопровождается нарушениями всех видов обмена веществ. Уже на 1-2-й день после ожога начинается генерализованный распад белков в органах и тканях, определяемый по ряду показателей: гипопротеинемия, отрицательный азотистый баланс, увеличенное выведение креатина, аммиака, аминокислот.
Клинико-диагностическое значение при ожоге имеет определение активности аминотрансфераз в сыворотке крови. Наиболее часто активность аминотрансфераз используют с целью дифференциальной диагностики патологии печени и миокарда. Повышение активности отмечается также при травме скелетных мышц. При ожоге наблюдается гиперкреатинемия и увеличение уровня мочевины [20, 32, 64].
В данном разделе эксперимента исследовали показатели биохимического анализа крыс при термическом ожоге в контрольной и опытных группах на фоне лечения выбранными основами. Как ранее описано на 19-ые сутки после ожога, у 50% крыс опытных и контрольной групп под рауш-наркозом с последующей эвтаназией был осуществлён отбор крови из полостей сердца животных. У 50% оставшихся животных забор крови осуществляли на 55-й день после продолжения нанесения основ. Биохимические показатели крови исследовали на автоматическом биохимическом анализаторе INTEGRA 400 Plus. Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTICA 6.0 (США).
Для того чтобы проанализировать материал, представленный в таблицах, мы перевили его в единую единицу измерения - проценты. Из представленных данных таблицы 7 видно, что на 19-й день лечения у 1-й, 2-й, 3-ей и 4-й опытной группы отмечали тенденцию снижения показателя активности аспартатаминотрансферазы в среднем на 15% в сравнении с контролем. Активность фермента аланинаминотрансферазы во всех группах оставалась в пределах нормы. Уровень глюкозы повышен у 2-й группы на 7%, снижен у 1-ой опытной группы экспериментальных животных на 20%, что также можно связать с фактором стресса. Уровень креатинина в сыворотке во всех опытных группах практически не имел отличий от группы контроля. Уровень мочевины снизился у 1-й группы на 13%, а во 2-й группе наблюдали тенденцию снижения на 24% по сравнению с контролем.
Анализируя данные, полученные при длительном нанесении гелей, которые представлены в таблице 8, выявлена тенденция повышения уровня аланинаминотрансферазы 1-й и 4-й опытной группы по сравнению с группой контроля в среднем на 16%. Уровень аспартатаминотрансферазы во всех опытных группах практически не отличался от контроля. Эти результаты практически соответствуют пределам нормальных показателей. Показатели мочевины 1-й, 2-й, 4-й группы имели тенденцию к повышению, но они не достоверны. Это возможно связано с затяжным процессом разрушения мышечной ткани. Таблица 8-Основные биохимические показатели у крыс при термическом ожоге на фоне лечения и без него при отдалённых последствиях на 55-е сутки (М±т)
Таким образом, анализируя результаты биохимических показателей крови, мы сделали выводы о безопасном применении исследуемых глицерогидрогелей при местном курсовом и пролонгированном их нанесении. Изменения некоторых показателей, таких как мочевина, креатинин, глюкоза и активность ферментов можно связать с фактором стресса и процессом разрушения мышечной ткани.
Для исследования активности действия на мышей были выбраны КЦГГ и глицеролат цинка 7п(СзН6Оз) 6СзН8Оз. Их эффект оценивали по времени реакции белых мышей обоего пола массой (20-28 г). Мышам 1-ой группы на подушечки их лап наносили КЦГГ, 2-ой - глицеролат цинка, которые были разведены на воде для инъекций 1:1 в дозе 0,2 мл. При использовании методики «горячая пластинка» поведенческие реакции оценивали исходно, через 30, 60, 90, 120 минут после нанесения данных соединений. Для более удобной оценки полученных данных мы их систематизировали. Показатели вертикальной и горизонтальной активности рассчитывали на единицу времени - секунду.
Анализируя представленный материал в таблице 9 видно, что при нанесении испытуемых соединений имелась тенденция к увеличению времени реакции мышей на термическое раздражение в группе с КЦГГ на 45%, а в группе с глицеролатом цинка на 26 %. На фоне 50% суспензии КЦГГ замедление реакции проявилось в большей степени через 30 мин, а на фоне глицеролата цинка через 60 мин. Достоверно увеличилось время реакции через 30 и уменьшилось через 120 мин после нанесения цинксодержащего глицерогидрогеля и глицеролата цинка по сравнению с исходным уровнем. Для выявления изменений средних показателей мы суммировали 4 измерения и получили результаты, которые представлены в таблице 9. Так при использовании КЦГГ среднее время реакции на термическое раздражение увеличилось на 1,10 с, в то время как с глицеролатом цинка на 1,80 с.
Дополнительно нами проведена статистическая обработка пересечения горизонтальных и вертикальных световых лучей, которая приведена в таблицах 10 и 11. Мы суммировали 4 последних измерения и получили среднее значение. Горизонтальная активность мышей в единицу времени, как видно из таблицы 10, достоверно увеличилась к 60, 90, 120 мин. при нанесении кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля по сравнению с исходными показателями. Общая горизонтальная активность по сравнению с исходным уровнем увеличилась в 3 раза. При использовании глицеролата цинка наблюдали повышение общей активности в 1,7 раз.
Оценивая показатели вертикальной активности мышей в единицу времени, исходя из таблицы 11, наблюдается незначительно увеличение через 60 и 120 мин при применении глицерогидрогеля. Однако снижение её при применении глицеролата цинка через 90 и 120 мин. Общая вертикальная активность при применении КЦГГ увеличилась незначительно в сравнении с исходным уровнем. В группе с глицеролатом цинка общая вертикальная активность снизилась в 2,8 раз. Таблица 11 - Показатели вертикальной активности мышей в единицу времени при термическом раздражении на фоне глицерогидрогелей (М±т)
Оценка иммунотропного действия кремнийцинксодержащего глицерогидрогеля на 3-й и 8-й день лечения раны, осложнённой иммуносупрессией
Эксперимент проводили на белых крысах-самцах популяции линии Wistar массой 180-220г, разделённых на 4 группы по 10 животных в каждой. Крысам опытных групп за сутки до создания модели раны, осложнённой иммуносупрессией, вводили гидрокортизон в дозе 25 мг\кг. На следующий день под эфирным рауш-наркозом на предварительно обработанной от шерсти коже поверхности спины создавали полнокожные раны диаметром 8 мм. Группа 1 -острая рана без лечения, группа 2 - рана, осложнённая иммуносупрессией, без лечения; группа 3 - рана, осложнённая иммуносупрессией, и с нанесением КЦГГ; группа 4 - рана, осложнённая иммуносупрессией, и с нанесением фармацевтичесокй композиции. Всем группам, кроме группы 1, ежедневно вводили гидрокортизон. Гели наносили ежедневно стеклянной палочкой в дозе 50мг\кг. На 3-й и 8-й день эксперимента по 5 крыс из каждой группы выводили из эксперимента под рауш-наркозом. Для гистологического и иммуногистохимических исследований (ИГХ) брали кожные лоскуты размером 2x2, фиксировали в 10% растворе формалина, проводили по спиртам возрастающей концентрации и заливали в парафин. Для приготовления гистологических срезов использовали микротом НМ-450 MICROM. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по методу ван-Гизон и по Вейгерту. ИГХ проводили непрямым методом с применением первичного антитела CD 68 (Ab-3 (КР1) Thermo scientific) в разведении 1:6000.
При гистологическом исследовании выявлено, что во всех группах на 3-й день эксперимента краевая эпителизация отмечалась у 20% крыс, в 80% случаев эпителизация отсутствовала. В 20 % случаев определялось формирование нежной грануляционной ткани, в которой встречались единичные лимфоциты и макрофаги. Во всех группах в этот срок в зоне раны сохранялась выраженная воспалительная реакция с преобладанием в инфильтрации сегментоядерных нейтрофилов и лейкостазом в тонкостенных сосудах. Значимых морфологических отличий между группами сравнения на 3-й день эксперимента выявлено не было (рисунок 28).
В группе 1 (острая рана без лечения) на 8 день эксперимента в 75% случаев выявлена краевая эпителизация. В 25 % случаев сохранялся дефект эпидермиса с умеренно-выраженной воспалительной реакцией. Отмечался пролиферативный акантоз и формирование слоя грануляционной ткани (рисунок 29).
В группе 2 (рана, осложнённая иммуносупрессией, без лечения) на 8 день эксперимента краевая эпителизация отмечалась в 60 % случаев. В 40 % случаев сохранялся дефект. Отмечалась выраженная воспалительная реакция и лейкостаз в тонкостенных сосудах. Выявлено формирование слоя грануляционной ткани с межэпителиальной инфильтрацией лимфоцитами и макрофагами (рисунок 30).
Окр. гематоксилином и эозином. Ув. х 200. Наилучший эффект отмечался в группе 3 (рана, осложнённая иммуносупрессией и аппликацией КЦГГ) на 8-й день эксперимента. В 70% случаев отмечалась краевая эпителизация, заживление под струпом. Полная эпителизация наблюдалась в 30% случаев. Выявлялось снижение воспалительной инфильтрации сегментоядерными нейтрофилами, отсутствие лейкостаза в тонкостенных сосудах капиллярного типа. Формировался слой грануляционной ткани. В новообразованном эпителии встречались единичные лимфоциты и макрофаги (рисунок 31).
В группе 4 (рана, осложнённой иммуносупрессией, при лечении композицией) краевая эпителизация раны выявлена в 75% случаев, полная эпителизация отмечалась в 25 % случаев. Также как и в группе 3, выявлено снижение воспалительной реакции, отмечалось формирование слоя грануляционной ткани (рисунок 32). Рисунок 32 - Группа 4 (рана, осложнённая иммуносупрессией и с аппликацией композицией, 8 день). Фрагмент кожи. Грануляционная ткань.
При сравнительном морфометрическом исследовании количества сосудов в зоне аппликации с помощью сетки Автандилова на 8 день эксперимента было установлено, что в группе 3 при лечении КЦГГ, количество обнаруживаемых сосудов в дерме выше (24,80±2,00) чем в группах сравнения. Наименьший показатель васкуляризации отмечался в группе 2 с раной, осложнённой иммуносупрессией без лечения по сравнению с контрольной группой. В группе 4 при лечении композицией - количество сосудов также достоверно увеличилось (24,00±1,50). Результаты оценки ангиогенеза представлены в таблице 14. Таблица 14-Относительная плотность сосудов в грануляционной ткани на 8 день эксперимента (М±т)
Для первичной оценки иммунотропного действия определяли процентное соотношение клеточного состава в грануляционной ткани в группах сравнения, подсчёт производили на 100 клеток. Как видно из таблицы 15, на 3 день эксперимента во всех группах сравнения в клеточном составе преобладали СЯН, что связано с выраженной воспалительной реакции в ранние сроки после создания раны. Наибольший уровень СЯН (35,40±2,70%) отмечался в группе 2 (рана, осложнённой иммуносупрессией, без лечения). В группе 3 (33,60±1,30%) и группе 4 (32,00±0,48%) отмечалась тенденция снижения СЯН и повышение уровня макрофагов и лимфоцитов.
Как известно заполнение раневого пространства грануляционной тканью начинается приблизительно через четыре дня после повреждения. В это время в ране появляются макрофаги, фибробласты и новые капилляры. Сосуды крови обеспечивают доставку кислорода и питательных веществ к клеткам новой стромы. Макрофаги служат основным источником ростовых факторов, стимулирующих фибробласты и ангиогенез.
На 8 день эксперимента во всех группах в клеточном составе грануляционной ткани количество лимфоцитов и макрофагов увеличилось, а уровень СЯН снизился. Однако, в группе 2 (рана, осложнённая иммуносупрессией без лечения) уровень СЯН оставался высоким (30,60±1,26%). Макрофагам отведена ключевая роль в регуляции заживления ран. Они осуществляют иммунологические функции как антигенпрезентирующие клетки и фагоциты. В раневом очаге макрофаги являются основным источником провоспалительных цитокинов, хемокинов и ростовых факторов.
Следует отметить, что наибольшее снижение уровня СЯН, отмечали в группе 3 с аппликацией КЦГТ на 8 день эксперимента (16,00±1,95%), что можно связать с антибактериальным эффектом основы; при этом имелось достоверное повышение уровня макрофагов (13,00±1,80%), фибробластов (31,00±0,28%) и лимфоцитов (38,50±1,04%), по сравнению с группой 1 и 2. Также, как и в группе 3, в группе 4 отмечали снижение СЯН (18,50±3,15%) и повышение уровня макрофагов (14,50±3,19%). Как видно из рисунка 33, в группе 1 сохраняется наличие сегментоядерных нейтрофилов, как и в группе 2, что свидетельствует о затянувшемся заживлении.
Однако количество макрофагов и лимфоцитов больше в группе 1. В группе 3 и группе 4 не наблюдалось наличие в грануляционной ткани СЯН, уровень макрофагов, лимфоцитов, фибробластов выше, чем группах сравнения, что свидетельствует о боле эффективном ранозаживляющем и иммунотропном эффекте.
Таким образом, результаты анализа клеточного состава грануляционной ткани позволяют предположить, что КЦГТ может оказывать стимулирующее влияние на клетки местной иммунной системы кожи - макрофаги и лимфоциты.
