Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Регуляция биотрансформации как путь повышения эффективности и безопасности фармакотерапии 10
1.2. Метаболизм диклофенака 11
1.3. Применяемы дозы витаминов группы В. 15
1.4. Влияние витаминов на цитохромы и другие ферменты метаболизма ксенобиотиков. 18
1.4.1. Коферментаная роль рибофлавина и его влияние на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков 18
1.4.2. Исследование возможных механизмов влияния рибофлавина на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков 20
1.4.3. Тиамин и его влияние на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков 21
1.5. Методы изучения активности цитохромов Р450 23
1.6. Взаимодействие НПВС и витаминов группы В 25
1.6.1. Экспериментальные данные 25
1.6.2. Клинические исследования 28
Глава 2. Материал и методы исследования 32
2.1. Фармакокинетическая часть исследования 32
2.1.1. Организация фармакокинетической части исследования 32
2.1.2. Характеристика добровольцев 33
2.1.3. Методика определения диклофенака в плазме крови 34
2.2. Методика электрохимического определения активности цитохрома Р450 ЗА4 35
2.3. Клиническая часть исследования 37
2.3.1. Характеристика пациентов 37
2.3.2. Характеристика витаминного комплекса, применяемые схемы лечения 40
2.3.3. Применяемые методы оценки эффективности проводимой терапии 41
2.4. Статистическая обработка результатов исследования 42
Глава 3. Результаты собственных исследований 44
3.1. Сравнительная оценка фармакокинетических параметров диклофенака в плазме крови при однократном и курсовом приеме без и на фоне применения нагрузочных доз витаминов. 44
3.1.1. Сравнительная оценка динамики концентрации диклофенака при пероральном приеме в дозе 100 мг в плазме крови волонтеров при однократном разовом приеме и однократном разовом приеме на фоне применения нагрузочных доз витаминов 44
3.1.2. Сравнительная оценка динамики концентрации диклофенака при пероральном приеме в дозе 100 мг на 8-ой день курсового применения препарата без и на фоне применения нагрузочных доз витаминов 54
3.2. Результаты электрохимических исследований 60
3.3. Клиническая часть исследования 67
3.3.1. Оценка динамики выраженности болевого синдрома по ВАШ 67
3.3.2. Оценка динамики выраженности болевого синдрома по опроснику боли Мак-Гилла . 69
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 73
Выводы 84
Практические рекомендации 85
Литература 87
- Метаболизм диклофенака
- Сравнительная оценка динамики концентрации диклофенака при пероральном приеме в дозе 100 мг в плазме крови волонтеров при однократном разовом приеме и однократном разовом приеме на фоне применения нагрузочных доз витаминов
- Результаты электрохимических исследований
- Оценка динамики выраженности болевого синдрома по опроснику боли Мак-Гилла
Введение к работе
Актуальность темы. Боль – наиболее частая причина обращения пациентов за медицинской помощью. По оценке большинства исследователей, распространенность боли в общей популяции составляет от 7 до 64%, а распространенность хронической боли – от 7,6 до 45%. Ведущим местом локализации боли, бесспорно, являются спина и шея, так же достаточно часто встречается головная боль и суставно-мышечные боли. Установлено, что число людей, страдающих излечимой болью, но не получающих адекватной медицинской помощи, довольно велико.
Наибольшее распространение в лечении болевого синдрома получили препараты из группы нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) (Данилов А.Б., 2008; Зборовский А.Б., 2008). Более 30 млн. людей в мире ежедневно принимают НПВС. А так же по статистике около 20% больных в стационаре получают НПВС. В то же время применение лекарственных средств из группы НПВС может сопровождаться развитием целого ряда нежелательных лекарственных реакций (НЛР). Так, более чем у 10% пациентов, получающих НПВС, отмечается изменение агрегационных свойств тромбоцитов, в 1 – 10% случаев развиваются желудочное или тонкокишечное кровотечение, язвы ЖКТ и их перфорация, у менее чем 1% больных выявляются побочные эффекты со стороны ЦНС, гепатотоксичность, сыпь, почечная недостаточность и бронхоспазм (Змушко Е.И., 2001). В США 103 тыс. госпитализаций и 16,5 тыс. летальных исходов в 2004 г. были связаны с приемом НПВС, причем было установлено, что чем выше доза НПВС, тем больше риск развития НЛР (Зырянов С.К, Нельга О.Н., 2006). Данные ряда исследований подтверждают, что даже незначительное повышение доз в рамках рекомендуемых терапевтических сопровождается заметным увеличением риска гастротоксических осложнений в случае применения традиционных НПВС (диклофенака) (Шварц Г.Я., 2005). Поэтому целесообразно проводить поиск способов применения НПВС в составе комбинированной терапии, для уменьшения дозировок НПВС, с целью снижения риска развития нежелательных реакций.
Исторически сложившаяся клиническая практика совместного назначения НПВС с комплексом витаминов группы В в последние годы получила экспериментальное обоснование. Установлено, что витамины группы B дозозависимо усиливают антиноцицептивную активность НПВС (Bartoszyk GD, Wild A.,1989; Jurna I., 1990, 1998). Проводится целый ряд как экспериментальных, так и клинических исследований по данной проблематике.
В 1990-х гг. группой исследователей во главе с Пентюком А.А. проведен ряд экспериментальных работ на животных по влиянию производных тиамина и рибофлавина на активность ферментов метаболизма ксенобиотиков и фармакологический эффект анальгетиков, что создало основу рационального использования витаминных препаратов в качестве средств целенаправленной коррекции фармакологического эффекта анальгетиков. В исследованиях, проведенных под руководством Пентюка А.А., было показано, что тиаминдифосфат обладает ингибирующим влиянием на ряд ферментов в печени, особенно гидроксилазы и деметилазы (Пентюк А. А.,1990). Этот факт приобретает особое значение в связи с тем, что в биотрансформации ряда НПВС (в том числе и диклофенака) значительное место принадлежит процессам гидроксилирования в фенольные метаболиты, которые в последующем конъюгируются с сульфатом и глюкуроновой кислотой и выводятся из организма. Таким образом, для тиаминдифосфата было показано замедление биотрансформации диклофенака, что усиливало обезболивающий эффект последнего (Пентюк А.А., Станиславчук Н.А., 1989).
Влияние на метаболизм лекарственных средств путем изменения активности ферментов метаболизма позволяет получить сравнимый клинический эффект при применении существенно более низкой дозы НПВС, что ведет к снижению числа и выраженности нежелательных реакций при использовании этой группы лекарственных средств.
В связи с чем представляется актуальным изучение возможности влияния витаминов группы В на метаболизм диклофенака путем изменения активности CYP 3A4 в эксперименте, фармакокинетические параметры диклофенака и фармакодинамические эффекты диклофенака при применении в составе комплексной терапии с витаминными комплексами.
Цель исследования.
Изучить влияние нагрузочных доз витаминов группы В на фармакокинетику и фармакодинамику диклофенака
Задачи исследования.
1. Исследовать каталитическую активность цитохрома Р450 3А4 в присутствии тиамина, рибофлавина и пиридоксина при помощи электрохимических методов.
2. Изучить субстратные свойства диклофенака по отношению к цитохрому Р450 3А4 в присутствии тиамина, рибофлавина и пиридоксина при помощи электрохимических методов.
3. Изучить влияние нагрузочных доз витаминов группы В на фармакокинетические параметры диклофенака при однократном приеме в дозе 100 мг.
4. Изучить влияние нагрузочных доз витаминов группы В на фармакокинетические параметры диклофенака при его курсовом применении.
5. Изучить равновесную концентрацию диклофенака на фоне курсового применения в сочетании с нагрузочными дозами витаминов группы В.
6. Изучить влияние нагрузочных доз витаминов группы В на анальгетический эффект диклофенака у пациентов с дорсопатиями.
Научная новизна.
Впервые при помощи электрохимических методов изучено влияние нагрузочных доз тиамина, рибофлавина и пиридоксина на активность CYP3A4. Впервые в эксперименте изучены субстратные свойства диклофенака по отношению к цитохрому Р450 3А4 в присутствии тиамина, рибофлавина и пиридоксина. Впервые проведено изучение фармакокинетических параметров диклофенака при однократном и курсовом приеме на фоне введения нагрузочных доз витаминов. Впервые изучено влияние курсового применения нагрузочных доз витаминов группы В на равновесную концентрацию диклофенака. Впервые сопоставлена субъективная оценка выраженности болевого синдрома по ВАШ с изменением фармакокинетических параметров диклофенака у пациентов под влиянием нагрузочных доз витаминов как при однократном, так и при курсовом назначении.
Практическая значимость.
В эксперименте подтверждена возможность использования нагрузочных доз тиамина, рибофлавина и пиридоксина с целью снижения каталитической активности CYP3A4.
При проведении фармакокинетических исследований по сравнительной оценке динамики концентрации диклофенака в плазме крови при однократном и курсовом приеме без и на фоне применения нагрузочных доз витаминов было показано, что при назначении нагрузочных доз витаминов группы В достигаются более высокие концентрации диклофенака в плазме крови, которые удерживаются более длительное время. Продемонстрировано, что нагрузочные дозы витаминов путем влияния на активность ферментов метаболизма могут усиливать анальгетический эффект диклофенака у пациентов при лечении дорсопатии, сопровождающейся болевым и мышечно-тоническим синдромом.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Витамины группы В могут изменять каталитическую активность цитохрома Р450 3А4 в эксперименте.
2. Применение нагрузочных доз витаминов группы В изменяет фармакокинетические параметры диклофенака при однократном разовом приеме и курсовом применении.
3. Курсовое назначение диклофенака в комбинации с нагрузочными дозами витаминов группы В приводит к повышению равновесной концентрации диклофенака.
4. Курсовое назначение диклофенака в комбинации с нагрузочными дозами витаминов группы В приводит к повышению анальгетического эффекта у пациентов с дорсопатиями.
Внедрение: Полученные результаты используются в терапевтических отделениях ГКБ №23 им. Медсантруд, материалы диссертации используются в учебном процессе на кафедре клинической фармакологии и пропедевтики внтуренних болезней ГОУ ВПО Первом МГМУ им. И.М.Сеченова.
Апробация диссертации.
Основные положения диссертации доложены:
На VI научно-практической конференции «Биомедицина и биомоделирование» (Светлые горы, 8-9 июня 2010 г.)
На заседании кафедры клинической фармакологии и пропедевтики внутренних болезней Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва, 21 июня 2010 г.).
Публикации: По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 в центральной медицинской печати (журналах, рекомендованных ВАК России), 1 в тезисах конференций и 2 в материалах научно-практических конференций.
Объем и структура: Диссертация изложена на 107 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 19 таблицами, 21 рисунками. Список литературы содержит 113 отечественных источников и 116 иностранных источников.
Метаболизм диклофенака
Диклофенак является типичным представителем НПВС и препаратом выбора для лечения артритов, анкилозирующих спондилитов и острой мышечной боли [197]. Препарат является неселективным ингибитором циклооксигеназы (ЦОГ), поэтому его противовоспалительная активность связана с ингибированием изоформы ЦОГ-2, тогда как побочные эффекты (раздражение слизистой ЖКТ, язвы и кровотечение) связаны с ингибированием ЦОГ-1, которая функционирует как гастропротектор, регулирует кровоток в почках и поддерживает агрегацию тромбоцитов [215, 142,130].
Метаболизм диклофенака у человека складывается из двух последовательных событий: глюкуронизации кислотного участка и гидроксилирования ароматического кольца. Глюкуронизация диклофенака активно изучается, поскольку глюкуронид диклофенака может вызывать идиосинкразию в виде гепатотоксичности [207-209].
Как показали исследования, проведенные King, С. et al., глюкуронизация диклофенака осуществляется при помощи изоформ фермента уридин 5 дифосфоглюкуронизилтрансферазы 1А9 и 2В7 [129, 155]. Принято считать, что именно изоформа 2В7 катализирует образование диклофенака глюкуронида в печени человека, а также этот путь, возможно, является главным путем выведения препарата из организма Диклофенак также подвергается реакциям гидроксилирования, что приводит к образованию 4 -гидрокси и 5-гидрокси дериватов препарата. На основании исследований, проведенных с помощью селективных химических ингибиторов, моноклональных антител и рекомбинантных ферментов было показано, что эти реакции катализируются при помощи CYP2C9 и ЗА4 [161,195,208-209].
Анализ образцов, полученных от добровольцев, пролеченных диклофенаком, меченым 4С внутривенно, показал, что приблизительно 60% дозы экскретировалось в мочу, при этом большая часть радиоактивных компонентов была представлена глюкуроновой кислотой конъюгированной с 4 -гидроксидиклофенаком [190, 204]. Эти исследования, а также общепризнанное мнение, что глюкуронизация происходит после реакций окисления, привели к гипотезе, что клиренс диклофенака у человека осуществляется путем 4 -гидроксилирования, которое катализируется CYP2C9 в печени. Ряд исследований in vitro с рекомбинантными ферментами CYP показали, что диклофенак глюкуронид может подвергаться дальнейшему 4 -гидроксилированию, которое катализируется GYP2C8. В связи с этим, существует альтернативный путь выведения препарата из организма человека, при котором основной этап элиминации диклофенака осуществляется путем глюкуронизации и дальнейшего 4 -гидроксилирования глюкуронида. Оба пути приводят к образованию простого неразличимого конечного продукта, называемого 4 -гидроксидиклофенак глюкуронид, экскрецируемого в мочу [192]. Гипотеза, описанная выше, была предложена на основании экспериментов in vitro, в которых субстрат подвергался только окислительному метаболизму, тогда как множественные пути метаболизма могут существовать in vivo для элиминации диклофенака глюкуронида из печени, включая активный выход, при помощи транспортеров, локализованных либо на апикальной, либо на базолатеральной мембране гепатоцита. Например, модель энтерогепатической циркуляции была установлена на преклинических образцах распределения препарата, которая состоит из гепатобилиарной экскреции диклофенака глюкуронида из печени, за которой следует гидролиз, катализируемый р-глюкуронидазой в кишечнике, и дальнейшей реабсорбцией получающегося в результате агликона в системный кровоток [134, 135]. Белок множественной резистентности 2 (Мгр2) участвует в экскреции ацила глюкуронида. Выход, опосредованный активными транспортерами, может быть быстрым, приводя в очень низкой концентрации диклофенака глюкуронида в гепатоцитах [192]. Гипотеза, при которой in vitro окисление диклофенака глюкуронида коррелирует с in vivo клиренсом препарата в кишечнике очень интересна, поскольку в случае правильности утверждения, это может иметь прямые последствия на изменение современных концепций о последовательности событий, ассоциированных с реакциями первой и второй фаз метаболизма препарата. [209]. Диклофенак является идеальным субстратом для CYP2C9, поскольку в своей химической формуле имеет карбоксильную кислотную группу, и катализ осуществляется по пути региоселективности [152, 189]. Однако 4 -региоселективное гидроксилирование диклофенака катализируется не только CYP2C9, но и CYP2C8, а также 2С19, приводя к образованию 5-гидроксиметаболита [169].
CYP3A4 является наиболее широко распространенным цитохромом в печени человека и участвует в метаболизме широко круга препаратов, включая НПВС (в том числе диклофенака), антибиотики и противоэпилептические средства [143]. В ряде исследований было показано, что 5-гидроксилирование диклофенака с участием CYP3A4 ускоряется в присутствии хинидина, препарата выбора для лечения аритмий [181, 208]. Например, Tang W. [209] приводит подтверждающие результаты исследования на лимфобластах человека, экспрессирующих рекомбинантный CYP3 А4. Терапевтическое применение дшслофенака характеризуется редкой, но потенциально опасной гепатотоксичностью, встречающейся с частотой от 1-5 на 100000 пациентов [119]. Было показано, что ацил глюкуронид дшслофенака способен ковалентно связываться и модифицировать клеточные белки печени у крыс, в зависимости от активности Mrh-2, канальцевого транспортера печени, что приводит к гепатотоксичности [158,194].
Таким образом, фармакокинетика диклофенака натрия подробно изучена. Выявлено, что диклофенак натрия хорошо всасывается из желудочно-кишечного тракта и около 60% дозы достигает системного кровотока в неизмененном виде после эффекта первого прохождения [190]. Пища несколько замедляет всасываение препарата, не изменяя площадь по фармакокинетической кривой [144]. Диклофенак не обладает самоиндукцией, то есть повторные приемы не изменяют фармакокинетических параметров препарата, полученных при первом исследовании. Для диклофенака натрия характерна тесная связь с белками плазмы, более чем на 90%. Выведение препарата из организма происходит, в основном, в виде метаболитов. В неизменном виде выводится менее 1% от введенной дозы [204]. Основными метаболитами диклофенака натрия являются его гидроксипроизводные, главный из них 4-гидроксидиклофенак. По фармакологической активности метаболиты в 30 - 100 раз менее активны, чем неизменная форма препарата. За сутки из организма выводится более 70% препарата. Период полувыведения, по данным разных авторов, составляет 1,2—1,8 часа [176,135].
Суммируя сведения о фармакокинетике диклофенака можно заключить, что препарат относится к быстрометаболизирующимся лекарственным средствам, в процессе биотрансформации превращается в неактивные гидроксильные метаболиты, которые выводятся почками и желудочно-кишечным трактом [30, 48].
Поскольку метаболиты дшслофенака практически лишены фармакологической активности, а лечебный эффект обусловлен лишь неизменной формой препарата, то любое изменение скорости его биотрансформации (ускорение, либо замедление) может менять терапевтическую активность диклофенака. Биотрансформация, таким образом, является тем звеном фармакокинетики, воздействуя на которое, можно влиять на эффективность проводимой терапии.
Сравнительная оценка динамики концентрации диклофенака при пероральном приеме в дозе 100 мг в плазме крови волонтеров при однократном разовом приеме и однократном разовом приеме на фоне применения нагрузочных доз витаминов
В исходной точке (Рис.3) концентрация диклофенака перед приемом его волонтерами, составила 0 нг/мл. В течение первого получаса произошло статистически значимое повышение содержания уровня диклофенака в плазме крови волонтеров (р 0,001). В точке 1 час отмечается максимальное значение концентрации диклофенака в плазме крови - 1137,2±82,4 нг/мл. Далее в точке 1,5 часа после приема препарата мы видим снижение уровня диклофенака в плазме крови до 509,8±43,7 нг/мл.
На протяжении дальнейшего периода исследования отмечается постепенное снижение величины концентрации диклофенака в сыворотке крови до уровня 17,4±4,1нг/мл через 12 часов.
На фоне 7-дневного курсового приема 2 таблеток «Гитагампа» (Рис.4) при однократном разовом приеме 100 мг диклофенака в течение первого получаса произошло статистически значимое повышение содержания уровня диклофенака в крови волонтеров с 0 нг/мл в исходной точке до концентрации 689,4±18,9 нг/мл (р 0,001). В точке 1 час отмечается максимальное значение содержания диклофенака -1326,7± 122,5 нг/мл. Далее в точке 1,5 часа после приема препарата мы видим снижение уровня диклофенака в плазме крови по сравнению с максимальной концентрацией до уровня 623,2±32,4 нг/мл.
На протяжении дальнейшего периода исследования отмечается постепенное снижение величины концентрации диклофенака в плазме крови до уровня 32,5±3,5 нг/мл через 12 часов.
На фоне 7-дневного курсового приема 4 таблеток «Гитагампа» (Рис.5) при однократном разовом приеме 100 мг диклофенака в течение первого получаса также произошло статистически значимое повышение содержания уровня диклофенака в плазме крови волонтеров с 0 нг/мл в исходной точке до концентрации 832,5±20,1 нг/мл (р 0,001). В точке 1 час отмечается максимальное значение концентрации диклофенака в плазме крови - 2200,4±111,3 нг/мл. Субмаксимальная концентрация отмечена в точке 1,5 часа после приема препарата и составляет 1023,3±84,9 нг/мл.
Через 1,5 часа после приема препарата мы видим статистически достоверное снижение уровня диклофенака в плазме крови по сравнению с максимальной концентрацией (р 0,001). На протяжении дальнейшего периода исследования отмечается постепенное снижение величины концентрации диклофенака в сыворотке крови до уровня 89,6±7,8 нг/мл через 12 часов.
В результате статистического анализа видно, что величина значения концентрации диклофенака через 30 мин. при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения концентрации в этой же точке при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» (t=6,86; р 0,001). В свою очередь величина значения концентрации через 30 мин при приеме диклофенака на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения концентрации через 30 мин при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (t=14,21;p 0,001).
Величина значения максимальной концентрации диклофенака при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения максимальной концентрации при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» (t=4,07; р 0,001). В свою очередь величина значения С max при приеме диклофенака на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения максимальной концентрации при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (t=14,46; р 0,001).
Величина значения субмаксимальной концентрации диклофенака достигается через 1,5 часа и при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения субмаксимальной концентрации при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» (t=6,9; р 0,001). В свою очередь величина значения субмаксимальной концентрации при приеме диклофенака на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения субмаксимальной концентрации при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (t=13,2; р 0,001).
Далее в точке 2 часа мы видим, что величина значения концентрации диклофенака при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения концентрации при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» (t=4,99; р 0,001). В свою очередь величина значения концентрации при приеме диклофенака в точке 2 часа на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения концентрации при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (t=13,2;p 0,001).
В точках 3 часа, 4 часа, 6 часов наблюдается аналогичная картина, величина значения концентрации диклофенака при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения концентрации при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» во всех точках фармакокинетической кривой (t=7,l;t=2,65;t=6,5 соответственно, р 0,001). В свою очередь величина значения концентрации при приеме диклофенака в точках 3 часа, 4 часа и 6 часов на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения концентрации в этих точках при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (t=31,5; t=5,9; t=35,7 соответственно, р 0,001).
В точках 8 и 12 часов величина значения концентрации диклофенака при однократном разовом приеме статистически достоверно ниже величины значения концентрации при приеме диклофенака на фоне курсового применения 2 таблеток «Гитагампа» (t=7,35;t=9,l соответственно, р 0,001). В свою очередь величина значения концентрации при приеме диклофенака в точках 8 и 12 часов на фоне применения 2 таблеток «Гитагампа» статистически достоверно меньше величины значения концентрации при приеме диклофенака на фоне 4 таблеток «Гитагампа» (1=16,1;1=19,6соответственно; р 0,001).
Таким образом, во всех точках фармакокинетической кривой при однократном приеме диклофенака в дозе 100 мг как на фоне применения 2, так и на фоне применения 4 таблеток «Гитагампа» достигаются статистически достоверно более высокие значения концентрации препарата в крови, которые удерживаются более длительное время.
Результаты электрохимических исследований
Наночастицы золота, стабилизированные синтетическим мембраноподобным веществом бромидом дидодецилдиметиламмония (DDAB), обеспечивают эффективный электронный транспорт между графитовым электродом и гемом цитохромов Р450. Мембрана синтетического липида с коллоидным золотом DDAB/Au содержит достаточное количество воды для поддержания структуры гемопротеинов и обеспечивает фиксацию ферментов на графитовом печатном электроде. При модификации поверхности печатных графитовых электродов 0,1 М DDAB/Au в хлороформе с последующим включением в мембраноподобную матрицу цитохрома Р450 ЗА4 наблюдается прямой безмедиаторный перенос электронов между электродом и гемом. DDAB/Au/P450 ЗА4 электроды электроактивны при нанесении пикомолярных количеств фермента на электрод (рис. 12). По данным цикловольтамперометрии электроактивны 10-15 % молекул цитохрома Р450 ЗА4, что составляет 16-20 пмол/электрод.
Для исследования электроаналитических характеристик использовали вольтамперные отклики электродов, регистрируемые с помощью цикловольтамперометрии и вольтаметрического анализа (квадратно-волновой КВВА и дифференциальной импульсной вольтамперометрии ДИВА). В таблице №9 приведены значения вольтамперных откликов электродов до и после добавления диклофенака.
На рисунке 13 представлены квадратно-волновые вольтамперограмы DDAB/Au/P450 ЗА4 электрода до, и после прибавления диклофенака (100 мкМ). Каталитический ток, регистрируемый в присутствии этого лекарственного препарата, свидетельствует о протекании электрокаталитической реакции: диклофенак (ДК) проявляет субстратные свойства по отношению к цитохрому Р450 ЗА4. Максимальные амплитуды токов КВВА, скорректированные по базовой линии, для ферментативных электродов без субстрата и в присутствии субстрата диклофенака приведены на рисунке 13.
Необходимо отметить, что субстратные свойства проявляли как фармакологические препараты диклофенак в таблетках (100 мг/таблетка), так и субстанция диклофенака (рис. 14). Электрохимическая константа Михаэлиса, рассчитанная по данным КВВА, составила 40±10 мкМ.
Вольтамперограмм в аэробных условиях электродов: DDAB/Au/P450 ЗА4 (1), DDAB/Au/P450 ЗА4+ ДК, таблетка (2), DDAB/Au/P450 ЗА4+ ДК, субстанция (3). Значения амплитуд токов КВВА были скорректированы по базовой линии.
Было исследовано влияние тиамина (водорастворимого витамина В1) на активность цитохрома Р450 ЗА4. В таблицах №10 и №11 приведены значения вольтамперных откликов электродов до, в присутствии тиамина и при добавлении к тиамину диклофенака (таблетки и субстанция).
Таким образом, было показано, что тиамин (ТМ) не является субстратом этой формы цитохрома Р450щ0, но блокирует (в концентрации 1,5 мМ) каталитические свойства цитохрома Р450 ЗА4 по отношению к диклофенаку (рис. 15).
Т.е. тиамин неконкурентно блокировал цитохром Р450 ЗА4 по отношению к диклофенаку и замедлял метаболизм препарата.
Также было проведено сравнительное исследование влияния витаминов группы В (Вь В2 и В6) в концентрации 300 мкМ на электрохимическую реакцию диклофенака с цитохромом Р450 ЗА4 (Рис. 16, таблица 12).
Было исследовано влияние рибофлавина (витамина В2) в реакции гидроксилирования диклофенака цитохромом Р450 ЗА4. В концентрации 300 мкМ рибофлавин (Rf), по данным КВВА, ингибирует каталитическую активность цитохрома Р450 ЗА4 по отношению к диклофенаку (рис.16, опыты 4-6).
В опытах с диклофенаком в качестве субстрата и пиридоксином (витамин В6) методом электрохимического анализа (КВВА) было выявлено, что регистрируется увеличение каталитического тока в присутствии пиридоксина (PR), но отсутствие каталитической реакции с диклофенаком (рис. 16, опыты 7-9).
При сравнении витаминов группы В (Ві, В2, В6) в одинаковой концентрации (300 мкМ) по данным КВВА, рибофлавин наиболее эффективно подавляет взаимодействие диклофенака с цитохромом Р450 ЗА4.
Оценка динамики выраженности болевого синдрома по опроснику боли Мак-Гилла
При анализе динамики рангового индекса боли (опросник боли Мак-Гилла) отмечено существенное его снижение на третий день терапии. Регрессия рангового индекса боли у пациентов основной группы составила - 42,9Д%, у пациентов контрольной группы -23,8 Д%. В период времени с третьего по седьмой день терапии, также отмечено значительное уменьшение рангового индекса боли в основной группе на -81,8 А%, в контрольной группе на - 57,0 Д%.
В период времени с седьмого по десятый день терапии также отмечено уменьшение рангового индекса боли в основной группе на -96,4Д%, а в контрольной группе на -78,5Д% (таблица 14, рис. 18). С 10 по 14 день терапии по основной группе регресс боли составил -99,5 Д%, по контрольной -90,0 Д%
Таким образом, на всем протяжении исследования отмечается статистически значимое более интенсивное купирование болевого синдрома у пациентов основной группы по сравнению с контрольной группой ( р 0,05).
При анализе индекса боли (ИБ) (по опроснику боли Мак-Гилла) отмечено, что наиболее значимое его уменьшение у пациентов основной группы произошло в период времени прошедший с первого по третий день терапии. Уменьшение ИБ в основной группе за этот период времени произошло в 2,7 раза, в контрольной группе пациентов отмечено снижение ИБ только в 1,08 раза. Уменьшение ИБ, однако, несколько менее выраженное, наблюдалось в дальнейшем и на 7 день терапии. При анализе индекса боли (ИБ) у пациентов контрольной группы отмечено, что наиболее значимое его уменьшение произошло в период времени, прошедший с третьего по седьмой день терапии. На 10-й и 14-й день терапии ИБ у пациентов основной группы был равен нулю (см. таблицу 15, рис.19). У пациентов контрольной группы ИБ на 10 день терапии стал равен 0,5, а к 14 дню приблизился к нулю.
Таким образом, мы видим статистически значимую разницу между динамикой купирования болевого синдрома между основной и контрольной группами уже на 3-й день терапии, т.е. пациенты получавшие наряду с диклофенаком нагрузочные дозы витаминов, демоне ірировали меньшие баллы по ИБ (t=4,2 р 0,001). Такая тенденция сохранялась в течение всего периода лечения. На седьмой день терапии ИБ у пациентов основной группы составил 0,2, у пациентов контрольной группы 1,1 (t=26,8 р 0,001).
На 10 и 14 дни терапии ИБ у пациентов основной группы стал равен О, тогда как у пациентов контрольной группы только на 14 день терапии приблизился к нулю (р 0,001).
Лечение болевых синдромов - одна из актуальных проблем современной медицины. По оценке большинства исследователей, распространенность боли в общей популяции составляет от 7 до 64%, а распространенность хронической боли - от 7,6 до 45%. Ведущим местом локализации боли, бесспорно, являются спина и шея, так же достаточно часто встречается головная боль и суставно-мышечные боли. Установлено, что число людей, страдающих излечимой болью, но не получающих адекватной медицинской помощи, довольно велико, в том числе среди них лица трудоспособного возраста [29]. Наибольшее распространение в лечении болевого синдрома получили препараты из группы НПВС. В то же время применение лекарственных средств из группы НПВС может сопровождаться развитием целого ряда НЛР, в том числе жизнеугрожающих, причем было установлено, что чем выше доза НПВС, тем больше риск развития НЛР [33]. Диклофенак относится к типичным представителям НПВС и препаратом выбора для лечения артритов, анкилозирующих спондилитов и острой мышечной боли [197].
С целью снижения дозы НПВС исторически назначался комплекс витаминов группы В. Было проведено более 90 исследований, показавших клиническое улучшение при применении витаминов группы В у пациентов с острыми болями в спине, что помогло сократить сроки лечения и уменьшить дозировки диклофенака, снизив, таким образом, риск побочных явлений [29, 126, 127, 159, 191, 216]. При этом механизм взаимодействия НПВС и витаминов группы В оставался не известен. По результатам некоторых экспериментов выдвигались предположения, что антиноцицептивный эффект комбинации витаминов группы В может быть обусловлен ингибированием синтеза и/или блокированием действия воспалительных медиаторов [29], а также тем, что комплекс витаминов группы В усиливает действие норадреналина и серотонина, главных антиноцицептивных нейромедиаторов. В исследованиях, проведенных под руководством Пентюка А.А., было показано, что тиаминдифосфат обладает ингибирующим влиянием на ряд ферментов в печени, особенно гидроксилазы и деметилазы. Этот факт приобретает особое значение в связи с тем, что в биотрансформации ряда НПВС (в том числе и диклофенака) значительное место принадлежит процессам гидроксилирования в фенольные метаболиты, которые в последующем конъюгируются с сульфатом и глюкуроновой кислотой и выводятся из организма.
Таким образом, для тиаминдифосфата было показано замедление биотрансформации диклофенака, что усиливало его обезболивающий эффект [68-71]. Это позволяет предположить, что именно влияние на метаболизм лекарственных средств путем изменения активности ферментов метаболизма, позволяет получить сравнимый клинический эффект при применении существенно более низкой дозы НПВС, что ведет к снижению числа и выраженности нежелательных реакций при использовании этой группы лекарственных средств [16].
Метаболизм диклофенака складывается из глюкуронизации кислотного участка и гидроксилирования ароматического кольца. Глюкуронизация диклофенака осуществляется при помощи изоформ фермента уридин 5 -дифосфоглюкуронизилтрансферазы 1А9 и 2В7, а также изоформой 2В7.
Гидроксилирование осуществляется при помощи CYP2C9 и ЗА4, а такжеСУР2С8и 2С19.
Таким образом, основными ферментами метаболизма диклофенака является семейство цитохромов CYP450, в частности изоформа ЗА4.
Для того, чтобы доказать влияние витаминов группы В на биотрансформацию диклофенака путем изменения активности ферментов метаболизма препарата, были проведены экспериментальные электрохимические исследования.
