Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. НАД-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ) формиат: НАД+ оксидоредуктаза КФ 1.2.1.2.) метилотрофных бактерий 'seudomonas sp.101 катализирует последнюю стадию метаболизма мета-юла - окисление формиата до С0? при сопряженном восстановлении икотинашідадениндинуклео'тида (НАД) в НАДН. Сходные по физико-имическим свойствам формиатдегидрогеназы обнаружены в высших рас ениях, дрожжах и микроорганизмах. Изучение механизма действия и ітруктурнях. принципов организации данного фермента необходимо для [онимания метаболизма формиата в живых организмах. ФДГ принадлежит : обширному классу НАД(Ф)-зависимых ферментов, которые при всем ногообразии катализируемых ими реакций имеют ряд консервативных івойств, определяемых природой используемого кофермента. Эта осо-Іенность, сочетающаяся с древностью использования живыми организма- . и молекулы НАД в окислительно-восстановительных реакциях, выделяет [АД (Ф)-зависимые ферменты как уникальный объект для изучения происхождения и эволюционирования ферментов, использующих сложные кофакторы. Проведенные к настоящему времени физико-химические исолг-(ования ФДГ показали, что данный фермент является очень удобным и итересным объектом и для изучения собственно НАД-зависимого дегид-отрования. В отличие от хорошо изученных к настоящему времени де~ идрогеназ, ФДГ имеет очень простой субстрат. Отсутствие в катали-іируемой реакции стадии переноса протона с субстрата на фермент, юпрякенной с процессом дегидрирования, позволит оущественно пасши-ить представления о движущих силах реакции, в особенности, при (иссоциации комплекса фермент-ІІАДН-продукт.
Перечисленные выше задачи невозможно решить без детального знамя пространственной структуры исследуемого фермента. Рентгеновская :ристаллография в настоящее время является единственным методом, іающим такую информацию. Более того, в случае НАД-зависимых дегид-хэгеназ, у которых ферментативный процесс сопровождается существенней структурными перестройками активного центра, рентгено-ітруктурний анализ является также и ключевым методом изучения моха-іизма действия.
Проведенные к настоящему времени работы по выделению и секвени-юванию гена ФДГ открывают широкие возможности для комплексного
изучения данного фермента генетическими, биохимическими и криктал- лографическими методами.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Целью настоящей рсмоты явилось иаучини^ ынгодом полиизоморфных производнц* пространственной структури тройного комплекса ФДГ (фермаят-НАД-авид) о разрешением 3.0 1, получении данных об организации активного центра и проведение сравнительного анализа структуры новой НАД-зависимоЯ дегидрогеназц с другими известными ферментами этого класса
НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Определена на атомном уровне пространственная структура ФДГ. Проведен анализ вторичной структури фермента. Используя информацию О месте расположения молекули НАД в белке, охарактеризован активный центр. Прове я сравнительный аннг'ч ФДГ с другими структурно изученными дегидрогеназами, выявлен^ общие закономерности и отличия в пространственной организации этих ферментов и в их взаимодействии с молекулой НАД.
ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ. Построенная моделі. о'мка иопволя ет сразу же после сбора данных високого разрешения пронести кристаллографическое уточнение модели, расшифровать имеющиеся кристаллы апсформы. фермента и двойного комплекса ФДТ-НАД методом молекулярного замещения, что явится основой в определении механизма действия фермента. Знание организации активного.центра зволяет уя->" сейчас начать работы по модификации интересуемых остатков методом направленного мутагенеза.- Появилась возможность модифицировать ряд свойств фермента о целью расширения путей его .ютехнологического применения.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Резу таты работы докладывались на V Ьеесоюз ном симпозиуме "Структура оиологических макромолекул" (Звенигород, 1987),-Y Всесоюзной научной, конференции "Проблемы и перспективы ферментативного катализа" (Москва,1987), Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущине,1988), 12 Европейской кристаллографически, кс.іфереииии (Москва, 1989) и ряде других.
ПУКії.ЖАІШ. Мат^риалн диссертации опубликовали в отчетах, нескольких конференцяП п Асъгыа, список которых принеден ъ кенц» автореферата.
OF'3.1 РАБОТ:*. Діїоі'-г'ібция еоо-д-ит ;«: Ні^д-'ч ,'ї-.. четырех гл'іУ, закгл'Чі?гк--. 'л ruhoic-fc. л::> нсууєіг-. :''- '-'.' "', и-; считай списка литературы">, со:--?:*!'! ?"> рисунков w Iі .-о-:г:і.
