Введение к работе
Актуальность работы. Создание новых высокочувствительных методов анализа белков имеет огромное значение для современной медицины и биологии, поскольку диагностика многих патологических состояний основана на детектировании маркерных белков в сложных биологических жидкостях. Развитие биотехнологии также требует разработки быстрых и чувствительных методов анализа белковых молекул, ответственных за протекание биотехнологических процессов (рекомбинантная технология, тканевая инженерия).
Макропористые носители на основе синтетических полимеров на протяжении последних десятилетий успешно используются в проведении широкого ряда динамических сепарационных и биоконверсионных процессов. Применение носителей данного типа для создания биораспознающих систем в формате биочипов, предназначенных для комплексного аналитического скрининга сложных биологических объектов, позволяет повысить чувствительность и сократить время выполнения анализа. При этом эффективность анализа существенно зависит от свойств используемой твердой матрицы. Так, присутствие на поверхности носителя тех или иных функциональных групп определяет способ иммобилизации адсорбционно-активного лиганда, а реакционная способность и количество этих групп – биоспецифическую адсорбционную емкость твердой фазы. Морфологические особенности используемой матрицы также играют важную роль в обеспечении высокой адсорбционной емкости и возможности создания для молекулы белка условий, максимально близких к ее существованию в растворе. Таким образом, развитие биологических микрочипов тесно связано с внедрением новых типов носителей, обладающих улучшенными физическими и химическими характеристиками, которые позволили бы повысить их биоаналитическую эффективность.
Сополимер глицидилметакрилата (ГМА) и этиленгликольдиметакрилата (ЭДМА) является наиболее известным и широко используемым представителем макропористых сорбентов. Наличие в химической структуре сополимера эпоксидных групп позволяет проводить одностадийное ковалентное связывание молекул белка с поверхностью данного сорбента. Тем не менее, существенным недостатком ГМА-ЭДМА сорбентов является длительность процесса иммобилизации белка с участием оксирановых циклов, а также недостаточно высокая аффинная емкость носителя. В связи с этим, создание общего алгоритма конструирования трехмерных платформ для биочипов различного назначения и разработка носителей монолитного типа на основе сополимеров, содержащих функциональные группы, обеспечивающие быстрое связывание лиганда с поверхностью, представляется актуальной задачей.
Цель исследования. Целью настоящей работы являлась разработка принципов создания полимерных микроаналитических платформ, включающих полимерные слои монолитного типа, содержащие реакционно-способные функциональные группы и обладающие поровыми характеристиками, удовлетворяющими условиям проведения анализа в статических условиях, а именно, обеспечивающими свободное и достаточно быстрое проникновение макромолекул белка (или более крупных объектов, например, вирусов) внутрь порового пространства, а также высокую адсорбционную емкость носителя.
В связи с этим, были поставлены и решались следующие задачи:
поиск мономеров, содержащих функциональные группы, способные к быстрому взаимодействию с аминогруппой молекулы белка;
оценка способности выбранных мономеров к сополимеризации с дивинильным соединением с образованием монолитного макропористого материала и анализ полученных жестко сшитых сополимеров;
оптимизация условий синтеза сополимеров для получения материала с заданным размером пор;
исследование на примере модельного белка закономерностей иммобилизации лигандов на поверхности полученных носителей;
оптимизация технологии изготовления микроаналитических устройств на основе стеклянной поддерживающей среды и синтезированных полимерных слоев;
выбор оптимальных условий проведения микроанализа с использованием модельной аффинной пары белков;
оценка эффективности разработанных микроаналитических устройств на примере решения реальных биомедицинских и биотехнологических задач.
Объектами представленного исследования являлись синтетические сополимеры на основе метакрилатных и акрилатных мономеров, несущие на своей поверхности функциональные группы, способные взаимодействовать с аминогруппой молекулы белка.
При выполнении работы были использованы следующие методы исследования:
свободно-радикальная фотоинициируемая полимеризация для синтеза сополимеров;
элементный анализ и ИК-спектроскопия для характеристики полученных сополимеров;
интрузионная ртутная порометрия для определения среднего размера пор полимерных носителей и распределения их по размерам;
сканирующая электронная микроскопия для качественной оценки поровой структуры полученных материалов;
тонкослойная хроматография (ТСХ), обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ОФ ВЭЖХ), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), масс-спектрометрия и спектроскопии в видимой области поглощения для исследования закономерностей иммобилизации модельного белка на поверхности полученных полимерных носителей;
люминесцентная микроскопия для осуществления микроанализа на поверхности разработанных полимерно-неорганических платформ с целью оценки эффективности их практического использования.
Научная новизна работы. Впервые осуществлен синтез двух макропористых материалов на основе сополимеров N–гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата. Разработан принцип конструирования полимер-содержащих платформ, составляющих функциональную основу биочипа, включающий изготовление на поверхности стекла операционных ячеек, силанизацию полученных ячеек и осуществление фотоинициируемой полимеризации непосредственно в изготовленных ячейках. Впервые показана возможность высокочувствительного детектирования белка в формате биочипов с использованием макропористых монолитных полимерных носителей.
Практическая значимость работы. Разработаны методы синтеза макропористых полимерных материалов монолитного типа, обладающих функциональными группами и воспроизводимой поровой структурой, пригодной для использования в конструкции биочипа, предназначенного для биологического микроанализа. Разработаны и апробированы методы определения пикомолярных количеств маркерного белка остеопонтина в клеточном супернатанте при тканево-инженерном производстве костной ткани, а также антител против антигена T. Pallidum в сыворотке крови человека.
Основные положения, выносимые на защиту:
Синтезированные материалы на основе сшитых жесткоцепных сополимеров N-гидроксифталимидного эфира акриловой кислоты, глицидилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата и 2-цианоэтилметакрилата и этиленгликольдиметакрилата содержат функциональные группы, позволяющие осуществлять быструю модификацию их поверхности белком;
Поровая структура полученных материалов удовлетворяет требованиям проведения биоанализа в статических условиях, а именно, обеспечивает проникновение молекул белка внутрь порового пространства и высокую адсорбционную носителя;
Макропористые носители на основе синтезированных полимеров являются перспективными материалами для осуществления анализа белка в микроформате.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены в виде устных и стендовых сообщений на следующих российских и международных конференциях и симпозиумах: Санкт-Петербургская конференция молодых ученых “Современные проблемы науки о полимерах” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2007, 2008); International Symposium “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems” (Санкт-Петербург, Россия, 2005, 2008); Monolith Summer School (Порторож, Словения, 2006, 2008); International Congress on Analytical Sciences (ICAS-2006). (Москва, Россия, 2006); The Young Scientists’ and Students’ International Scientific Conference “Modern Problems of Microbiology and Biotechnology” (Одесса, Украина, 2007); European Congress and Exhibition on Advanced Materials and Processes (Euromat 2007) (Нюрнберг, Германия, 2007); Baltic Polymer Symposium 2007 (Друскининкай, Литва) и 2008 (Отепа, Эстония). Результаты работы также обсуждались на научно-практическом семинаре в Институте технической химии Университета Ганновера (Ганновер, Германия, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемнадцать печатных работ, включая две статьи в Журнале прикладной химии и Journal of Applied Polymer Science, две статьи в трудах международных конференций «3rd International and 28th European Peptide Symposium» и «Измерительные и информационные технологии в охране здоровья. Метромед 2007», а также 14 тезисов устных и стендовых докладов.
Вклад автора состоял в осуществлении всех представленных в работе экспериментов, активном участии в интерпретации полученных результатов, подготовке публикаций и докладов.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, Экспериментальной части, Обсуждения результатов, Выводов и Списка использованной литературы. Материалы диссертации изложены на 148 страницах, проиллюстрированы 12 таблицами и 49 рисунками, список цитируемой литературы включает 135 источников.
Данная работа выполнялась в соответствии с планом НИР ИВС РАН по теме «Создание материалов биомедицинского назначения на основе синтетических и природных полимеров», а также в рамках научной кооперации между Институтом высокомолекулярных соединений РАН и Институтом технической химии Университета Ганновера (Германия) (грант DFG KA 1784/4-1 и стипендия Немецкого Академического Общества по международному обмену DAAD 325 А/06/70831), при участии Военно- медицинской академии им. С. М. Кирова и технической поддержке фирмы BIA Separations GmbH (Любляна, Словения).
