Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
2. Обзор литературы 9
2.1. Роль белков и низкомолекулярных ПАВ в образовании и стабилизации коллоидных систем 9
2.1.1 Особенности адсорбции белков, имеющих неупорядоченную структуру, на границе раздела фаз 9
2.1.2 Особенности адсорбции глобулярных белков на границе раздела фаз 10
2.1.3 Особенности формирования адсорбционных слоев из смесей белков с низкомолекулярными ПАВ 12
2.2. Характерные черты взаимодействия ПАВ с белками и структурные модели образующихся между ними комплексов. 17
2.3. Влияние низкомолекулярных ПАВ на структурообразующие свойства белков 31
3. Цель работы и объекты исследования 43
4. Экспериментальная часть 46
4.1. Материалы 46
4.1.1 Белки 46
4.1.2 Низкомолекулярные поверхностно-активные вещества 47
4.2. Методы 51
4.2.1 Приготовление растворов белков 51
4.2.2 Приготовление растворов ПАВ и их смешанных растворов с белком 51
4.2.3 Метод калориметрии смешения 52
4.2.4 Метод дифференциальной сканирующей калориметрии 53
4.2.5 Метод статического светорассеяния 53
4.2.6 Метод дифференциальной рефрактометрии 56
4.2.7 Метод динамического светорассеяния 58
4.2.8 Метод тензиометрии 60
4.2.9 Оценка пенообразующей способности белка 60
4.2.10 Метод оценки скорости дренажа водной среды из пены 61
4.2.11 Проведение реологических измерений 61
5. Результаты и их обсуждение 62
5.1. Термодинамическая характеристика состояния ПАВ в водной среде в зависимости от их концентрации, значения рН и температуры 62
5.1.1 Термодинамика мицеллообразования ПАВ 62
5.1.2 Термодинамическая характеристика относительной гидрофобности/гидрофильности поверхности образующихся мицелл ПАВ 67
5.2. Термодинамическая характеристика взаимодействий белков с ПАВ в водной среде по данным калориметрических измерений 70
5.2.1 Казеинат натрия + индивидуальные молекулы ПАВ 70
5.2.2 Казеинат натрия + ПАВ в мицеллярном состоянии 76
5.2.3 Нативный 1 IS глобулин + индивидуальные молекулы ПАВ 84
5.2.4 Нативный 1 IS глобулин + ПАВ в мицеллярном состоянии 93
5.2.5 Термоденатурированный 1 IS глобулин + индивидуальные молекулы ПАВ 100
5.2.6 Термоденатурированный 11S глобулин + ПАВ в мицеллярном состоянии 105
5.3. Образование мицеллоподобных кластеров ПАВ на белке в результате их взаимодействия 112
5.4. Характеристика молекулярных параметров образующихся комплексов ПАВ + белок 115
5.4.1 Роль структуры и молекулярного состояния ПАВ в образовании и свойствах комплексов ПАВ + белок 115
5.4.2 Роль молекулярного состояния белка (на примере 1 IS глобулина) в образовании и свойствах комплексов ПАВ + белок 137
5.5. Характеристика структурообразующих свойств комплексов ПАВ + белок 151
5.5.1 Поверхностная активность комплексов ПАВ + казеинат натрия (рН 7.2,1=0.05 М) на плоской границе раздела фаз воздух-вода и её" связь с наблюдаемой пенообразующей способностью изучаемых комплексов 151
5.5.2 Поверхностная активность комплексов ПАВ + казеинат натрия (рН 5.5» 1=0.05 М) на плоской границе раздела фаз воздух-вода и её связь с наблюдаемой пенообразующей способностью изучаемых комплексов 154
5.5.3 Поверхностная активность водных растворов комплексов ПАВ + нативный 11S глобулин на плоской границе раздела фаз воздух-вода и их пенообразующая способность 162
5.5.4 Поверхностная активность водных растворов комплексов ПАВ + термоденатурированный 1 IS глобулин на плоской границе раздела фаз воздух-вода и их пенообразующая способность 169
Выводы 173
- Характерные черты взаимодействия ПАВ с белками и структурные модели образующихся между ними комплексов.
- Методы
- Метод оценки скорости дренажа водной среды из пены
- Термодинамическая характеристика взаимодействий белков с ПАВ в водной среде по данным калориметрических измерений
Введение к работе
Белки относятся к широко представленному в природе классу биополимеров, которые благодаря большому разнообразию их молекулярных структур и свойств, выполняют множество важных и хорошо известных биологических функций как в организме человека и животных, так и в растениях. При этом одной из ключевых функций белков, вытекающей из их полимерной природы, является их структурообразующая функция. В её основе лежит ярко выраженная способность белков к самоассоциации, конформационным изменениям, адсорбции на границах раздела фаз, а также к фазовому расслоению и комплексообразованию с различными по природе низкомолекулярными соединениями и биополимерами. Так, например, благодаря этой функции, биополимеры участвуют в построении клеточных мембран и структуры различных тканей и жидких сред в живых организмах и растениях, а также способны гибко регулировать ионный, глюкозный или липидный обмен между клеткой и её окружением.
В настоящее время во всём мире отмечается растущий интерес к использованию структурообразующей функции белков in vitro, т.е. в промышленных целях, для создания продукции, обладающей усовершенствованной или уникальной структурой и свойствами, а также высокой физической стабильностью. Этот интерес, с одной стороны, подготовлен накопленными глубокими знаниями о молекулярных свойствах индивидуальных белков, способах их очистки и выделения из природного сырья, а также успехами в их широкомасштабном производстве и длительном хранении. С другой стороны, он вызван возрастающей потребностью, в частности пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в разнообразных полезных для человека, биосовместимых, нетоксичных, экологически чистых и высокофункциональных ингредиентах для разработки и выпуска так называемой «функциональной»
продукции нового поколения, отличающейся ярко выраженным положительным воздействием на здоровье людей и, тем самым, на качество их жизни. При этом, наиболее перспективной, с точки зрения инноваций, может быть разработка «функциональной» продукции коллоидного типа, т.е. такой, которая наряду с водной фазой (дисперсионной средой) содержит тонко диспергированные масляную или воздушную фазы (разнообразные эмульсии, пены, гели и их смешанные варианты). Такие системы предоставляют широкие возможности для молекулярного дизайна продукции нового поколения с уникальной структурой и свойствами, однако, являясь в принципе термодинамически метастабильными, они требуют для своего образования и существования в течение длительного времени введения высокоэффективных эмульгаторов и стабилизаторов. В настоящее время в качестве ключевых стабилизирующих компонентов для таких систем используются различные белки и низкомолекулярные поверхностно активные вещества (ПАВ) природного и синтетического происхождения, которые благодаря их амфифильной природе способны формировать защитные адсорбционные слои на коллоидных частицах дисперсной фазы (масло, воздух). При этом, широко распространённым на практике является одновременное использование ПАВ и белков для формирования специфической структуры и достижения более высокой стабильности коллоидных систем при их переработке и хранении или, напротив, для их целенаправленной дестабилизации в процессе производства.
К моменту начала нашей работы наиболее полно была изучена конкуренция между белками и ПАВ в формировании адсорбционных слоев на границе раздела фаз в коллоидных системах. При этом, во многих работах высказывалось предположение о возможном значительном вкладе в этот процесс взаимодействий между ПАВ и белками. Также данные ряда работ свидетельствовали об эффективном взаимодействии ПАВ с белками с образованием комплексных молекулярных структур с новыми свойствами, отличными от свойств составляющих их компонентов.
Таким образом, было очевидно, что для более глубокого понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе образования и стабилизации коллоидных систем, содержащих как ПАВ, так и белки, была необходима более полная информация как о закономерностях взаимодействия белков с ПАВ, так и об особенностях молекулярных структур и термодинамических свойствах образующихся между ними комплексов. Кроме того, можно было предположить, что целенаправленное объединение, как правило более высокой, чем у белков, поверхностной активности ПАВ с полимерной природой белков, в результате их взаимодействия, могло бы привести к созданию более эффективных комплексных эмульгаторов и стабилизаторов коллоидных систем, обеспечивающих формирование более плотно упакованных и стерически более прочных защитных адсорбционных слоев на коллоидных частицах различной природы. Актуальность постановки таких задач обусловлена также и насущной потребностью пищевой, фармацевтической и косметической промышленности в расширении как ассортимента, так и функциональности биологически совместимых и нетоксичных эмульгаторов и стабилизаторов для различных коллоидных систем; поскольку хорошо известно, что число наименований таких эмульгаторов и стабилизаторов, выпускаемых на сегодняшний день даже мировыми лидерами по их производству, например, датской компанией «Даниско», ограничивается только несколькими десятками, что значительно тормозит инновационный процесс в разработке продукции коллоидного типа нового поколения.
Таким образом, представляемая работа была посвящена выяснению как закономерностей взаимодействия белков с ПАВ, так и возможности формирования новой функциональности ПАВ и белков в результате этого взаимодействия. При этом, используя термодинамический подход, мы пытались подойти к пониманию основных взаимосвязей в ряду: молекулярная структура ПАВ и белков - природа взаимодействия между ними - молекулярные параметры
8 образующихся комплексов ПАВ+белок - функциональность образующихся комплексов ПАВ+белок в модельных коллоидных системах.
Кроме того, к моменту постановки настоящей работы, большинство представленных в литературе публикаций относилось к исследованию взаимодействия ограниченного числа, как правило, разноимённо заряженных модельных ПАВ и белков, что безусловно требовало расширения объектов исследования как по природе, так и по их структуре. При этом, особый интерес вызывало изучение взаимодействия белков и ПАВ важных для практики и обычно одноимённо заряженных в условиях их возможно наиболее широкого промышленного использования (диапазон рН от 7.0 до 5.0).
2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Характерные черты взаимодействия ПАВ с белками и структурные модели образующихся между ними комплексов.
Низкомолекулярные ПАВ обладают сильным сродством к связыванию, причём не только с различными поверхностями, но и с другими растворёнными частицами: небольшими ионами, полимерами, другими молекулами ПАВ. В свою очередь, сочетание гидрофильных и гидрофобных сегментов в белке, которое делает его высоко поверхностно активным, позволяет считать его идеальным субстратом для связывания небольших амфифильных молекул, как ионных, так и неионных. Выше уже отмечалась предполагаемая теоретически и установленная экспериментально возможность образования комплексов белок+ПАВ при добавлении низкомолекулярного ПАВ к эмульсиям, стабилизированным различными белками. Недавние исследования показали, что ионные ПАВ могут связываться с молекулами белка посредством различных физико-химических механизмов. Заряженная часть ПАВ связывается с противоположно заряженными группами на поверхности белка за счёт электростатического притяжения. Для неионных ПАВ центрами связывания могут будут гидрофобные участки на поверхности белка [57-87]. В зависимости от концентрации, ПАВ могут взаимодействовать с белком в виде индивидуальных мономеров или в виде мицеллоподобных кластеров [88]. Присоединившиеся к белку молекулы ПАВ могут стабилизировать/дестабилизировать структуру белка [57, 77-79, 81, 88-91, 94-103], а также ускорять/замедлять самоассоциацию молекул белка в зависимости от типа ПАВ, его концентрации и внешних условий (Т, рН, ионная сила) [57, 88, 89]. На основании ряда экспериментальных данных были предложены следующие структурные модели комплексов белок+ПАВ при высоких концентрациях последнего: -вытянутый эллипсовидный агрегат ПАВ с белком внутри мицеллы [104]; -мицеллоподобные кластеры, хаотично распределённые вдоль полипептидной цепи в модели «ожерелье и бусины» [105]; -гибкая, покрытая белковой спиралью цилиндрическая мицелла [106]. Кроме того, следующие различные структуры комплексов были найдены в эксперименте. Так, Турро с сотрудниками [107] на основании данных, полученных методами флуоресценции и ЯМР, пришли к выводу, что лучше всего структуру комплекса сывороточный бычьий альбумин (БСА)-додецил сульфат натрия (SDS) описывает модель «ожерелья из бусин», состоящего из маленьких мицелл SDS, расположенных вокруг глобулы БСА. В работе [57] также установлено, что моделью, описывающей структуру комплексов БСА/SDS и лизоцим (Lys)/SDS является модель «ожерелье из бусин».
В случае БСА, благодаря большей длине и подвижности его полипептидной цепи, возрастает вероятность того, что белок частично обёртывает мицеллярный агрегат, сформированный молекулами SDS на белке. Молекула лизоцима - меньше и более твёрдая, следовательно, она не может обернуть мицеллы ПАВ и защитить их от контакта с водой. Наиболее полно механизм связывания был изучен для системы противоположно заряженное ПАВ-белок, а именно для системы SDS-лизоцим [59-73]. Лизоцим имеет компактную глобулярную структуру, стабильную при низких значениях рН. Он имеет молекулярный вес 14 350 Да и содержит 129 аминокислот в единичной полипептидной цепи. Его глобулярную форму и стабильность обеспечивают четыре дисульфидных мостика, водородные связи и гидрофобные взаимодействия между аминокислотами (изоэлектрическая точка отвечает рН = 11.35). Сравнение изотерм связывания и кривых осаждения показывает, что число связей молекул SDS, при котором происходит максимальное осаждение (25 С, рН 5.8), согласуется с числом отрицательных ионов, которое требуется для нейтрализации суммарного заряда на молекуле лизоцима. Область плато на изотерме связывания свидетельствует о насыщении всех участков на положительно заряженной молекуле белка, имеющих сродство к связыванию анионов (остатки аргинина). Когда концентрация ПАВ приближается к ККМ, на изотерме связывания наблюдается резкое увеличение значения Ыь (число связывания моль SDS на моль белка) в относительно узком диапазоне концентраций SDS. В этой области неспецифического кооперативного связывания движущей силой процесса комплексообразования является сила, аналогичная той, что действует при кооперативной ассоциации молекул ПАВ при их объединении в мицеллы в отсутствии белка. Кривая осаждения становится же с ростом значения рН, т.е. меньшее количество ПАВ требуется для нейтрализации заряда. Было установлено, что электростатическое связывание SDS с лизоцимом увеличивает гидрофобность поверхности молекулы белка, что приводит к агрегации комплексов белок+ПАВ. При рН 6.0 и концентрации SDS 0.03 М установлено, что среднее число агрегации составляет 3.0 [59]. В более новой работе [57], посвященной изучению этой же системы (т.е. Lys-SDS) (рН 3.2, 9.1, I - 0.1 М, 0.014 М), приводятся следующие количественные данные, полученные из изотерм связывания: число связей молекул SDS с белком оказывается меньше и увеличивается от 4, при концентрации свободного SDS 0.25 мМ, до 18, при концентрации SDS 1 мМ. Кооперативное связывание начинается при концентрации SDS 3.16 мМ (концентрация Lys составляет 1.25 мМ при рН = 3.2). Насыщение первых 18 участков, представляющих собой катионные аминокислотные остатки, приводит к осаждению. Дальнейшее повышение концентрации SDS растворяет комплекс белок-ПАВ. Взаимодействия в системе Lys-SDS также были изучены путём построения фазовой диаграммы (рН 6.5, 25 С) в тройной системе в пределах концентрационного ряда от 0 до 20 % масс, белка и от 0 до 20 % масс. ПАВ [108]. Было установлено, что добавление уже небольших количеств SDS (я Ю"5 М) в водный раствор лизоцима (рН 6.5, 25 С, концентрация белка 2.5 % масс.) приводит к осаждению.
Осадок образуется из-за нейтрализации заряда на белке (восемь положительных зарядов на одной молекуле белка) в результате присоединения молекул ПАВ. Соединительные линии фазовой диаграммы сходятся к концентрации ПАВ, отвечающей полной нейтрализации заряда белка и, следовательно, максимальному количеству осаждённого комплекса белок-ПАВ. При добавлении большего количества SDS происходит полное растворение образовавшегося осадка. По форме соединительных линий на фазовой диаграмме был сделан вывод об ассоциативном типе взаимодействий между лизоцимом и SDS. Найден эффект снижения степени связывания SDS-казеин при увеличении значения рН, предположительно на основе электростатического отталкивания между ними [74]. В работе [75] из результатов измерений, проведённых методом ДСК, авторы сделали предположение о том, что нагревание благоприятствует гидрофобному связыванию р-лактоглобулина с SDS при рН 7.0. Также было исследовано связывание SDS с бычьим сывороточным альбумином (BSA) [57, 76]. В этом случае связывание SDS с белком осуществлялось как за счёт электростатических, так и гидрофобных взаимодействий. При высоком значении степени связывания (Nb 80), спектроскопия ЯМР по 13С показывала, что молекулы ПАВ находятся в мицеллоподобной окружающей среде, в которой алкильные цепи ПАВ ассоциированны с неполярными группами белка. Альбумин бычьей сыворотки имеет молекулярный вес 66 200 Да и содержит 581 аминокислоту в единичной полипептидной цепи. При помощи 17 дисульфидных мостиков белок свёрнут в структуру, которую приближённо можно описать как равностороннюю треугольную призму со сторонами около 80 А и толщиной около 30 А. При нейтральном значении рН белок имеет отрицательный суммарный заряд (изоэлектрическая точка белка: pi = 5.2) и претерпевает конформационные изменения при значениях рН выше и ниже pi. Было установлено, что изотерма связывания SDS на БСА характеризуется четырьмя различными участками [77]. Начальный участок, при очень низкой концентрации ПАВ (гораздо ниже ККМ), ассоциируется со связыванием SDS со специфическими участками на белке, и эти взаимодействия имеют электростатическую природу [78]. Второй участок - это плато, которое ассоциируется с насыщением специфических центров связывания на молекуле белка. Третий участок соответствует значительному увеличению связывания за счёт кооперативных взаимодействий белка с SDS. По-видимому, на этом участке происходит разворачивание белка.
Методы
Растворы белков («1 % вес/объём) готовили с использованием фосфатного (рН 7.2, I = 0.05 М) и ацетатного (рН 5.5, I = 0.05 М) буферов. Для удаления небольшой части нерастворимого белка применялось центрифугирование при 4000 об/мин в течение 30 мин при 20 С. Концентрацию белка в растворе после центрифугирования проверяли методом дифференциальной рефрактометрии (Shimadzu, Япония) по известным значениям инкрементов показателя преломления белков v (раздел 4.2.6). 4.2.2 Приготовление растворов ПАВ и их смешанных растворов с белком. Используемые для последующего разбавления базовые растворы низкомолекулярных ПАВ (100 мг/л) готовились с применением ультразвуковой обработки в течение 1 часа при частоте 4.5 кГц с одновременным встряхиванием растворов на водяной бане при 65 С (водяная баня-шейкер CPLAN, тип 357, Польша) для лучшего растворения веществ. В результате получались хорошо диспергированные растворы низкомолекулярных ПАВ в водной среде. Охлаждённые до комнатной температуры, эти базовые растворы ПАВ использовались как для приготовления концентрационных серий растворов ПАВ, так и для приготовления смешанных растворов с белком в требуемых концентрациях. Перед использованием смешанные растворы (0.5 - 1 % вес/объём белка + н.м. ПАВ в требуемой концентрации) встряхивали при 40 С в течение 1 часа (установка для выращивания микроорганизмов термостатированная, УВМТ-12-250, НПО ТИПКО - завод «Элион», Россия) и охлаждали до комнатной температуры. Измерения тепловых эффектов взаимодействия белков с н.м. ПАВ, а также их разбавления растворителем проводили с использованием калориметра смешения LKB 2277 (Швеция) в диапазоне температур от 20 до 50 С (шаг 10 С). Смешиваемые растворы подавались в калориметр перистальтическим насосом с известным одинаковым расходом по каждому каналу (скорость потока составляла 4 х 10"6 л/сек). Таким образом, в измерительной ячейке растворы белков и низкомолекулярных ПАВ во всех случаях разбавлялись при смешении в два раза. Перед подачей в реакционную измерительную ячейку калориметра, все растворы термостатировались до заданной температуры эксперимента во внешнем термостате. Перед каждой серией измерений калориметр осуществляет автоматическую электрокалибровку при выбранной температуре эксперимента. Чувствительность калориметрических измерений составляет не менее, чем 3 х 10"6 Дж/сек.
В эксперименте были измерены тепловые эффекты следующих процессов; (І)разбавления раствора белка чистым буфером, СЬел-бУф; (2)разбавления раствора низкомолекулярного ПАВ чистым буфером, QriAB-буф; (3)разбавления раствора белка раствором низкомолекулярного ПАВ, Qi. Удельная энтальпия взаимодействия между белком и низкомолекулярным ПАВ была рассчитана по следующему уравнению: АЦел-ПАВ = "( Qs - 2бел-буф - ОпАВ-буф) / А » (1) где Дп — это количество грамм белка, смешиваемого с низкомолекулярным ПАВ в секунду (г/сек). Термодинамические функции, характеризующие процесс термоденатурации глобулярного белка: изменение энтальпии, ДНа, изменение удельной теплоёмкости, AdCp, температуру денатурации, Т ь и ширину калориметрического перехода на половине высоты теплового пика, АТід (К), определяли с использованием дифференциального адиабатического сканирующего микрокалориметра (ДАСМ-4, специальное конструкторское бюро разработки биологических приборов РАН, г. Пущино) в диапазоне от 20 С до ПО С, при скорости сканирования 2 С/мин и избыточном давлении 2.5 атм. Приём и оцифровка данных осуществлялись при помощи компьютерной программы WSCAL (разработчик А. Сенин, г. Пущино). Концентрация белка в растворах составляла 0.005 г/мл. Точность измерений составляла ±10 % от значений измеряемой теплоёмкости. Термодинамические параметры денатурации белка были рассчитаны в соответствии с процедурой, описанной в работе [184]. Пример термограмм белка и его комплекса с ПАВ представлен на Рис. 5. 4.2.5 Метод статического лазерного светорассяения. Средневесовые значения молекулярной массы, Mw, радиус инерции, Rg, а также величины вторых вириальных коэффициентов, Абел-бел» для молекул белков индивидуально и в смеси с низкомолекулярными ПАВ, при концентрации последних как ниже, так и выше ККМ, определяли методом статического лазерного светорассеяния в разбавленых водных растворах белков (от 1 х 10"2 до 1 х 10 г/мл для 11S глобулина; от2х10 до4х10 г/мл для казеината натрия; 5-8 концентрационных точек). Отношение Релея, Re, было измерено с использованием вертикально поляризованного света (633 нм) при различных углах светорассеяния в диапазоне от 40 до 140 (13 углов) с использованием прибора лазерного многоуглового светорассеяния VA Instruments LS-01 (С-Пб, Россия), откалиброванного по обеспыленному бензолу (Rw=11.84 х 10"6 см"1). Растворы белков и смешанные растворы (белок + н.м. ПАВ) обеспыливали путём фильтрования прямо в сеторассеивающую ячейку через мембраны (Миллипор, США) с размером пор 0.65-0.8 мкм.
Концентрацию белков проверяли каждый раз после фильтрации, используя известные величины v. Данные прибора использовались для построения угловой и концентрационной зависимости отношения HC/ARe согласно методу Зимма [185]. Пример обработки данных светорассеяния по методу Зима представлен на Рис. 6. Где С - это концентрация белка (г/мл), ARQ является избыточным рассеянием света раствором, по отношению к чистому растворителю, содержащему только низкомолекулярные компоненты, при угле измерения 0, а Н - это оптическая константа прибора, равная 4n2n2v2/NA -4, где NA - число Авогадро, X - длина волны падающего света в вакууме, п — показатель преломления растворителя, a v — инкремент показателя преломления белков. Значения средневесовой молекулярной массы, Mw, были определены как средние величины, рассчитанные в точках пересечения с осью ординат концентрационных зависимостей HC/ARe при 9 »0 (экстраполяция проведена по 13 углам) и угловых зависимостей HC/ARg при С- 0 (экстраполяция проведена по 5-8 концентрациям) для каждой изученной системы. Значения радиуса инерции, Rg, определялись по наклону угловой зависимости HC/ARe при С— 0. Значения вторых вириальных коэффициентов, Абел-бел, определялись из тангенсов угла наклона концентрационных зависимостей HC/ARe при 6- 0 для каждой системы. Второй вириальный коэффициент характеризует, в первую очередь, термодинамическое сродство молекул белка к растволрителю (в нашем случае к водной среде) (растворитель термодинамически ПЛОХОЙ, ЄСЛИ Абелей, О ИЛИ, Напротив, ТерМОДИНаМИЧеСКИ ХОРОШИЙ, ЄСЛИ Абел-бел 0; если Абел-бел - 0, то растворитель является термодинамически идеальным) [186], т.е. при проведении измерений в водной среде величина второго вириального коэффициента косвенным образом даёт представление о гидрофобности/гидрофильности белковой поверхности. Значения Mw, Абел-бел и RG, приводимые в данной работе, являются средними значениями по крайней мере двух повторов каждного эксперимента. Ошибка метода при определении Mw и Абел-бел составляет ± 10 %. Ошибка метода в определении RG составляет ±5%[187,188]. 4.2.6 Метод дифференциальной рефрактометрии. Значения инкрементов показателя преломления, v, для 1 IS глобулина и казеината натрия в водном растворе при различных концентрациях добавленного ПАВ определяли при помощи дифференциального рефрактометра фирмы Shimadzu (Япония) А, = 633 нм. Все измерения были сделаны в термостатируемой ячейке при 20 ± 0.5 С. Ошибка опыта составляла ± 10 %. Значения инкрементов показателей преломления для легумина, при рН 7.2 и I = 0.05 М и при различных концентрациях ПАВ, оставались неизменными в пределах ошибки опыта и составили для нативного и термоденатурированного легумина: v = 0.2 х 10 3 м3/кг и v = 0.18 х 10" м/кг, соответственно. В случае казеината натрия и его комплексов с ПАВ, значения инкрементов показателей преломления приведены в Табл. 1.
Метод оценки скорости дренажа водной среды из пены
Концентрационную зависимость энтальпии разбавления (Рис. 8 а) можно разделить на три концентрационных области [192]. Первая - область предельно низких концентраций, соответствует пракически постоянным значениям энтальпии разбавления, отвечающим разбавлению индивидуальных молекул ПАВ буфером. Более высоким концентрациям ПАВ соответствует вторая область, с резким снижением энтальпии разбавления, которое главным образом может быть связано с возможным процессом демицеллизации образующихся в этой концентрационной области мицелл ПАВ. Эта область соответствует критической концентрационной области мицеллообразования в растворе ПАВ, т.е. когда в растворе в равновесии могут существовать индивидуальные молекулы ПАВ и их мицеллы. В этой области первая производная энтальпии разбавления по концентрации имеет минимум, кторый указывает на критическую концентрацию мицеллообразования (ККМ) (Рис. 86) (Табл. 2). В третьей концентрационной области равновесие полностью смещено в сторону существования стабильных мицелл ПАВ, поэтому при разбавлении мицеллы больше не разрушаются, и измеряемая энтальпия характеризует только разбавление мицелл буфером [192]. Благодаря тому факту, что область ККМ может быть достаточно точно определена, оказалось возможным вычисление кажущейся энтальпии процесса мицеллообразования, ДНциц"35 , для каждого ПАВ. При этом за ДНмшкаж принимали величину противоположную по знаку значению удвоенной разности между энтальпиями, соответствующими ККМ и третьему участку на концентрационной зависимости энтальпии разбавления, что можно определить с достаточно высокой точностью [192] (Табл. 3). Таким образом, при обработке данных калориметрических измерений было найдено, что в пределах ошибки опыта, значения ККМ для каждого ПАВ практически не изменяются как с изменением температуры в диапазоне от 20 до 50 С, так и с изменением значений рН от 5.5 до 7.2. Усреднённые по рН и температуре интервалы ККМ приведены в Табл. 2. Знание значений ККМ делает возможным рассчёт изменения свободной энергии Гиббса в процессе образования мицелл данными ПАВ, и тем самым оценку термодинамической стабильности этих мицелл, по следующему уравнению [193, 194]: AGMHU = kTln(KKM) (3) где значение ККМ выражено в мг/л.
При рассчёте AGM(IU для каждой температуры, использовались рН-усреднённые значения ККМ. На Рис. 9 показана температурная зависимость нормализованной по кТ свободной энергии Гиббса процесса мицеллообразования изучаемых ПАВ, AGMHl,. Чем ниже значение ККМ, и чем выше отрицателное изменение свободной энергии Гиббса AGMHIW тем более термодинамически выгоден процесс мицеллообразования ПАВ, т.е. очевидно, что при этом образуются более термодинамически стабильные мицеллы. В соответствии с тем фактом, что гидрофобные взаимодействия являются основной движущей силой процесса мицеллообразования ПАВ в водной среде [192-195], действительно, было обнаружено увеличение отрицательных значений AGM„U при снижении полярности ПАВ в ряду CITREM (две заряженных группы) SSL (одна заряженная группа) PGE (0 80) (нет заряженных групп) (Рис. 2, 3, 4). То есть наиболее термодинамически стабильными в ряду изученных ПАВ можно считать мицеллы, образованные PGE. В дополнение к вышесказанному, практически во всём диапазоне температур и значений рН наблюдались отрицательные значения ДНмиц , указывая на экзотермический характер образования мицелл изучаемых ПАВ в водной среде (Табл. 3), что свидетельствует о преимущественном вкладе энтальпийной составляющей в свободную энергию мицеллообразования. Полученный результат полностью согласуется с ожидаемым экзотермическим по своей природе переходом углеводородной части молекул ПАВ из водной среды внутрь неполярной области в мицеллах ПАВ при температурах 20 С [75, 196]. Кроме того, в соответствии с уменьшением полярности ПАВ, действительно, было обнаружено увеличение отрицательных значений энтальпии мицеллообразования, ДНмицкаж, в ряду: CITREM (две заряженных группы) SSL (одна заряженная группа) PGE (0 80) (нет заряженных групп). гидрофобности/гидрофильности поверхности образующихся мицелл ПАВ. Можно предположить, что в случае мицелл ПАВ свойства их поверхности могут быть среди ключевых факторов, определяющих характер их взаимодействия с белками. Для дальнейших объяснений введём понятие гидрофильно/липофильного баланса. Пищевые эмульгаторы часто классифицируются в соответствии с т.н. числом гидрофильно/липофильного баланса (ГЛБ) [197]. Это полуэмпирическое понятие, предложенное Гриффином и основанное на идее о том, что для системы масло + вода существует оптимальный баланс между гидрофильными и липофильными молекулярными свойствами ПАВ, что приводит к их максимальной эмульгирующей способности. Для простоты можно считать, что ГЛБ измеряется как относительное «смачивание» ПАВ масляной и водной фазами.
При большом значении ГЛБ, характерном для гидрофильных эмульгаторов, наблюдается их преимущество в стабилизации эмульсий «масла в воде», тогда как преимущество липофильных эмульгаторов (малое значение ГЛБ) проявляется в стабилизации эмульсий «воды в масле». В соответствии со шкалой Гриффина, ПАВ со значениями ГЛБ в пределах 4-6 пригодны для образования эмульсий «воды в масле», а ПАВ с ГЛБ = 8-18 пригодны для образования эмульсий «масло в воде», тогда как ПАВ с ГЛБ w 7 не имеют преимуществ в стабилизации ни того ни другого вида эмульсий [197]. Относительную информацию об изменении ГЛБ изучаемых ПАВ при их мицеллообразовании можно получить из данных калориметрии смешения, поскольку первая производная ДНмицкаж по температуре даёт представление о характере изменения теплоёмкости при мицеллообразовании: АСмицкаж = (d(AHMlil"- lT) (4) А изменение теплоёмкости ДСмицкаж, в свою очередь, связано с изменением доли гидрофобной поверхности молекул ПАВ, контактирующей с водной средой при мицеллообразовании [192, 198-201]. Так например, чем ниже положительное значение ДСцнц , тем менее гидрофобной, то есть более гидрофильной, становится поверхность формирующихся мицелл ПАВ, и наоборот [192, 198-201]. Из температурных зависимостей изменения теплоємкостей при мицеллообразовании, представленных на Рис. 10, видно, что наиболее гидрофобная поверхность присуща мицеллам SSL, особенно при значении рН 5.5, т.е. когда ожидается, что молекулы ПАВ менее заряжены, чем при рН 7.2. В этом случае увеличение температуры благоприятствует дальнейшему значительному росту гидрофобности поверхности мицелл. В противоположность SSL, PGE образует мицеллы, характеризующиеся наибольшей гидрофильностью поверхности. Большие отрицательные значения изменения теплоёмкости, ЛСмицкаж, найденные для этого ПАВ, являются отличительной особенностью процессов гидрофобной ассоциации в водной среде [192] (т.е. мицеллообразования PGE в нашем случае), что хорошо согласуется, с одной стороны, с наименьшей полярностью (неионной природой) молекул PGE в изучаемом ряду ПАВ, а с другой стороны, с довольно большим числом гидроксильных групп в молекуле PGE (Рис. 3), которые могут образовывать гидрофильный слой на поверхности мицеллы вокруг её гидрофобного ядра. CITREM, в свою очередь, образует мицеллы с промежуточной гидрофобностью/гидрофильностью поверхности, т.е. АСмиц" (PGE) ДСмиц1"8 (CITREM) ДСщ (SSL). В этом случае гидрофобность мицелл CITREM более отчётливо выражена при значении рН 5.5, т.е. когда заряд молекул CITREM должен быть меньше, чем при рН 7.2.
Термодинамическая характеристика взаимодействий белков с ПАВ в водной среде по данным калориметрических измерений
Из данных метода калориметрии смешения видно, что в случае CITREM при 293 К, наблюдается ярко выраженный эндотермический характер взаимодействия ПАВ-белок (Рис. Па), который можно объяснить как гидрофобными взаимодействиями [202] между углеводородной частью ПАВ и неполярными участками молекулы белка, так и эндотермическим по своей природе, при данной температуре, переходом молекул ПАВ из водной среды внутрь гидрофобного ядра наночастиц белка, который аналогичен по природе встраиванию молекул ПАВ в гидрофобное ядро мицелл ПАВ при их формировании [192]. По-видимому, наличие одноимённого с ПАВ заряда на поверхности наночастиц казеината натрия при рН 7.2, а кроме того большой размер полярной части CITREM, препятствующий проникновению ПАВ внутрь наночастиц белка (Рис. 2), значительно уменьшают вероятность взаимодействий другой природы, таких как электростатические, донорно-акцепторные или образование водородных связей. Интересно отметить, что с повышением температуры наблюдается резкое изменение в характере взаимодействия ПАВ-белок от эндотермического к экзотермическому, что в условиях усиливающихся гидрофобных взаимодействий и ослабляющихся взаимодействий, имеющих экзотермический характер (электростатических, донорно-акцепторных, водородных связей и др.) [202], может быть обусловлено скорее всего тем, что значительно интенсифицируется экзотермический ло характеру процесс переноса неполярных участков CITREM из полярной водной фазы в неполярную внутреннюю область наночастиц белка, подобно тому, как усиливается экзотермический характер перехода молекул ПАВ внутрь мицелл ПАВ с повышением температуры 293 К [75, 186, 192]. характер как при 293 К, так и при 323 К (Рис. 116). Однако, при 293 К эндотермический характер взаимодействия при рН 5.5 оказывается менее ярко выраженным. По-видимому, меньший заряд на белке способствует как усилению его гидрофобных контактов с CITREM, заряд которого также, по-видимому, частично нейтрализован при рН 5.5, так и усилению взаимодействий между полярными группами ПАВ и белка, имеющих, как правило, экзотермический характер, за счёт ослабления электростатического отталкивания между ними. При этом, усиление эндотермического характера взаимодействий с ростом температуры от 293 до 323 К хорошо согласуется с усилением гидрофобных взаимодействий в этом температурном интервале [202]. Казеинат натрия + SSL, В отличие от взаимодействия с CITREM, в случае SSL при рН 7.2 и 293 К наблюдается ярко выраженный экзотермический характер взаимодействия этого ПАВ с белком (Рис. 12а).
Этот результат, скорее всего, может быть обусловлен образованием как множественных электростатических контактов между противоположными зарядами белка и ПАВ, так и донорно-акцепторных и водородных связей [202]. Этому, по-видимому, способствует как меньший заряд полярной части молекулы SSL, так и её размер (Рис. 4), что в условиях очевидно более слабого электростатического отталкивания позволяет молекулам SSL целиком проникать внутрь наночастиц казеината натрия, повышая тем самым вероятность контактов различной природы между молекулами белка и ПАВ. Повышение температуры до 323 К приводит к ослаблению водородных связей и электростатических взаимодействий [202], при этом преобладающими становятся гидрофобные контакты между неполярными участками молекул SSL и что отражается в заметном эндотермическом тепловом эффекте их взаимодействия при 293 К. Повышение температуры до 323 К приводит к изменению теплового эффекта взаимодействия ПАВ-белок от эндотермического к ярко выраженному экзотермическому (Рис. 126). По-видимому, в этих условиях, также как и в случае с CITREM при рН 7.2, интенсифицируется экзотермический по характеру процесс перехода углеводородных цепочек SSL из полярной водной фазы в неполярную внутреннюю область наночастиц белка [192]. Казегшат натрия + PGE. При взаимодействии молекул неионного PGE (Рис. 3) с наночастицами казеината натрия при рН 7.2 и 293 К наблюдался ярко выраженный экзотермический тепловой эффект (Рис. 13 а), наиболее вероятно обусловленный образованием множественных водородных связей [202] данного ПАВ с белком за счёт многочисленных гидроксильных групп, содержащихся в полярной части PGE (Рис. 3). Ослабление экзотермического характера взаимодействий при повышении концентрации PGE, по-видимому, может быть связано с увеличением вклада эндотермического по своей природе при 293 К процесса перехода углеводородных цепей индивидуальных молекул ПАВ из полярной среды внутрь наночастиц белка [192].
При повышении температуры до 323 К наблюдалось изменение теплового эффекта взаимодействия ПАВ-белок от экзотермического к эндотермическому (Рис. 13 а), что вероятно обусловлено значительным усилением гидрофобных контактов между неполярными участками молекул PGE и наночастиц казеината натрия [202]. Как видно из Рис. 136, понижение значения рН до 5.5 не приводит в случае неионного PGE к значительному изменению характера взаимодействия его молекул с наночастицами казеината натрия. Из этого экспериментального факта можно сделать предположение о том, что с белком взаимодействуют только отдельные молеулы CITREM, которые присутствуют в растворе наряду с мицеллами. Сами же мицеллы, по-видимому, с белком не взаимодействуют из-за значительного электростатического отталкивания между одноимённо заряженными поверхностями мицелл и наночастиц белка. При увеличении температуры до 323 К, как и в случае взаимодействия с белком отдельных молекул CITREM, взаимодействия CITREM в мицеллярном состоянии с белком носят отчётливый экзотермический характер (Рис. 14а). В этом случае также можно предположить, что с наночастицами казеината натрия взаимодействуют не сами одноимённо заряженные мицеллы, а только отдельные молекулы CITREM. Кроме того, менее ярко выраженный экзотермический характер взаимодействия белка с мицеллами может быть связан с вкладом эндотермического теплового эффекта, возникающего от разрушения мицелл CITREM при столкновении с наночастицами белка. Поскольку, именно мицеллы CITREM характеризуются минимальной термодинамической стабильностью в ряду изученных ПАВ (Рис. 8) AG OTREM І IA GMHUSSLI IА ОмицРСЕ I. При понижении рН до 5.5, при 293 К, найденный для отдельных молекул CITREM эндотермический характер взаимодействий ПАВ-белок (Рис. 116) сохраняется и в случае взаимодействия этого ПАВ в мицеллярном состоянии (Рис. 146). Однако, более ярко выраженный эндотермический характер взаимодействия свидетельствует, во-первых о том, что в этом случае гидрофобное присоединение молекул CITREM к белку облегчается за счёт уменьшения числа одноимённых зарядов как на белке, так и на ПАВ, а во-вторых, об увеличении общего числа гидрофобных контактов в результате возможного разрушения термодинамически нестабильных мицелл CITREM при их столкновении с белком и высвобождении большого числа отдельных молекул ПАВ. Повышение температуры от 293 К до 323 К, как и в случае взаимодействия с индивидуальными молекулами ПАВ (Рис. 116), способствует усилению данного ПАВ с белком (Рис. 12а и 15а). Как и в случае мицелл анионного CITREM, одноимённо заряженные мицеллы SSL и наночастицы казеината натрия, по всей вероятности, электростатически отталкиваются друг от друга, исключая тем самым возможные взаимодействия.
