Введение к работе
Актуальность исследования. За последние годы проточная цитометрия становится одним из наиболее востребованных методов, как для фундаментальных исследований, так и для диагностики в клинико-иммунологической практике. Расширилась приборная база, и значительно увеличились возможности анализа клеток иммунной системы, позволяющие охарактеризовать не только качественные и количественные параметры основных популяций клеток, но и их более широкий субпопуляционный состав. Используя различные методологические подходы и новую реагентную базу, при помощи проточной цитометрии стало возможным оценивать функциональные свойства популяций и субпопуляций клеток иммунной системы. Значительно расширились возможности для диагностики иммунодисфункций, аллергии, специфических Т-эффекторов и многое другое (Mandy F.F. et al, 2003; Boumiza R. et al., 2005; He X.H. et al., 2006).
Логика развития современной технической, методологической и идеологической базы проточной цитометрии формируется на основе очень широких возможностей современных приборов. Оснащенные гибким программным обеспечением, они способны одновременно анализировать колоссальное количество клеток, идентифицировать отдельные их группы, классы, популяции, субклассы, субпопуляции и т.д., измерять их поверхностные и внутриклеточные маркеры, оценивать их функциональное состояние (Shapiro H.M. 2003).
Развитие современных клеточных технологий и разнообразие новых методологических подходов к исследованиям, связанным с использованием проточной цитометрии в биологии и медицине, поставило целый ряд вопросов о стандартизации данного метода. Эти вопросы особенно важны как для врачей лабораторной диагностики, так и для ученых и специалистов (Луговская С.А. и др., 2005; Gallego A. et al., 2003; Luider J. et al., 2004).
Столь высоко информативный инструмент анализа создает предпосылки для появления множества новых методологических подходов для диагностики различных клеточных дисфункций. Например, уже сейчас 4-5 параметрический анализ позволяет выявить не только ту или иную субпопуляцию клеток, но и ее функциональную активацию или депрессию. В то же время, если увеличить анализ до 9-15 параметровой системы оценки рецепторов клеток, появляется возможность значительно более углубленного анализа, который оправдан для научных исследований, но с точки зрения практической медицины такой подход навряд ли применим, поскольку связан со значительными методологическими трудностями. Именно поэтому возникла необходимость остановиться на тех методологических подходах, которые позволяют по-новому взглянуть на динамическую систему взаимодействия клеток иммунной системы во всем ее разнообразии с четкой характеристикой субпопуляций клеток.
Цель работы. Обосновать методологию, критерии и направления применения многоцветного цитометрического анализа субпопуляций лимфоцитов в медико-биологических исследованиях и оценить их эффективность.
Задачи исследований:
1. Разработать критерии применения многоцветных параметров для иммунофенотипирования клеток на основе стандартизации протоколов исследований в проточной цитометрии.
2. Экспериментально обосновать возможные пути применения и расширения спектра исследований с использованием многоцветного анализа в проточной цитометрии.
3. Обосновать и оценить эффективность применения многоцветного анализа при изучении фенотипа лимфоцитов для лабораторной диагностики нарушений иммунного статуса человека.
4. На основе применения цитометрического анализа разработать алгоритм использования панели для скрининговых исследований и расширенной панели для более углубленного анализа при выявлении отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения.
5. Обосновать методологию использования многоцветного анализа для проведения углубленных научных исследований активности субпопуляций лимфоцитов.
Научная новизна исследований.
Впервые предложен алгоритм оптимизации работы на проточных цитометрах от пре-аналитического, аналитического до пост-аналитического этапов исследований, позволивший разработать критерии стандартизации методов исследований. На их основе разработаны критерии включения тех или иных параметров исследований клеток для практического использования.
Экспериментально обоснованы современные подходы к расширению спектра исследований с учетом использования многоцветного анализа в клинической и научно-исследовательской практике.
Обоснована возможность оценки функциональной активности клеток иммунной системы в процессе их дифференцировки при воздействии различных химических соединений (например, к действию кальциевых ионофоров).
Предложена и внедрена многопараметрическая панель моноклональных антител к различным кластерам дифференцировки, которая охватывает большинство лимфоцитов периферической крови и включает степень активации различных субпопуляций Т-клеток, В-клеток и NK-клеток, что позволяет более точно диагностировать наиболее часто встречающиеся нарушения иммунной системы. Данная панель включает:
IgG/IgG/IgG/CD45 - изотипический контроль
CD19/CD5/CD27/CD45 - В1, В2, В-клетки памяти
CD16/CD56/CD3/CD45 - субпопуляции NK-клеток
CD8/CD4/CD3/CD45 - субпопуляции Т-клеток
CD8/CD38/CD3/CD45 - активированные Т-цитотоксические и NK-клетки
CD4/CD25/HLA-DR/CD45 - активированные Т хелперы
CD45RA/CD45R0/CD4/CD45 - активированные Т хелперы и Т-клетки памяти
TCR-/TCR-/CD3/CD45 - - и -Т-клетки
CD4/CD25/CD127/CD45 - регуляторные Т-клетки.
Предложенные подходы позволили повысить качество диагностики нарушений иммунного статуса и значительно расширили возможности исследования клеток иммунной системы в норме и патологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Разработанный алгоритм оптимизации настройки приборов и создания протоколов для многопараметрического анализа применим при работе на большинстве проточных цитометров ведущих фирм производителей, и может быть использован для стандартизации исследований и разработки критериев включения новых параметров исследования клеток иммунной системы.
-
Среднестатистические значения параметров иммунного статуса условно здоровых лиц в различных регионах России сопоставимы со среднестатистическими значениями параметров иммунного статуса человека, опубликованными в литературе.
-
Введение в первичную панель скринигового исследования иммунной системы антител для выявления аутореактивных клонов В-клеток (CD19,CD5) улучшает диагностику и мониторинг за пациентами с аутоиммунными заболеваниями.
-
При наличии отдельных субпопуляций лимфоцитов, параметры которых не попадают в референтные значения в ходе скрининговых исследований иммунной системы человека, необходимо проведение дополнительных исследований с оценкой некоторых минорных субпопуляций лимфоцитов и анализа функциональных характеристик клеток.
-
В клинико-диагностической практике наиболее предпочтителен четырехцветный цитометрический анализ по сравнению с двух- и трехцветным, что дает возможность получать достоверные данные, характеризующие как субпопуляционный состав, так и ряд функциональных параметров иммунокомпетентных клеток при уменьшении количества образцов и времени, затраченного на получение конечного результата.
-
Изменение репертуара поверхностных рецепторов CD4+ Т-лимфоцитов в процессе активации и дифференцировки сопровождается резистентностью их к действию кальциевых ионофоров.
Практическая значимость работы. Разработанные подходы к стандартизации исследований в проточной цитометрии, алгоритмы оптимизации исследований отдельных субпопуляций и комплексной оценки клеток иммунной системы, предложенные в работе, позволяют применять полученные данные в повседневной практике клинико-диагностических и научно-исследовательских лабораторий, оснащенных современными приборами.
Результаты исследований внедрены в учебный процесс обучения врачей на курсе клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии Росздрава, Санкт-Петербургский Государственный Медицинский Университет им. академика И.П.Павлова; в работу научно-исследовательских лабораторий Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН (г. Москва), ГУ НИИ фармакологии им. В.В. Закусова (г. Москва), Всероссийском Центре Экстренной и Радиационной Медицины им. А.Н.Никифорова, МЧС России (г. Санкт-Петербург), ММА им. И.М. Сеченова (г. Москва), Пятигорском ГНИИ курортологии, и ряде других.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы апробированы как на отечественных, так и на международных симпозиумах и конференциях: Первый Всесоюзный иммунологический съезд (Сочи, 1989); 11th Meeting of European Federation of Immunological societies. (Espoo, Finland. 1991); 8th International Congress of Immunology, (Budapest, Hungary, 1992); 5th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens (Boston, USA, 1993); 6th International Workshop and Conference on Human Leukocyte Differentiation Antigens, Tissue Antigens, (Kobe, Japan, 1996); Fourth International Symposium on Clinical Immunology (Amsterdam, Holland 1997); 10 International Congress of Immunology (New Delhi, India, 1998); John HUMPHRY Advanced Summer Program in Immunology (Pushchino, 1998, 2000, 2002, 2004); The 8th Annual Meeting of Tissue Engineering Society International, (Shanghai International Conventional, P.R. China, 2005); “Дни иммунологии в Санкт-Петербурге” (Санкт-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2007); 2-я конференция “Иммунология репродукции” (Сочи, 2007); Симпозиум “Иммунология слизистых оболочек и аллергология: теория и практика” (Анталия, Турция, 2007); XX Зимняя международная молодежная научная школа “Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии” (Москва, 2008).
Личный вклад автора в работу. Диссертационная работа является результатом многолетних (1986-2008 гг.) исследований по изучению механизма функционирования иммунной системы человека и животных при помощи метода проточной цитометрии и различных флуоресцентных зондов. Все результаты получены лично автором или при его непосредственном участии. Доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу соавторов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 89 работ, в том числе 3 монографии, 82 работы опубликованы в рецензируемых журналах по перечню ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.
![Медико-социальное исследование насилия в отношении женщин (по материалам г. Набережные Челны) [Электронный ресурс]](/i/i/4372/202195.png "Медико-социальное исследование насилия в отношении женщин (по материалам г. Набережные Челны) [Электронный ресурс] Сабиров Ринат Бадриевич")