Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 12
1.1. Теории развития канцерогенеза 12
1.1.1. Мутационная теория 12
1.1.2. Эпигеномная теория 13
1.1.3. Вирусная теория 13
1.2. Протоонкогены и гены-супрессоры 13
1.2.1. Гипотеза Кнудсона 15
1.3. Механизмы действия генов-супрессоров 17
1.3.1. Гены хранители клеточного цикла 21
1.3.1.1. р16 21
1.3.2. Гены общего контроля 22
1.3.2.1. BRCA1,BRCA2 23
1.4. Эпигенетические механизмы 24
1.4.1. Метилирование-как вид эпигенетической модификации ДНК 25
1.4.2. Метилирование ДНК в нормальных клетках 28
1.4.3. Нарушения метилирования ДНК при канцерегенезе
1.4.3.1. Тотальное гипометилирование генома 31
1.4.3.2. Локальное гиперметилирование 33
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Сбор клинического материала 38
2.2. Клеточные линии опухолей, использованные в работе з
2.3. Выделение геномной ДНК из клеточных линий опухолей 39
2.4. Выделение геномной ДНК из лимфоцитов человеческой крови 40
2.5. Выделение геномной ДНК из замороженных тканевых срезов 40
2.6. Выделение геномной ДНК из тканевых срезов, фиксированных в парафине 41
2.7. Бисульфитная модификация геномной ДНК 41
2.8. Полимеразная цепная реакция 42
2.8.1.Амплификация бисульфит-модифицированой геномной ДНК 42
2.8.2.Амплификация бисульфит-модифицированой геномной ДНК с
использованием метил-специфичной количественной ПЦР в реальном
времени 44
2.9. Обработка полученных данных методом статистического анализа...48
2.10. Програмное обеспечение 48
Глава 3. Оценка статуса метилирования промоторной области генов супрессоров опухолевого роста при спорадическом раке молочной железы и яичников 49
Глава 4. Анализ статуса метилирования исследуемых генов в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови . 55
Глава 5. Анализ статуса метилирования исследуемых генов для клеточных видов опухолей молочной железы и яичников 63
Глава 6. Анализ метилированого статуса исследуемых генов в биопсийном материале, полученном от больных раком молочной железы и яичников 68
Глава 7. Статистический apia лиз статуса метилирования исследуемых генов в опухолевых образцах для рака молочной железы и яичников 73
7.1. Сравнительный анализ статуса метилирования исследуемых генов в морфологически нормальных и опухолевых образцах для рака молочной железы и яичников 74
7.2. Расчет диагностической чувствительности и специфичности для каждого исследованного гена при раке молочной железы и яичников 82
Заключение .87
Выводы 89
Список литературы 90
- Эпигеномная теория
- Выделение геномной ДНК из лимфоцитов человеческой крови
- Анализ статуса метилирования исследуемых генов в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови .
- Расчет диагностической чувствительности и специфичности для каждого исследованного гена при раке молочной железы и яичников
Введение к работе
Актуальность работы
Гормонозависимые опухоли, в том числе рак молочной железы и рак яичников, являются одной из главных причин смертности среди женщин от злокачественных новообразований. К сожалению, в последние годы наблюдается значительный рост обоих заболеваний (Семиглазов В.Ф., 2008).
Из 10 млн. новых случаев злокачественных опухолей различных органов, выявляемых в мире, 10% приходится на молочную железу. Если оценивать только женскую популяцию, удельный вес рака молочной железы возрастает до 22%. В промышленно развитых странах удельный вес злокачественных новообразований молочной железы еще выше - 27%. В Российской Федерации ежегодно выявляется около 47 тыс. новых случаев этого заболевания (Семиглазов В.Ф., 2008).
В то же время рак яичников занимает 3 место в структуре заболеваемости женских половых органов по России. При этом смертность от этого заболевания находится на первом месте и составляет 43,1 % от общего числа умерших от злокачественных новообразований женских половых органов (Медик В.А. с соавт., 2001).
Скрытое течение обоих заболеваний и трудности в диагностике приводят к тому, что до 80% случаев выявляются на поздних стадиях, а смертность от них стойко опережает смертность от рака тела и шейки матки вместе взятых (Мерабишвили В.М. с соавт., 2001).
Надежды сократить число смертей от данных заболеваний основаны на раннем выявлении патологии, точности прогноза и эффективном лечении болезни в ее начальной стадии. В связи с этим очевидна необходимость поиска и внедрения в клиническую практику новых методов, которые сделают возможным определение злокачественных новообразований на ранних стадиях развития.
Известно, что одной из важнейших причин перерождения нормальной клетки в неопластическую является нарушение функционирования генов-супрессоров опухолевого роста. Изменения в работе этих генов приводят к возникновению и прогрессии развития рака, а восстановление функции - к существеїшому замедлению пролиферации опухолевых клеток. Исследования последнего десятилетия показали, что наряду с генетическими событиями, обуславливающими инактивацию клеточных генов вследствие структурных изменений в ДНК, важную роль в процессе канцерогенеза играют также эпигенетические явления, не затрагивающие первичную структуру ДНК, но влияющие на экспрессию генов (Jones et al., 2002). Одним из таких эпигенетических изменений является локальное гиперметилирование специфических последовательностей - CpG-островков, расположенных в 5'-регуляторных районах многих генов, которое влечет за собой подавление экспрессии гена либо в результате прямого ингибирования связывания транскрипционных факторов с ДНК, либо в результате привлечения корепрессоров транскрипции (Klose et al., 2006). До сих пор
остается открытым вопрос о механизмах инициации гиперметилирования CpG-островков в процессе образования опухоли.
На данный момент известен ряд генов-супрессоров опухолевого роста, экспрессия которых нарушена вследствие гиперметилирования их CpG-островков и выявлена их ассоциация с различными видами опухолей (Esteller et al., 2002). В настоящее время все более актуальным становится поиск новых, ранее не изученных генов-супрессоров опухолевого роста, метилирование которых специфично для опухолей определенных видов, т.к. результаты подобных исследований открывают новые возможности как для изучения механизмов канцерогенеза, так и для разработки методов диагностики, мониторинга, прогноза и терапии опухолей.
Тема диссертации является составной частью плана научно-исследовательской работы Волгоградского государственного медицинского университета и утверждена на заседании Ученого совета Волгоградского государственного медицинского университета (протокол № 9 от «16» мая 2007г.)
Цель исследования:
Целью данного исследования является анализ метилированого статуса генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста, которые могут являться потенциальными маркерами опухолей молочной железы и яичников.
Задачи исследования:
-
Подбор для исследования генов-супрессоров опухолевого роста, а также новых кандидатов в гены-супрессоры опухолевого роста путем скрининга существующих библиотек генов и научных статей, принимая за критерий отбора снижение или полное отсутствие экспрессии этих генов при опухолях молочной железы и яичников.
-
Анализ статуса метилирования отобранных генов в морфологически нормальных тканях, первичных опухолях и клеточных линиях карцином молочной железы и яичников.
-
Отбор генов, инактивированных в опухолях в результате метилирования, ко в тоже время не метилированных в морфологически нормальных тканях молочной железы и лимфоцитах человеческой крови.
-
Определение диагностической чувствительности и специфичности маркеров метилирования при анализе биопсийного материала карцином молочной железы и яичников.
-
Создание диагностических панелей из отобранных генов для анализа биопсийного материала, полученного от пациентов с опухолями молочной железы и яичников.
Научная новизна работы
В результате работы с научной литературой, для оценки статуса метилирования промоторной области генов супрессоров опухолевого роста
при спорадическом раке молочной железы и яичников были отобраны 12 генов. Все гены имеют в составе своих промоторов CpG-островки и транскрипционно активны в клетках морфологически нормальной молочной железы и поверхностном эпителии яичников.
При анализе статуса метилирования CpG-островков двенадцати отобранных генов в клеточных линиях рака молочной железы и яичников, а также морфологически нормальной ткани молочной железы и лимфоцитах человеческой крови, было показано, что гены RASSF1A, Р16, RAR|3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML и DKK1 метилированы в клеточных линиях, но не метилированы в норме.
Был проведен статистический анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в нормальных и клинических образцах рака молочной железы и яичников различных стадий. Результат наличия метилирования в клинических образцах и его отсутствие в нормальных образцах делает возможным использование генов RASSF1A, Р16, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, BRCA1, OPCML и DKK1 в лабораторной диагностике рака молочной железы и яичников.
Практическая ценность работы
В результате проведенных исследований было показано, что комбинация генов RASSFA1, HIN1, MAL позволяет диагностировать опухоль молочной железы с чувствительностью 98%, а комбинация генов BRCA1, MAL, DKK1 - злокачественную опухоль яичников с чувствительностью 94%. Полученные данные являются экспериментальным обоснованием для разработки скрининговых тест-систем с целью диагностики рака молочной железы и яичников. Использование таких систем может послужить основой для разработки нового молекулярно-биологического метода диагностики.
Материалы исследования таюке представляют интерес для получения новых дополнительных знаний об участии генов супрессоров опухолевого роста в процессе канцерогенеза, а также расширения понимания роли эпигенетических факторов в регуляции экспрессии этих генов при злокачественной трансформации клетки.
Реализация результатов исследования
Панели метилированных генов, составленные в результате проведенного исследования, используются в научной лаборатории ракового центра Фокс Чейз (Филадельфия, США) при анализе клинических образцов для изучения функционирования этих генов при раке молочной железы и яичников, а также внедрены в практику работы Волгоградского Областного Клинического Онкологического диспансера.
Результаты исследования, отражающие молекулярные механизмы канцерогенеза и иллюстрирующие новые подходы к диагностике
онкологических заболеваний, включены в лекционные курсы по молекулярной биологии, медицинской генетике и клинической биохимии Волгоградского государственного медицинского университета.
Основные положения, выносимые на защиту.
-
Гены RASSF1A, Р16, RARJ3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL метилированы в клеточных линиях рака молочной железы, но не метилированы в морфологически нормальных тканях молочной железы.
-
Установлено наличие метилирования генов RASSF1A, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF и MAL в образцах карцином молочной железы всех стадий.
-
Гены MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 метилированы в клеточных линиях карцином яичников, но не метилированы во всех образцах лимфоцитов крови, полученных от людей без онкологических заболеваний.
-
Выявлено наличие метилирования генов MAL, OPCML, HIN1, BRCA1 и DKK1 в образцах карцином яичников всех стадий.
-
Диагностическая чувствительность панели генов (RASSF1A, MAL, HIN1) для выявления рака молочной железы составляет 98%, а при раке яичников она достигает 94% в случае одновременного определения статуса метилирования комбинации генов MAL, DKK1, BRCA1.
Публикации и апробация работы
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 статьи в реферируемых журналах.
Основные результаты работы докладывались на международных конференциях: «97th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (Washington, DC, USA, April 1-5, 2006); «15th SPORE meeting National Institutes of Health (Baltimore, MD,USA, 2007); «99th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research» (San Diego, CA, USA April 12-16, 2008); XLVI международная научная студенческая конференция "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 2008).
Диссертация обсуждена на совместном заседании кафедр теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, молекулярной биологии и генетики, биологии, патологической анатомии с участием НИИ фармакологии, ФГУЗ НИПЧИ (6 мая 2009 года, протокол № 14).
Структура и объем диссертации
Диссертационная работа изложена на 103 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, главы, посвященной описанию материалов и методов, 5 глав - результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список использованной литературы включает 144
источника, из них 24 источника отечественных авторов и 120 зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 13 рисунками.
Эпигеномная теория
В настоящее время общепринятой является концепция о том, что рак является генетической болезнью, в основе которой лежат изменения в геноме клетки. В подавляющем большинстве случаев злокачественные новообразования развиваются из одной опухолевой клетки, то есть имеют моноклональное происхождение. Исходя из мутационной теории, "рак возникает вследствие накопления мутаций в специфических участках клеточной ДНК, приводящих к образованию дефектных белков " (Гиббс У., 2003).
Прямым доказательством мутационной природы рака можно считать открытие протоонкогенов и генов-супрессоров, изменение структуры и экспрессии которых за счёт различных мутационных событий, в том числе и точковых мутаций, приводит к злокачественной трансформации.
Открытие клеточных протоонкогенов впервые было осуществлено с помощью высокоонкогенных РНК-содержащих вирусов (ретровирусов), несущих в составе своего генома трансформирующие гены (Абелев Г. И., 1998). Молекулярно-биологическими методами было установлено, что ДНК нормальных клеток различных видов эукариот содержит последовательности, гомологичные вирусным онкогенам, которые получили название протоонкогенов. Превращение клеточных протоонкогенов в онкогены может происходить в результате мутаций кодирующей последовательности протоонкогена, что приведет к образованию изменённого белкового продукта, или в результате повышения уровня экспрессии протоонкогена, вследствие чего в клетке увеличивается количество белка. Протоонкогены, являясь нормальными клеточными генами, обладают высокой эволюционной консервативностью, что указывает на их участие в жизненно важных клеточных функциях (Новик А. А., Камилова Т. А., 2001).
Точковые мутации, приводящие к превращению протоонкогенов в онкогены, изучены в основном на примере активации протоокогенов семейства "ras ". Эти гены, впервые клонированные из опухолевых клеток человека при раке мочевого пузыря, играют важную роль в регуляции пролиферации клеток как в норме, так и при патологии. Гены семейства "ras " представляют собой группу протоонкогенов, наиболее часто активирующихся при опухолевом перерождении клеток. Мутации одного из генов HRAS, KRAS2 или NRAS обнаруживают примерно в 15 % случаев злокачественных новообразований у человека. У 30 % клеток аденокарцином лёгкого и у 80 % клеток опухолей поджелудочной железы обнаруживается мутация в онкогене "ras ", что ассоциируется с плохим прогнозом протекания заболевания (Райе Р. X., Гуляева Л. Ф., 2003).
Одной из двух горячих точек, мутации в которых приводят к онкогенной активации, является 12-й кодон. В экспериментах по направленному мутагенезу было показано, что замена в 12-м кодоне глицина на любую аминокислоту, за исключением пролина, приводит к появлению у гена трансформирующей способности. Вторая критическая область локализуется вокруг 61-го ко дона. Замена глутамина в положении 61 на любую аминокислоту, кроме пролина и глутаминовой кислоты, также приводит к онкогенной активации (Баранов B.C. и соав., 2000).
Антионкогены, или гены-супрессоры опухолей, — это гены, наличие продукта которых подавляют образование опухоли. В 80-90-х годах обнаружены клеточные гены, осуществляющие негативный контроль клеточной пролиферации, то есть препятствующие вступлению клеток в деление и выходу из дифференцированного состояния. Утрата функции этих антионкогенов вызывает неконтролируемую клеточную пролиферацию. Благодаря своему противоположному по отношению к онкогенам функциональному назначению они были названы антионкогенами или генами-супрессорами злокачественности. В отличие от онкогенов, мутантные аллели генов-супрессоров рецессивны. Отсутствие одного из них, при условии, что второй нормален, не приводит к снятию ингибирования образования опухоли (Свердлов Е. Д., 1999).
Таким образом, протоонкогены и гены-супрессоры образуют сложную систему позитивно-негативного контроля клеточной пролиферации и дифференцировки, а злокачественная трансформация реализуется через нарушение этой системы (Жимулев И.Ф., 2007).
Выделение геномной ДНК из лимфоцитов человеческой крови
Для анализа метилированого статуса исследуемых генов использовались клеточные линии опухолей молочной железы и яичников. В работе с генами предположительно метилироваными при злокачественных новообразованиях молочной железы проводился анализ пяти следующих клеточных линий опухолей молочной железы:МОА231, MDA435, MCF7, T47D, HS-578T. При анализе генов предположительно метилированых при раке яичников работа велась на пяти следующих клеточных линиях опухолей яичников: А2780, SKOV3, OVCAR10, OVCAR5, OVCAR3. В качестве отрицательного контроля была использована ДНК, выделенная из нормальных тканей молочной железы и поверхностного(внешнего) эпителия яичников, а так же ДНК нормальных лимфоцитов человеческой крови. Все клеточные линии, образцы нормальных тканей и лимфоциты человеческой крови были предоставлены Филадельфийским научно-исследовательским центром.
Клеточные линии выращивали в соответсвие со стандартными условиями характерными для каждой линии в отдельности. Клетки обрабатывали 0.25% трипсином (Invitrogen) на 10см чашках, отмывали 1х РВС (Bio Rad) и оставляли инкубироваться на ночь при +37С с протеиназой K(10ug/ml, Invitrogen) и 10% раствором SDS (Invitrogen). Выделение геномной ДНК проводили смесью фенол/хлороформа по методу (Blin N, Stafford DW. 1976). Выделенную из клеток геномную ДНК хранили при -20С с ТЕ буфером (ЮшМ TrisHCl рН= 7.4, lmM EDTA, 100ml ddH20). 2.4. Выделение геномной ДНК из нормальной сыворотки крови.
Сыворотку крови полученную из банка крови, транспортировали и хранили при -80С до момента выделения ДНК. Выделение геномной ДНК проводили смесью фенол/хдороформа по методу (Blin N, Stafford DW. 1976) после ночной инкубации при +37С с применением протеиназы К (lOug/ml, Invitrogen) и 10% раствора SDS (Invitrogen). Выделенную геномную ДНК нормальной сыворотки крови хранили при -20С в ТЕ буфере (lOmM TrisHCl рН= 7.4, lmM EDTA, 100ml ddH20).
Замороженные образцы тканей доставляли из банка тканей и хранили при -80С до момента использования. Небольшая часть от исследуемого опухолевого или нормального образца отдавалась паталогоанатомам для приготовления микропрепарата с целью подтверждения наличия определенного вида опухоли или отсутствия таковой в данном образце. Только после получения заключения от паталогоанатома о качестве образца, проводилось выделение геномной ДНК. Перед выделением ДНК образец предварительно подвергался микродессекции (10 х 6 цт) для более успешного прохождения протеолиза ткани.
Выделение ДНК проводили с использованием фенол/хлороформа по методу (Blin N., Stafford D.W., 1976) с использованием протеиназы К (10ug/ml, Invitrogen) и 10% раствора SDS (Invitrogen).
Геномную ДНК выделенную из тканей хранили при -20С с ТЕ буфером (ЮтМ TrisHCl рН= 7.4, lmM EDTA, 100ml ddH20). 2.6. Выделение геномной ДНК из тканевых срезов, фиксированных в парафине.
Некоторые исследуемые образцы полученные из банка тканей были фиксированы в парафине. Такие образцы предварительно подготавливали к выделению ДНК. Подготовка заключалась в микродессекции (10 х 6 um) тканей с последующей депарафинизацией. Депарафинизацию проводили с использованием 99% раствора ксилена (Invitrogen), при +25С. Полученные после депарафинизации осадки, содержащие ДНК, отмывали в 96% растворе этанола (Invitrogen).
Образцы инкубировали в течении двух дней при +37С с использованием протеиназы К (lOug/ml, Invitrogen) и 10% раствора SDS (Invitrogen).
Дальнейшее выделение геномной ДНК происходило стандартным методом (Blin N., Stafford D.W., 1976) с использованием фенол/хлороформа.
Геномную ДНК выделенную из парафинизированных тканей хранили при -20С с ТЕ буфером (ЮшМ TrisHCl рН= 7.4, ImM EDTA, 100ml ddH20).
Анализ статуса метилирования исследуемых генов в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови .
Используя калибровочные кривые определяли количетсво копий метилированой ДНК в исследуемом образце для каждого анализируемого гена. Значения получали по данным зарегистрированным прибором, измеряющим количество единиц флуоресцентного сигнала в каждом цикле амплификации и сравнении их со значениями флуоресцентных сигналов в контролях-калибраторах с известной нам концентрацией, нанесенных на графике.
Затем определяли процент метилирования гена в каждом образце, для этого полученные значения количества копий метилированой ДНК для каждого исследуемого гена соотносили с количетсвом копий ДНК полученных для pactin. Ген (3actin использовался в качестве внутреннего контроля и количетсво его копий принималось за 100% в каждом отдельном случае. Расчет проводился по следующей фрмуле: %М= кол-во копий ДНК исслед. гена/кол-во копий ДНК Pactin х 100%, где %М-процент метилирования гена в каждом образце. Полученный результат подвергали логарифмическому преобразованию по формуле Ln(%M+l).
Результаты математических расчетов, представленны в виде функции Ln и приведены в таблицах П.1.1,ПЛ.2,П.1.3,П.1.4,П.1.5 приложения 1.
Данные приведенные в таблицах свидетельствуют о том, что количество копий метилированой ДНК, в каждом проанализированом образце, для всех генов равно «0». Следовательно промоторные области исследуемых генов оказались не митилированы во всех двенадцати образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и десяти образцах лимфоцитов человеческой крови, что подтверждает результаты полученные методом секвенирования.
Большая часть CpG-островков в отличие от одиночных CpG-динуклеотидов не метилированы в нормальных клетках. Однако из этого правила есть исключения, небольшая часть CpG-островков метилирована в нормальных клетках. Гиперметилирование промоторных районов генов в нормальных клетках выполняет специфические функции, связанные с аллель-специфической экспрессией генов (импринтинг, инактивация хромосомы X), с подавлением экспрессии некоторых тканеспецифических генов, а также транспозонов ( Futscher et al, 2002). Гиперметилирование некоторых генов, обычно неметилированных, наблюдается также в нормальных клетках при старении ( Ahuja et al, 1998).
В свою очередь гены супрессоры опухолевого роста, гиперметилированые при различных видах опухолей, в том числе и при опухолях молочной железы и яичников, отличаются обязательным отсутствием метилирования в нормальных тканях (Lehmann U. et. al., 2002).
Таким образом, отсутствие метилирования промоторных областей генов RASSF1A, Р16, RARp\ АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML, DKK1, BRCA1 в образцах морфологически нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови является важным результатом и позволяет сделать вывод о нормальном функционировании этих генов в исследуемых тканях.
После того как мы убедились, что все отобранные гены оказались не метилированы в образцах нормальных тканей молочной железы и лимфоцитах человеческой крови, представляется целесообразным продолжить анализ метилированого статуса исследуемых генов для клеточных видов опухолей молочной железы и яичников.
Клеточные линии опухолей молочной железы и яичников являются удобной моделью для анализа статуса метилирования генов. Они легко растут в искусственных условиях и при этом представляют собой доступное и вполне достаточное количество генетического материала для исследования. В тоже время клеточные линии генетически и фенотипически стабильны. Кроме того, родоночальником клеточных линий использованных в нашей работе -служат клетки опухоли молочной железы и яичников выделенные из организма больного. Таким образом, если промоторные области анализируемых генов окажутся метилированы хотя бы для одной клеточной линии опухолей молочной железы и яичников, это позволит сделать предположение о возможном присутствии такого в биопсийном материале. Работа проводилась в два этапа. На первом этапе был проведен анализ статуса метилирования генов RASSF1A, Р16, RARJ3, АРС, GSTP1, НШ1, NTRK2, CTGF, и MAL для пяти клеточных линий опухолей молочной железы:МБА231, MDA435, MCF7, T47D, HS-578T. Второй этап заключался в проведении анализа статуса метилирования генов OPCML, MAL, НШ1, DKK1 и BRCA1 для пяти клеточных линий опухолей яичников А2780, SKOV3, OVCAR10, OVCAR5, OVCAR3. Для проведения анализа на обоих этапах, из всех клеточных линий была выделена геномная ДНК. Выделенную геномную ДНК подвергали бисульфитной модификации и при помощи праймеров приведенных в таблице 1, ставили бисульфитную ПЦР для каждого из исследуемых генов.
Продукты полученные в результате бисульфитной ПЦР подвергали секвенированию прямым праймером специфичным для каждого гена. На рисунке 9 в качестве примера приведен результат сиквенса ДНК клеточной линии молочной железы MCF7 для гена RASSF1А и клеточной линии яичников OVCAR10 для гена HIN1.
Расчет диагностической чувствительности и специфичности для каждого исследованного гена при раке молочной железы и яичников
В случае генов RASSFIA, RARp1, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, и MAL математическое ожидание р было 0.05, тогда как для гена Р16 математическое ожидание р было 0.05
Так же было обнаружено значимое отличие между статусом метилирования генов RASSFIA, MAL и АРС в образцах карцином молочной железы ранней стадии развития и нормальных тканях. В случае генов RASSFIA, MAL и АРС математическое ожидание р было 0.05, тогда как для генов RARp, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, и Р16 математическое ожидание р было 0.05 (заданного уровня значимости Кобзарь А. И., 2006).
При раке яичников в результате обсчета данных по t тесту было выявлено существенное отличие между статусом метилирования генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 в образцах карцином поздней стадии и нормальных лимфоцитах крови. Для всех генов математическое ожидание р было 0.05.
При этом наблюдалось значимое отличие между статусом метилирования генов OPCML, MAL, HIN1, и DKK1 в образцах карцином ранней стадии развития и нормальных лимфоцитах крови. В случае генов OPCML, MAL, HIN1 и DKK1 математическое ожидание р было 0.05, тогда как для гена BRCA1 математическое ожидание р было 0.05 (заданного уровня значимости, Кобзарь А. И., 2006).
Таким образом представляется возможным заключить, что промоторные области генов RASSFIA, RARp, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, и MAL за исключением гена Р16 метилированы при злокачественых новообразованиях молочной железы. При этом для генов RASSFIA, MAL и АРС удается зафиксировать метилирование на достаточно ранних стадиях развития рака молочной железы. Промоторные области генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 метилированы при злокачественых новообразованиях яичников. При этом для генов OPCML, MAL, HIN1 и DKK1 удается зафиксировать метилирование на достаточно ранних стадиях развития рака яичников.
Интересным представляется результат сравнительного анализа выявивший существенное отличие между статусом метилирования генов RASSF1A, RARp\ АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, MAL, OPCML, DKK1 и BRCA1 в образцах карцином молочной железы, яичников и морфологически нормальных тканях молочной железы, а так же лимфоцитах человеческой крови. Данный результат свидетельствует о нарушении закономерности метилирования в клетках, которое часто наблюдается при злокачественных новообразованиях (Robertson et al, 2000; Jones et al, 2002).
Так же интересен факт обнаружения значимого отличия между статусом метилирования генов RASSF1A, MAL, АРС, OPCML, HIN1, и DKK1 в образцах карцином молочной железы, яичников ранней .стадии развития и морфологически нормальных тканях молочной железы, а так же лифоцитах человеческой крови. Данный факт подтверждает предположение о том, что метилирование генов - супрессоров может происходить на достаточно ранних стадиях неопластического процесса (Feinberg, А. Р., Туско, В., 2004). Для гена - супрессора Р16 было показано отсутсвие экспрессии связанное с метилированием промоторной зоны этого гена для преинвазивной стадии рака легких и прямой кишки (Belinsky, S. A. et al., 1998., Nuovo, G. J. et al., 1999). Потеря эксперссии гена - супрессора GSTP1, связанная с метилированием промоторной области, была показана для преинвазивной стадии рака простаты (Nelson, W. G. et al., 2003). 7.2. Расчет диагностической чувствительности и специфичности для каждого исследованного гена при раке молочной железы яичников.
Для расчета диагностической чувствительности всех генов применяли точный критерий Фишера. Расчет проводили при помощи программы Statsoft6.
Результаты расчетов диагностической чувствительности для генов RASSF1A, RARJ3, АРС, GSTP1, HIN1, NTRK2, Р16, CTGF, и MAL, использованных при анализе биопсийного материала пациентов больных раком молочной железы, представлены в виде графика на рисунке 12. 100 Н пациентов, у которых было обнаружено метилирование reHOBiRASSFIA, GSTP1, HIN1, NTRK2, CTGF, Р16, MAL, АРС и RAR(3 для всех образцов карцином молочной железы, а так же карцином молочной железы ранней стадии (группа 1) и карцином молочной железы, находящихся на более поздних стадиях развития (группа 2), расположен на интервальных линиях в виде геометрических фигур (сфера, квадрат).
По результатам статистического анализа высокой чувствительностью обладают следующие гены: RASSF1A- 68%, HINl-55%, CTGF-39%, MAL-91%, АРС-52%, RARP-45%. Гены GSTP1, NTRK2 и Р16 имеют низкую чувствительность 30%, 27% и 9% соответственно.
Хотелось бы отметить, что гены RASSF1A, HIN1, MAL, АРС и RARP имеют высокую чувствительность при анализе образцов карцином молочной железы ранней стадии. Для гена RASSF1A чувствительность составила-91%, для гена HINl-55%, для гена MAL-91%, для гена АРС-64%, для гена RARp-45%.
Так как в нашем случае не было обнаружено метилирование ни в одном образце морфологически нормальной ткани молочной железы, специфичность составила 100%, прогноз для всей группы составил не менее 92% с вероятностью 95%.
Результаты расчетов диагностической чувствительности для генов OPCML, MAL, HIN1, DKK1 и BRCA1 использованных при анализе биопсийного материала пациентов больных раком яичников, представлены в виде графика на рисунке 13.
