Содержание к диссертации
Глава!. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ1. Современная классификация и таксономия лептоспир
2. Экология лептоспир
3. Строение генома лептоспир
4. Строение клеточной стенки и наружной мембраны лептоспир
5. Липопротеины наружной мембраны лептоспир .*
5.1. Основной белок наружной мембраны лептоспир — LipL
5.2. LipL
5.3.LipL
6. Методы лабораторной диагностики лептоспирозов
6.1. Применение ПЦР в диагностике лептоспирозов
7. Методы дифференциации патогенных лептоспир от сапрофитов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы микроорганизмов, препараты ДНК
2.1.2.Модельные образцы для определения чувствительности ПЦР тестсистемы
2.1.3.Клинический материал
2.2. Методы
2.2.1. Культивирование лептоспир
2.2.2. Определение концентрации лептоспир в счетной камере ПетроваХауссера
2.2.3.Техника постановки реакции микроагглютинации (РМА) при лептоспирозах
2.2.4. Полимеразная цепная реакция
2.2.4.1. Подготовка проб для ПЦР-анализа чистых культур
2.2.4.2. Приготовление модельных образцов для ПЦР-анализа
2.2.4.3. Приготовление и обработка проб для модельных систем
2.2.4.4. Приготовление суспензий из органов лабораторных животных
2.2.4.5. Подготовка образцов для ПЦР-анализа
2.2.5. Праймеры для ПЦР
2.2.6. Условия проведения ПЦР и регистрация результатов
2.2.7. Определение аналитической чувствительности ПЦР тест - системы
2.2.8. Условия проведения nested- ПЦР
2.2.9.Статистическая обработка результатов
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР LipL
3.1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров
3.2. Результаты исследования с праймерами, Lep640up/ Lep894_low и Lep476_up/Lep640_Iow f. Глава 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСГИР LipL
4.1. Олигонуклеотидные последовательности праймеров
4.2. Подбор оптимальных условий проведений ПЦР с праймерами LEP21/LEP
4.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
4.4. Определение специфичности тест системы с использованием праймеров LEP21 иЬЕР
4.5. Определение аналитической чувствительности тест-системы * 4.6. Результаты ПЦР с использованием праймеров LEP2-351 и LEP * 4.6.1. Специфичность тест системы с использованием праймеров LEP2-351 и
4.6.2.0пределение аналитической чувствительности тест-системы
4.6.3. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
4.7. Nested - вариант ПЦР тест-системы
4.7.1. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
4.7.2.Специфичность тест системы
4.7.3. Определение аналитической чувствительности тест-системы
4.8.Определение распространенности гена, кодирующего Lipl32, у представителей различных таксономических групп
Глава 5. ИССЛЕДОВАНИЕ МОДЕЛЫ1ЫХ СИСТЕМ И КЛИНИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ НА ОСНОВЕ ГЕНА, КОДР1РУЮЩЕГО ЛИПОПРОТЕИН НАРУЖНОЙ МЕМБРАНЫ ЛЕПТОСПИР LipL
5.1. Модельные образцы
5.1.1.Специфичность тест-системы
5.1.2. Определение размера амплифицированного фрагмента ДНК
5.1.3. Определение аналитической чувствительности
5.2. Исследование клинических образцов (сыворотки)
5.2.1.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в 2002г
5.2.2.Исследование сывороток крови больных во время вспышки лептоспироза в Краснодарском крае в 2003г
Введение к работе
Лептоспирозы — группа нетрансмиссивных природно-очаговых инфекций, занимающая первое место в мире среди зоонозов по широте распространения природных и антропургических очагов [96]. Массовость заболеваний среди населения характерная для одних этиологических форм (Pomona, Grippotyphosa); тяжелое течение с высокой летальностью, отличаюш,ее другие (Icterohaemorrhagiae и Canicola), ставят эти инфекции в один ряд с особо опасными [19].
По ориентировочным оценкам международных экспертов ежегодно в мире более 100000 людей заболевают тяжелыми формами лептоспирозов, требуюш,их госпитализации' [96]. Однако значительная часть случаев официально не регистрируется или проходит под другими диагнозами ввиду сложности клинической диагностики и ее лабораторного подтверждения.
По этой причине лептоспирозы отнесены к группе так называемых «пренебрегаемых» (neglected) инфекций.
В Российской Федерации лептоспирозы также относятся к числу широко распространенных природно-очаговых инфекций человека, что обусловлено наличием почти на всех территориях, как в сельской местности, так и в городах, природных и хозяйственных очагов. Им принадлежит одно из первых мест среди зоонозов по тяжести клинического течения и частоте летальных исходов. При средних показателях летальности в Российской Федерации 3 - 4,5% на отдельных территориях эндемичных по лептоспирозам Icterohaemorrhagiae и Canicola, они достигают 20% и более Убиквитарное распространение лептоспирозов в мире обусловлено широким спектром резервуарных хозяев патогенных лептоспир и восприимчивых к ним видов животных, равно как и высокой степенью биоразнообразия возбудителей - антигенного, экологического и генетического [42, 4, 159].
По данным современной филогенетики лептоспиры относятся к древнейшим эубактериям, находящимся в прикорневой развилке эволюцинных путей [72]. В пределах этого семейства имеются представители разнообразных экологических групп: свободноживущие непатогенные, включая галофилы, и патогенные - возбудители лептоспирозов людей и животных. Последние также отличаются по хозяинной и органной специфичности, способности к существованию во внешней среде и другим признакам, значимым в клинико-эпидемиологическом контексте.
Высказывалось мнение о принадлежности всех патогенных лептоспир [40,
20] или их отдельных представителей, например, grippotyphosa, к возбудителям сапронозов [4].
В течение многих десятилетий в пределах рода Leptospira выделяли два вида - Leptospira interrogans (паразитические) и Leptospira biflexa
(свободноживущие), дифференцируемые на основе некоторых не вполне достоверных фенотипических признаков (патогенности для лабораторных животных и культурально-биохимических тестов).
Современная видовая дифференциация лептоспир основана на концепции определения вида у бактерий, в соответствии с которой в один вид объединяются штаммы с ДНК-ДНК гомологией 70% и выше и более 98,
7% гомологии 16S рРРЖ [159, 153]. На ее основе в начале 90-х гг.
зарубежными лептоспирологами была разработана, а впоследствии утверждена Международным подкомитетом по таксономии лептоспир (1991,
Осака), альтернативная система их видовой дифференциации, в соответствии с которой выделено 17 геномных видов.
Однако при генотипировании значительного числа штаммов (более 300) в ряде случаев к одному виду относили как патогенные; так и свободноживущие лептоспиры, а практически идентичные по фенотипу штаммы - к различным видам. Сапрофитические лептоспиры - контаминанты питательных сред, «изолированные» от людей и животных в результате технических ошибок (Turneria parva, L.inadai и пр.), причислялись к новым родам и видам патогенных лептоспир [71] или к штаммам с неясным таксономическим статусом - status insertae sedis [96].
Очевидно, что включение последних в панели эталонов для реакции микроагглютинации (РМА - «золотой стандарт») значительно снижает достоверность лабораторной диагностики лептоспирозов людей и животных.
Таким образом, новый подход к классификации и таксономии, основанный на произвольных количественных критериях, не подкрепленных фенотипическими и экологическими характеристиками таксонов, поставил и новую проблему - разработку надежных методов генетической демаркации основных экологических групп лептоспир.
В последние годы в практику молекулярно-генетических научных и диагностических исследований вошел метод секвенирования ДНК для ряда бактерий, в том числе и лептоспир [128, 118, 122],секвенированы полные геномы. Знание полногеномных последовательностей и информативность их сравнительного анализа позволяет найти новые подходы к решению многих проблем обш;ей и медицинской микробиологии, а так же выявлять частные особенности геномов отдельных микроорганизмов, например, связанных с патогенностью и др.
Однако получение исчерпывающей информации о вариабельности геномов, которая необходима для однозначной идентификации не просто видов, а штаммов и изолятов бактерий, с помощью прямого секвенирования практически нереальна из-за чрезвычайной вариабельности микроорганизмов и наличии генов, функции которых неизвестны. Кроме того, наличие сиквенсов полных геномов в ряде случаев является, как бы «избыточной информацией» в научной и практической работе, например, при анализе определенных генов и диагностике возбудителей инфекций. Поэтому встает вопрос о развитии «несеквенирующих» методов анализа геномов, в которых можно использовать уже секвенированные геномы в качестве стандартного сравнения [1].
Использованиме метода мультилокусного секвенирования - типирования^ (МЛСТ или MLST) требует подбора маркерных генов. Для многих микроорганизмов, в том числе и для лептоспир, не существует рекомендаций, какие гены можно использовать в качестве маркерных.
Представляется целесообразным анализ возможности применния генов белков внешней мембраны в качестве маркерных, так как поверхностная структура бактериальной клетки по своей локализации занимает пограничное положение (interface) между клеткой и окружающей средой. Для многих грамотрицательных бактерий показана ведущая роль полиморфизма белков внешней мембраны в обеспечении патогенности и других свойств.
К моменту начала наших исследований у патогенных лептоспир были обнаружены белки наружной мембраны с различным уровнем экспрессии in vitro и in vivo, отсутствующие у сапрофитов [84, 83, 136]. Последнее дало основание предположить их важную роль в этиопатогенезе лептоспирозной инфекции. Особый интерес, с точки зрения разработки генетической дифференциации лептоспир различных экологических групп, представляет липопротеин LipL32 - основной белок наружной мембраны, демонстрирующий высокую степень экспрессии в организме инфицированного хозяина [117] и in vitro [83]. Установлена также его иммуногенность и связь с продукцией гемолизина — одного из факторов патогенности лептоспир [107].
Исходя из изложенного, основной целью нашей работы стала: Разработка метода дифференциации свободноживущих и паразитических лептоспир на основе детекции генов, кодирующих синтез липопротеинов внешней мембраны.
В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие Задачи исследования^
1. На основе нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих липопротеины внешней мембраны LipL32 и LipL41, разработать тестсистемы ПЦР для индикации лептоспир.
2. Изучить распространенность гена lipL32 в геноме лептоспир различных таксонов, выделенных (1915-2004 гг.) от людей и животных и из объектов окружающей среды в различных географических регионах
3. На основании полученных данных провести анализ современных таксономических схем лептоспир.
4. На модельных системах (биологический материал от людей и экспериментальных животных, вода, почва) изучить возможность применения разработанной тест-системы для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды, а также в организме людей и животных,
5. Оценить параметры диагностической эффективности ПЦР тест-системы на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32, на клиническом материале, полученном в очагах лептоспирозной инфекции.
Научная новизна Впервые на репрезентативной выборке штаммов (90 в их числе 68 паразитических и 22 сапрофитных) различных надвидовых и подвидовых таксонов, изучена распространенность гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32. С этой целью на основе нуклеотидных последовательностей фрагментов гена (размером 677 и 204 П.Н.), кодирующего синтез липопротеина LipL32 - основного белка наружной мембраны - разработана ПЦР тест-система (в том числе nested-вариант).
В результате исследования «исторической» коллекции типовых и полевых штаммов, отличавшихся по месту, времени и источнику выделения, установлено, что ген, кодирующий синтез липопротеина LipL32, представлен в ДНК патогенных лептоспир всех известных геномовидов, в том числе отнесенных к возбудителям сапронозов (L.kirschneri, серовар grippotyphosa).
Указанные фрагменты не определялись в ДНК лептоспир-сапрофитов {L.biflexa, L.wolbachii и др.), равно как и у ряда штаммов с неопределенным таксономическим статусом — species insertae sedis.
Таким образом, показано, что lipL32 характеризутся высокой консервативностью среди паразитических лептоспир, включая возбудителей сапронозов. Детекция гена, кодирующего липопротеин LipL32, может быть рекомендована для дифференциации основных экологических групп лептоспир в таксономических целях.
Фрагмент гена (164 п.н.), кодирующего липопротеин наружной мембраны LipL41, определялся в Д1Ж как паразитических, так и свободноживущих лептоспир. При этом в отличие от паразитических, у сапрофитов, а также штаммов со спорным таксономическим статусом, отмечен значительный полиморфизм длин ампликонов, проявлявшийся в индивидуальном для каждого штамма профиле.
Последнее подтверждает полученные ранее данные о выраженном геномном полиморфизме свободноживущих представителей Leptospiraceae.
Таким образом, нашло подтверждение мнение, основанное на изучении фенотипического профиля, о принадлежности типовых лептоспир родов Leptonema и Turneria и некоторых представителей видов L. inada и L.
meyeri к свободноживущим [104]. Последнее свидетельствует о необходимости ревизии действующей классификации и номенклатуры лептоспир, принятой Международным подкомитетом по таксономии.
Практическая значимость На различных модельных системах (моча, сыворотка крови людей, спинномозговая жидкость, паренхиматозные органы экспериментальных животных, вода, почва) показана возможность применения разработанного "nested''-варианта ПЦР для индикации патогенных лептоспир в объектах внешней среды и биологических образцах.
На клиническом материале, полученном при расследовании вспышек лептоспирозов среди людей на юге России, определены параметры высокой диагностической эффективности "nested" ПЦР - тест-системы, разработанной на основе гена lipL32 .
Таким образом, в перспективе сферами возможного применения ПНР - тест-системы, разработанной на основе гена lipL32, могут стать:
• индикация патогенных лептоспир в объектах окружающей среды и их дифференциация от свободноживущих (в таксономических целях и при эпидемиологическом анализе);
• генодиагностика лептоспирозов людей, вызываемых патогенными лептоспирам всех известных геномовидов, включая эпидемически значимые (Sejroe, Icterohaemorrhagiae) и новые для РФ возбудители (например, серогруппа Australis, серовар muenchen).
Последнее представляется особенно важным в контексте разработки методов контроля и снижения угрозы трансграничного завоза на территорию страны ранее неизвестных эндемичных лептоспир, антигены которых не представлены в отечественных диагностических тест-системах и вакцинных препаратах.
Универсальность разработанной тест-системы, позволяющей выявлять ДНК всех патогенных лептоспир номенвида L.interrogans sensu lato, дает основание рекомендовать испытание тест-системы не только в клинической, но и ветеринарной практике, в том числе для прижизненного контроля животных на лептоспироносительство.
Результаты работы используются при чтении лекций для врачей бактериологов на кафедре инфектологии МПФ ПОО ММА им. И.М. Сеченова.
Публикации
1. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С, Ананьина Ю.В. Генотипирование лептоспир: новые методические подходы. // Материалы конференции «Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций». Москва. - 2004. - 230-
2. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С., Ананьина Ю.В.Изучение полиморфизма генов белков внешней мембраны в разработке схем типирования лептоспир. // Сборник трудов 5-й всероссийской научнопрактической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней. Москва. 2004. - 32-34.
3. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С, Вышивкина Н.В., и др.
Методические подходы к идентификации, лептоспир на. основе полиморфизма генов белков внешней мембраны. // Материалы Южнороссийской научно-практической конференции. Геленджик. 2005. -
4. Земская М:С., Самсонова А.П. Методические^ подходы к разработке системы внутривидового генотипирования лептоспир. // Материалы' I Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье». Суздаль. 2005. - 342-344.
5. Самсонова А.П., Петров Е.М., Земская М.С, Лебедев В.В., Лысенко И.В:, Ананьина Ю.В. Методический подход к генетическому типированию лептоспир на различных таксономических уровнях. // Клиническая лабораторная диагностика. 2005. - №9 - - 38-39.
6. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С, Земская М.С, Ананьина Ю.В. Дифференциация лептоспир различных геномовидов на основе гена, кодирующ,его липопротеин наружной мембраны LipL32. // Материалы российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». Санкт-Петербург. 2006.- С 267-268.
7. Самсонова А.П., Земская М.С, Петров Е.М., Ананьина Ю.В. Полиморфизм генов кодирующих белки наружной мембраны: новые возможности для индикации и дифференциации лептоспир. // Материалы Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней общих для людей и животных». Ульяновск. 2006.- СЛ38 - 142.
8. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С, Земская М.С, Ананьина Ю.В. Распространенность гена, кодирз^ощего липопротеин наружной мембраны LipL32, у лептоспир различных таксонов. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. - №4 — 29-32.
9. Ananyina Yu.V., Petrov Е.М., Samsonova A.P., Zemskaya M.S., Shaginyan LA. Ecological and genetic diversity within the Leptospiraceae family: implication for epidemiology // Molecular Biology of Spirochetes IOS,Press Science series, 2006, p.200-208.
10. Ананьина Ю.В., Самсонова А.П., Петров E.M., Земская М.С. Лептоспирозы в России: проблемы контроля и диагностики. // Материалы Московской международной научно-практической конференции «Диагностика профилактика и лечение лептоспирозов людей и животных», М., 2007, с. 10-11.
11. Земская М.С, Самсонова А.П. индикация лептоспир в объектах окружающей среды на модельных системах с помощью ПЦР — тест-систем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны // Там же,
12. Ананьина Ю.В., Петров Е.М., Самсонова А.П., Земская М.С. Завоз возбудителей лептоспирозов: проблемы контроля и диагностики // Матер.1Х Всероссийского съезда н.-практ. об-ва эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, М., «Санмедиа», 2007, с. 80.
13. Земская М.С, Самсонова А.П. Разработка системы генотипирования лептоспир различных экологических типов на основе детекции гена липопротеина наружной мембраны лептоспир LipL32. Матер. II Всероссийской научно-практической конференции > молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье», Рязань, 2007, с. 50 -51.
14. Самсонова А.П., Петров Е.М., Аляпкина Ю.С, Алексеева Н.В,, Земская М.С, Терехов А.А., Гинцбург А.Л., Ананьина Ю.В. Ген, кодирующий липопротеин внешней мембраны LipL32 как генетическая мишень для разработки схем генотипирования летпоспир// Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. - 2008, №1 — 3-8.
15. Земская М.С, Самсонова А.П. Диагностические возможности ПЦР тестсистем на основе гена, кодирующего липопротеин наружной мембраны лептоспир LipL32. //Тезисы V Конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва. -2008 - 158.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 117 страницах, иллюстрирована И рисунками и 21 таблицами, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы (164 источников, в их числе 46 отечественных и 118 иностранных).
Материалы диссертации доложены:
• на конференции «Современные средства имуунодиагностики, иммуно-и экстренной профилактики актуальных инфекций». Санкт-Петербург, 22- 23 апреля 2004г.
• на I и II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 19-
22мая 2005г., Рязань, 29 мая-2 июня 2007г,)
• на Южнороссийской научно — практической конференции. Геленджик28-29 апреля 2005г
• на Российской научно-практической конференции «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». СанктПетербург, 22-24 марта 2006г.
• на Международной научной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней общих для людей и животных».
Ульяновск, 21-23 июня 2006.
•на Московской международной научно-практичной конференции по лептоспирозу. Москва, 22 апреля 2007.
• на V-й конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины».
Москва, 19-22 мая 2008г.
По результатам исследований опубликовано 15 работ.
