Введение к работе
Актуальность проблемы. Толерантность биопленок условно-патогенных микроорганизмов к воздействию антибактериальных веществ - одна из основных причин снижения эффективностей химиотерапии хронических инфекционных заболеваний и устойчивой контаминации медицинского оборудования [Lappin-Scott et al, 2003; Lens et al, 2003]. Особое внимание уделяют микробиологической коррозии элементов промышленных и водно-технических конструкций. В ряду важнейших факторов экстремальной толерантности биопленок, колонизирующих промышленное оборудование, рассматривают как сложный видовой состав микробиоценоза (разнообразие видов), так и гетерогенность популяций каждого вида (разнообразие фенотипов) [Lappin-Scott et al, 2003]. Последняя проявляется либо в виде различий реакций клеток на изменения среды [Бухарин и др., 2005; Zgur-bertok, 2007], либо в виде результата спонтанного и стимулируемого стрессом мутагенеза [Chopra et al, 2003; Boles et al, 2004]. Подавляющая масса клеток в составе бактериальных сообществ характеризуется чрезвычайно низкими частотами спонтанных мутаций (ЧСМ). Однако в популяции присутствуют клетки с мутаторным фенотипом, т.е. микроорганизмы, ЧСМ которых выше в 10-1000 раз [Drake, 1991]. Адаптивная роль таких бактерий в выработке устойчивости к химиотерапевтическим препаратам подтверждена в ряде исследований [Chao et al, 1983; LeClerc, 1998]. Она реализуется за счет высокой вероятности приобретения необходимых мутаций. При этом клетка приобретает как положительные, так и негативные изменения генов, поэтому выживание бактериальной популяции определяется поддержанием оптимального соотношения частот мутаций [Funchain, 2000; Kuhar, 2001].
Наиболее распространёнными причинами мутаторного фенотипа являются повреждения генов системы репарации ошибочно спаренных оснований (ММР) [Friedberg et al, 1995; LeClerc et al, 1996]. Мутации в этих генах обуславливают увеличение ЧСМ на 2-3 порядка. Недавние исследования популяций Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa выявили высокие проценты слабых мутаторов, с превышением интенсивности мутагенеза в 10-50 раз [Kenna et al, 2007; Turrientes et al, 2010], поднимая вопрос о превалирующей адаптивной роли слабого гипермутагенеза. В настоящее время предполагается, что гены ММР не принимают участия в развитии слабого гипермутагенеза [Kenna et al, 2007; Mena et al, 2008;
4 Oliver et al., 2000]. Однако максимальная изученность генов mufSL в контексте модуляции ЧСМ природных микроорганизмов делает их первыми кандидатами на роль причинных факторов гипермутагенеза.
Цель настоящего исследования - изучение характера и природы гетерогенности популяций природных сапротрофных микроорганизмов по уровню спонтанного мутагенеза.
Основные задачи исследования:
Изоляция и идентификация основных компонентов культивируемой сапротрофной микробиоты гидротехнического комплекса.
Скрининг частоты спонтанных мутантов, активности биопленкообразования и чувствительности компонентов бактериального сообщества к оксидирующим и неоксидирующим биоцидам.
Определение характера взаимосвязи активности биопленкообразования, интенсивности мутагенеза и чувствительности к биоцидам.
Исследование последовательностей генов mutS и mutL в клетках субпопуляций с разным уровнем мутагенеза.
Научная новизна
Впервые изучены уровень мутагенеза и активность биопленкообразования в популяциях микробиоценоза системы плавательных бассейнов. Доказаны стабильность сообщества культивируемых сапротрофных микроорганизмов и изогенное происхождение штаммов в пределах каждого исследованного вида. Экспериментально показана универсальность гетерогенности уровней мутагенеза и высокое содержание слабых и умеренных мутаторов в изогенных природных популяциях Bacillus sp., Acinetobacter sp., Stenotrophomonas sp. и P. aeruginosa. Обнаружена устойчивая дискретная гетерогенность бактерий с обособлением субпопуляций, отличающихся комплексом рассматриваемых признаков: частота мутантов, активность биопленкообразования, скорость роста, подвижность. Впервые показано, что субпопуляция умеренных мутаторов P. aeruginosa характеризуется аномалиями амплификации фрагментов генов ММР. Эти аномалии не стабильны в ряду поколений и исчезают вместе с мутаторным фенотипом. Умеренное повышение частоты мутантов обуславливается изменениями структуры генов mufS и mutL. Таким образом, выявлен механизм гипермутагенеза, занимающий промежуточное
5 положение между наследственным и временным, который реализуется за счет обратимых изменений нуклеотидных последовательностей генов ММР.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные данные расширяют представления об участии мутаторного фенотипа в развитии и адаптации популяций бактерий к условиям окружающей среды; отражают роль в этом процессе таких селективных факторов, как экспозиция с биоцидами и окислительный стресс.
Собрана коллекция природных штаммов, выделенных в пределах одного биотопа и характеризующихся вариациями уровней мутагенеза. Исследования позволили разработать программу сбора данных параметров функционирования гидротехнического комплекса, которая помогает понять вероятность и последствия образования биопленки в оборудовании для водоподготовки. На основании этой информации определяется стратегия мониторинга микробиологической коррозии, устранения специфических факторов, стимулирующих биопленкообразование и его распространение в водооборотных системах. Оценка, как микробиологической коррозии, так и интенсивности образования биопленки, определяет выбор схемы применения и дозировки биоцидов, позволяет повысить эффективность их действия в условиях постоянного контроля количественных и качественных параметров биоценоза.
Основные положения, выносимые на защиту
Условно-патогенные бактерии (биопленкообразующие грамположительные спорообразующие и грамотрицательные аэробные неферментирующие) доминируют в ряду культивируемых сапротрофных микроорганизмов исследуемого гидротехнического комплекса.
Пролонгированное и эпизодическое воздействие биоцидов, характерное для исследуемого биотопа, повышает общий резерв мутационной изменчивости в популяциях резидентных видов.
Гетерогенность популяций P. aeruginosa, Stenotrophomonas sp., Acinetobacter sp. и Bacillus sp. носит дискретный характер. В одном биотопе одновременно сосуществуют субпопуляции и варианты, отличающиеся сочетанием таких признаков, как частота мутаций и активность биопленкообразования.
4. Вариации уровней мутагенеза в изолятах P. aeruginosa вызваны временными хромосомными перестройками mufS и mufL.
Апробация работы и публикация
Материалы диссертации были представлены на IV Молодежной школе-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (г. Москва, 2008), и на Четвертой международной Конференции по биопленкам (г. Винчестер, Великобритания, 2010). Всего по теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе статья в журнале «Экологическая генетика».
Объем и структура диссертации
